実験室医学は過去20年間に大きな進歩を遂げました。 ウイルス量測定は、nested PCRアッセイから転写媒介増幅法、リアルタイムPCRへと進化し、デジタルPCRなどの手法で進化を続けている。 このような進歩により、より感度の高い、より広いダイナミックレンジのウイルス量測定が可能となり、医師は患者の治療に対する反応や疾患の進行についてより深く理解することができるようになりました。
分子診断学の進歩により患者管理が改善された一例として、HIV-1患者の管理があります。 現在の治療ガイドラインによると、治療成功はHIV-1 RNA濃度が75コピー/mL未満と定義されている1。治療失敗の定義は、グローバル、国別、国別ガイダンスによって異なるが、通常はHIV-1 RNA濃度が50～1000コピー/mLと定義される1-3。
これらの治療カットオフ値はリアルタイムPCR測定法の動的範囲の下端にあり、精度や再現性が問題となる可能性がある。 ウイルス負荷量測定の性能に影響を与える要因としては、自動化プラットフォーム、核酸抽出化学、PCRプライマー/プローブの選択とデザイン、PCR増幅条件、アッセイキャリブレーション戦略などが挙げられる。 ここでは、様々なデザインアプローチと、それらがアッセイの性能と臨床結果に及ぼす可能性のある影響について概説する。 (図1）
抽出プロセス
抽出化学を選択する際には、サンプルの種類と分析対象物を慎重に考慮する必要がある。 例えば、HIV-1の場合、保健社会福祉省（DHHS）はHIV-1 RNAをHIV-1ウイルス血症のマーカーとして使用するよう勧告している1
HIV-1 RNAとプロウイルスDNAの区別は重要で、後者は活発なウイルス複製のマーカーではなく、すでに細胞に組み込まれたウイルスからの潜伏リザーバーの放出であるためだ。 HIV-1 RNAとプロウイルスDNAの両方を精製する抽出化学は、医師に対して真のウイルス複製の正確な表現を提供しない。したがって、このウイルスの例では、下流の定量からプロウイルスDNAを除外するために、HIV-1 RNAを特異的に精製する抽出化学のみを使用する必要がある。
あるいは、HIV-1の定量に総核酸（TNA）抽出化学を使用すると、潜在的に偽陽性結果または不正確な定量につながり、患者管理に悪影響を与える可能性がある。 7141>
ターゲット選択
HIV、HBV、HCVの菌株の間で見られる極めて多様なウイルスは、分子診断（MDx）検査で、サンプルに存在する菌株にかかわらず正しい結果を確実に出すために最も重要なことである。
この懸念に対処するために、最適なアッセイデザインは、ウイルスの多様性が最も影響を及ぼさない、遺伝的に保守的な領域におけるプライマー/プローブターゲットの選択から始める必要がある。 遺伝的に保存性の高い領域は、多様なウイルス株からの配列を比較することによってのみ決定される。
Probe design and PCR cycling conditions
標的領域の選択に加えて、プローブデザインとPCRサイクリング条件は、正確なウイルス量の定量を目指す上で非常に重要である。 プローブの設計は、自然に発生する多型、ひいては与えられた標的領域内で発生する可能性のあるミスマッチに対して寛容であることが必要である。 時が経つにつれ、プローブ技術もPCR手法と同様に進化してきました。 PCR技術に基づくMDxアプリケーションはウイルスの定量以外にも幅広く、様々なプローブデザインを利用する必要がある。 マイナーグルーブ結合プローブは、一般的にジェノタイピングや一塩基多型の検出に使用されています。
TaqMan プローブは、標的領域が高度に保存されているアッセイでよく使用される。 部分二本鎖プローブは、主にプローブの長さや結合条件による遺伝的異質性の高さを許容するのに優れており、異質性の高い領域で利用されている5。
プローブの設計に加えて、性能要件（潜在的なミスマッチへの耐性など）を達成するために、サイクリング条件も設計の最適化の対象となることが多い。 この方法は、プライマーのミスマッチがサンプルの定量に与える悪影響を軽減する。 希少な多型の重大な影響を避けることが困難な場合、第二のターゲットの検出をアッセイデザインに組み込むことができる。 配列の多様性がウイルスゲノムの1つの領域の検出に影響を与える場合、第2の領域の検出は正確な結果を得ることを保証する。 分子アッセイの複雑さとウイルスの多様性を考慮すると、分子アッセイを設計する際には、グローバルサーベイランスと標的特異的プローブ設計を活用した包括的アプローチを検討する必要がある。 デュアルターゲットのような1つの戦略を採用するだけでは、誤った安心感を与えてしまう可能性がある。
Calibration strategy
Calibration strategyは分子アッセイ設計に不可欠な要素であり、広いダイナミックレンジで再現性を確保するために重要である。 現在、治療管理のための定量的手法のほとんどは、分析物の濃度を決定するために外部の検量線を使用しています。
これらのアッセイでは、患者サンプルの分析物シグナルを濃度既知のサンプル群と比較し、単純な線形回帰（y=mx+b）を使用してウイルス量を計算します。 この方法では、通常、プロセス全体を通じて患者の検体として処理される校正物質を使用するため、抽出と増幅の両方の試薬と装置の校正が可能になります。
あるいは、抽出処理を行わない校正物質を使用することもできますが、この方法では、回収率の差または試薬組成の変化が説明されず、定量に差が生じる可能性があるというリスクがあります。
また、あまり使われない方法として、内部定量標準があります。 このアプリケーションでは、直線性からの差の最大許容値を設定し、直線範囲全体で3次の多項式回帰線（y = ax3 + bx2 + cx + d）を使用します。 以前の研究では、いくつかのアッセイの直線性からの許容差は±0.2 Log10であることが示唆されています。6 この直線性からの許容差とキャリブレーションアプローチは、しばしば臨床判断がなされるダイナミックレンジの下限で大きな不正確さと同様に、方法論間で観察されるバイアスも説明します。 不正確なウイルス量の結果は不適切な管理を招き、患者は失敗した治療法のまま放置されるかもしれない。 この誤診は、耐性ウイルス株の伝播の増加にもつながるため、一人の患者の管理よりもはるかに広い意味を持っている。 治療管理の観点からは、耐性に関連する変異を持つウイルスは、より狭い治療選択肢で治療することがより困難となります。 さらに、偽陽性率は、再検査やより高価な耐性検査に不必要なコストをかけることになり、患者や医師にとっても不安材料となる。
- Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in Adults and Adolescents with HIV developed by Department of Health and Human Services（保健福祉省が策定した成人および青年期のHIV患者における抗レトロウイルス薬の使用に関するガイドライン）。 https://aidsinfo.nih.gov/guidelines). Accessed September 2019.
- European AIDS Clinical Society (EACS). EACS Guidelines Version 9.1 October 2018.
- National Department of Health, South Africa, April 2015, accessed August 2, 2017.EACSは、南アフリカ共和国保健省のガイドラインです。 https://aidsfree.usaid.gov/sites/default/files/tx_south-africa_pmtct_2015.pdf.
- Brennan CA, Bodelle P, Coffey R, et al. HIV global surveillance: foundation for retroviral discovery and assay development（HIVグローバルサーベイランス：レトロウイルス発見とアッセイ開発のための基礎）。 ジャーナル・オブ・メディカル・ヴァイロロジー。 2006;78 Suppl 1:S24-29.
- Luk KC、Devare SG、Hackett JR、Jr. 遺伝子多型を高感度に検出するための部分二本鎖直鎖DNAプローブ：新規デザイン。 ジャーナル・オブ・ヴァイロジカル・メソッド。 2007;144(1-2):1-11.
- Vermehren J, Colucci G, Gohl P, et al. Genotype包含性を改善したC型肝炎ウイルス定量検査コバスアンプリプリ/コバスTAQMAN第2版開発。 Journal of Clinical Microbiology. 2011;49(9):3309-3315.
Acknowledgement: 本論文の査読をしていただいたMary Rodgers氏とShihai Huang氏に謝意を表するとともに、感謝の意を表したい。