1はじめに
肝硬変の臨床経過において出血はしばしば合併する。 最も頻度が高く、生命を脅かす可能性のある出血部位は消化管である。 胃食道静脈瘤や門脈圧亢進性胃炎など様々な病変、あるいは食道炎、Mallory-Weiss裂傷、消化性潰瘍疾患など一般に見られる病変から生じる可能性がある。 消化管出血による死亡率は高く、初発の静脈瘤出血の30％が致死的です。 肝硬変の患者は、あざ、紫斑、鼻出血、歯肉出血、月経痛、肝生検などの侵襲的処置に伴う出血など、皮膚や粘膜に関連した出血も経験することがあります。 長い間、このような出血リスクの増加は、肝硬変患者における後天性止血障害と関係があると考えられてきた。 実際、肝臓は第VIII因子を除くほとんどすべての凝固因子を合成しています。 プロトロンビン時間（PT）や活性化部分トロンボプラスチン（aPTT）のようなグローバルな凝固活性化を探る従来の臨床検査の異常は、凝固因子の合成の減少が原因だと考えられてきました。 しかし、PTやaPTTの延長にもかかわらず、肝生検やその他の出血の可能性のある処置を行っても、多くの肝硬変患者が出血を経験しないことが指摘されている。 さらに、肝硬変患者の中には、従来の臨床検査値が異常であるにもかかわらず、血栓塞栓症を発症している患者もいます。 これまでのところ，肝硬変患者の出血リスクに対する凝固障害の影響について検討した研究は少ない。
本研究は，出血を伴う肝硬変患者と伴わない肝硬変患者の止血バランスを対照群と比較して検討することにより，肝硬変患者の止血障害と出血リスクの関係を評価することを目的とする。
2材料と方法
本研究は世界医師会ヘルシンキ宣言に基づき実施し，地元の倫理委員会の承認を得た。 365＞2.1患者集団と研究デザイン＜8938＞肝硬変患者51名を症例群とし、年齢と性別をマッチさせた健常対照者50名を横断的研究に参加させた。 出血エピソード，肝硬変の特徴，投薬に関するデータは医療記録から抽出した。 肝硬変の重症度はChild Turcotte Pughスコアによって推定された． 組み入れ前後2カ月以内に出血があった患者を特定した。 これらの患者それぞれについて、出血の部位と重症度が決定された。 輸血を必要とする、または必要としない脱血（ヘモグロビンの2g/dl以上の低下）を伴う出血を経験した患者は、重度出血とみなした。 除外基準は，肝細胞癌やその他の悪性腫瘍，細菌感染，慢性炎症性疾患，ネフローゼ症候群，腎不全，既知の遺伝性凝固異常，抗凝固薬や抗血小板薬の使用であった． 患者さんは2群に分けられました。 (H+)群は出血を経験した患者、(H-)群は経験しなかった患者である。
2.2血液採取
血液サンプルは静脈穿刺により、抗凝固剤として3.2%のクエン酸ナトリウムを含むプラスチックチューブに抗凝固剤/血液の割合で採取された。 2500×g、15分間の二重血液遠心分離の後、貧血血漿（PPP）を得た。 2.3実験室検査2.3.1従来の実験室検査
プロトロンビン時間（PT）と活性化部分トロンボプラスチン時間（aPTT）は、それぞれヒトトロンボプラスチン（neoplastin、STAGO）および自動APTT試薬（APTT、STAGO）で測定された。 フィブリノゲンは（STA fibrinogen, STAGO）で測定しました。
2.3.2プロおよび抗凝固因子
プロおよび抗凝固因子活性は、STAGO試薬を用いて機能活性として測定されました。 第VIII因子活性および第XII因子活性は、標準的なaPTTベースの凝固アッセイ（それぞれDEFICIENT VIIIおよびIMMUNODEF XIIを使用）を用いて測定されました。 VII因子、V因子およびII因子の活性はPTベースの凝固アッセイで測定しました（それぞれDEFICIENT VII、DEFICIENT V、IMMUNODEF IIを使用します）。 プロテインC（PC）およびプロテインS（PS）活性は、クロッティングアッセイ（STACLOT PCおよびSTACLOT PS）を使用して測定した。 Antithrombin（AT）活性はクロモジェニックアッセイ（STACHROM AT）を用いて測定した。 すべての検査は、STA COMPACT MAX（STAGO; Asnières France）で実施した。 血小板数は血液分析装置（SYSMEX XT 2000i; Cobe, Japan）で行った。
2.3.3Thrombin generation
Thrombin generation (TG) は較正済み自動トロンビン法（thrombiniscope-Thrmosystem）により測定された。 組織因子1pmol/Lとリン脂質（PPP試薬low-STAGO）を添加したPPPにおいて、protein C activator（PROTAC、STACLOT PC STAGO）非存在下と存在下の2段階に分けて凝固を誘発させた。 生成されたトロンビンの経時的な記録は、蛍光性基質（FLUCAT, STAGO）を用いて実施した。 TGはnmol×minで内因性トロンビン電位（ETP）として表した。
2.3.4Hemostatic balance
HemostaticバランスはPCアクチベーターあり／なしでプロコア-抗凝固因子比およびETP比により評価した。
2.4統計解析
データの解析には社会科学統計パッケージ（SPSS）ソフトウェアVer 21.0 (IBM Corp. Armonk。 New York, USA) が使用された。 データは平均値とパーセンテージでまとめた。 研究グループは、質的変数についてχ2検定を用いて比較した。 パラメトリックデータの解析にはStudentのt検定とANOVA検定を用いた。 ノンパラメトリックデータの解析にはMann-Whitney U検定とKruskal-Wallis H検定を用いた。p値が0.05以下を有意とした。 肝硬変の診断時の平均年齢は55歳（6～88歳）であった。 男性24名，女性27名であった。 肝硬変の主な病因はウイルス性肝炎（64.7％）であった。 Child-Pughスコアによる分類は，Aクラスが14例（27.5％），Bクラスが22例（43.2％），Cクラスが15例（29.3％）であった． (H+）群は9名（17.6％）であった。 出血エピソードは、静脈瘤出血（n=6）、胃潰瘍（n=1）および十二指腸潰瘍（n=1）に続発する消化管出血と歯肉出血（n=1）であった。 出血の程度は6人が軽度から中等度、3人が重度と判定された。 両群とも年齢、性別、Child-Pughスコアは同等であった。
当然ながら、対照群に関しては、組み入れ前後2ヶ月以内に出血エピソードはなかった。 血小板数は（H+）の方が（H-）より有意に少なかった（p=0.01）（表1）。
臨床検査値に関する患者群間比較
| Parameters | H+ | H- | p-Value |
|---|---|---|---|
| Platelet count (/mm3) | 62.0.0,888±33,650 | 110,317±70,483 | 0.01a |
| PT (%) | 52.7±10.8 | 62±21.3 | 0.1 |
| aPTT (ratio) | 1.40±0.0.3 | 1.26±0.3 | 0.16 |
| Fibrinogen (g/L) | 2.12±0.6 | 2.6±0.9 | 0.21 |
H+: 出血を経験した肝硬変患者、H-: 出血を経験しなかった肝硬変患者、PT：プロトロンビン時間、aPTT：活性化部分トロンボプラスチン。
p0.05.
3.2 プロ凝固・抗凝固因子
プロおよび抗凝固因子の平均レベルは、出血エピソード（H+）の経験者ではコントロールよりも有意に低値であった． しかし，第VIII因子は肝硬変患者において対照群より有意に高かった（166％ vs 94.5％，p＝0.045）。 表2.5377＞＜9242＞＜9242＞＜8938＞凝固促進因子および凝固抑制因子に関する患者群および対照群の比較。
| パラメータ | H+ | コントロール | p値a | H- | p- |
H+: 出血を経験した肝硬変患者、H-: 出血を経験しなかった肝硬変患者。 a
(H+) group vs. controls. b
(H+) vs. (H+) group vs. Controls. (H＋)群 vs. (H＋) group vs. (H＋) group vs. (H＋) group. (H＋) group. (H＋) group. (H-）群。 3.3Thrombin generation PC活性化剤なしのETP平均値に関しては（H+）患者と対照群に有意差はなかった（それぞれ716.1対811nmol×min；p=0.5）。 PCアクチベーター存在下では、（H+）患者のETPは対照群よりも驚くほど高かった（725 vs. 387nmol×min、p=0.05）。 しかし、PCアクチベーターありなしのETPに関しては、患者群間で有意差は見られなかった。 3.4止血バランス3.4.1凝固促進因子と抗凝固因子の比率 コントロールと比較して、VIII/抗凝固因子（VIII/PC、VIII/PS、VIII/AT）、VII/PC、XII/PCは（H＋）患者で有意に高値を示しました。 その他の比率はほぼ同じであった。 出血を経験した患者（H+）とそうでない患者（H-）のすべての比率に関して、有意差は認められなかった（表3）。
PS:protein S; PC:protein C; AT:antithrombin.P; 0.922 |
1.
|
a
(H+) group vs. (コントロール)。 b
(H+) group vs. (H-) group。 c
p0.05. 3.4.2ETP ratio PC activatorを使用した/使用しないETP ratioは、コントロールに比べて（H+）患者で有意に高くなった（0.97 vs. 0.51; p=0.017）（図1A）。 
Fig.1.
（H+）患者とコントロールのETP比の比較（A），（H+）患者と（H-）患者の比較（B）。 H+：出血を経験した肝硬変患者、H-：出血を経験しなかった肝硬変患者、ETP：内因性トロンビン電位 (0.06MB).
しかし、ETP比に関しては患者群間で有意差はなかった(図1B)。 4考察 今回の研究では、出血イベントを経験した肝硬変患者においても、凝固促進因子と抗凝固因子の比率、PCアクチベーター有無のETP比率で評価した止血バランスは、高凝固性状態に有利に働くことが示されました。 また，両群を比較すると，出血を経験した肝硬変患者は，経験しなかった肝硬変患者とほぼ同量のトロンビンを生成していた． しかし，本研究の主な限界は，出血を経験した肝硬変患者の数が少ないことである。 肝硬変患者，すなわち進行した肝疾患の患者における出血傾向は，多くの臨床観察によって裏付けられていた。 このような患者における最も関連性の高い出血現象は、食道静脈瘤の破裂と門脈圧亢進性胃腸症に起因するものである。 出血は消化性潰瘍、鼻出血、歯肉出血、打撲、侵襲的処置など、一般に見られる病変からも起こりうるものである。 歴史的に、PTやaPTTの延長といった肝不全による止血異常は、肝硬変患者に頻繁に起こる出血障害を反映していると考えられてきました。 そのため、肝生検など出血の可能性がある処置の前に新鮮凍結血漿を用いてPTを補正することが多かった。 今回の研究では、PTとaPTTの平均値に関して、出血を経験した患者とそうでない患者で有意差はなかった。 我々の結果は，先天性凝固異常症と比較して後天性凝固異常症では，これらの従来の検査が出血の予測に適していないことを示唆する多くの論文と一致しています。 実際、Segalらは、PTの延長が侵襲的診断処置中の出血を予測できると結論づける根拠を見いだせませんでした。 さらに、Tripodi は、逆説的ではあるが、PT がほぼ正常な肝硬変患者は出血することがあるが、PT が比較的異常な患者は出血しないのが一般的であることを指摘した 。 この出血予知能力の欠如は、PTが抗凝固活性（PC, PS, AT）ではなく、凝固促進活性のみを反映しているという事実によって最もよく説明できる。 肝硬変では凝固促進因子と抗凝固因子の両方が低下しているため、PTとaPTTは凝固促進因子と抗凝固因子のバランスを表すことができないのです。 この結果は，吐血や下血を経験した肝硬変患者の血小板数が，出血を経験しなかった患者よりも有意に低かったEl Boklらの結果と一致した（p 0.0001）。 これらの知見は，慢性肝疾患患者の血小板に影響を及ぼす可能性のある複数の量的および質的変化によって支持され得る． 門脈圧亢進症による脾臓への血小板封鎖の増加や、肝疾患によるトロンボポエチン産生の低下が、肝硬変患者における血小板減少の主な機序である ………といった具合に、肝硬変患者の血小板減少症は、その原因として挙げられる。 また、肝硬変患者では、血小板の接着、凝集、トロンビン産生能が低下しているため、血小板機能の低下も認められています。 これらの知見は、血小板数3が侵襲的処置に関連した出血のリスクを有意に増加させることを示すいくつかの臨床的観察によって裏付けられた。 したがって、血小板数は出血リスクを評価する上で、他の止血のための従来の検査（TPやaPTT）よりも信頼性が高いと思われます。 肝硬変患者における予防的輸血のための血小板数の閾値を決定する前向き研究はありませんが、肝生検に関するAASLDガイドラインでは、肝生検前に血小板数3（クラスIレベルC）に対して輸血を考慮することが推奨されています。 しかし，Siddiquiらは肝硬変患者においてフィブリノゲン値の低下と消化管出血に有意な相関を認めた（RR=1.47；95％CI，0.64-3.35）. 実際，フィブリノゲンはフィブリンの前駆体と血小板凝集の仲介役として働いており，高度肝硬変患者で頻繁に見られる低フィブリノゲン血症は出血リスクを高めると考えられる.。 フィブリノゲン値が1g/L以下の場合、出血の危険性が特に高くなると考えられています。 本研究では、出血した肝硬変患者において、凝固促進因子（II、V、VII、XII）および抗凝固因子（PC、PS、AT）が対照群と比較して有意に低下していることが示されました。 しかし，FVIIIは前者で著明に増加していた． また，肝硬変患者の出血や血栓の有無にかかわらず，いくつかの先行研究でも我々の結果と一致した． また，El BoklらはFVIII値に関しても両群間に有意差を認めなかった． しかし、逆説的ですが、出血を経験した肝硬変患者では、そうでない患者に比べてPCが有意に低い値でした（36.4％ vs. 65％、p=0.018）。 これらの結果から，肝硬変患者における出血事象は，血漿中の凝固因子レベルとは無関係であることが示唆された。 実際、無作為化比較試験で、静脈瘤や肝切除時の出血抑制に遺伝子組換え活性化第VII因子輸液が有効であることを示す証拠が得られています。 本研究では、止血バランスに関して、VIII／抗凝固因子（VIII／PC、VIII／PS、VIII／AT）、VII／PC、XII／PCは（H＋）患者で対照群と比較して著しく高値を示していました。 その他の比率は、（H+）患者と対照群でほぼ同じレベルであった。 同様に、これまでの研究で、肝硬変患者では、血液凝固促進因子と血液凝固阻止因子の比率（II/PC、V/PC、VIII/PC、VIII/AT）が対照群より有意に高いことが示されている。 しかし、El Boklらは、出血イベントを起こした肝硬変患者では、そうでない患者よりもFVIII/PCが有意に高いことを逆説的に示した。 本研究で評価したトロンビン生成に関しては、対照群と患者群で差はなかった。 PC活性化後、ETP比は（H＋）患者で対照群と比較して有意に高かった（p=0.017）。 これらの結果は、肝硬変患者における活性化PCの抗凝固作用に対する抵抗性の状態を示唆するTripodiらの結果と一致した 。 この「凝固能亢進状態」は，肝硬変患者において出血に対する防御効果を持つ可能性さえある． また，ETP比は両群間で統計学的有意差に達しなかった。 この知見は，肝硬変患者で発見された凝固障害が出血の予測因子であるとする従来の考え方に反する新たな論拠を与えるものである。 肝硬変患者の静脈瘤出血の危険因子として、進行した肝疾患、大きな静脈瘤、静脈瘤壁の緊張および赤色ウェールマークの存在が報告されています。 内皮機能障害、細菌感染、腎不全も消化管出血の原因となる可能性があります。 結論として、慢性肝疾患の患者では、ビタミンKの欠乏が上記の凝固障害に関与する主要な要因の一つであることは注目に値します。 実際、ビタミンKの欠乏は、凝固因子の合成を低下させるだけでなく、機能的に不活性なこれらのタンパク質のカルボキシル化不足の前駆体を生成させることもあります。 これらのタンパク質は、ビタミンK欠乏によって誘導されるタンパク質（PIVKA）として知られており、例えば、肝硬変患者の肝細胞癌細胞から分泌されることが示されている低カルボキシル化プロトロンビン（PIVK-II）などがそうである 。 このような患者にビタミンKを投与しても凝固障害は改善されないという先行研究がありますが、アンダーカルボキシル化プロトロンビンの感受性に関するデータはまだ一致していません . したがって、肝硬変患者では、肝細胞癌の早期診断に関与するカルボキシル化未満プロトロンビン値の著しい低下を防ぐために、ビタミンKを投与しないことが賢明であろうと推測されます。 結論として、今回の結果は（H+）患者の数が少ないため慎重に解釈する必要があるが、PTやaPTTの延長などの従来の臨床検査の異常は肝硬変患者の出血リスクと相関しないという概念を支持するものであると考えられる。 しかし、血小板数はPTやaPTTよりも出血の予測因子として優れているようである。 出血を経験した肝硬変患者においても，止血バランスは凝固亢進状態に移行している． このような患者における消化管出血は，主に門脈圧亢進症による血行動態であると推察される． 今後，線溶系を考慮した研究が必要である． 実際，肝硬変患者の出血の原因として線溶系亢進が報告された例もあるが，この概念にはまだ異論がある．略語ETP 内因性トロンビン電位 PC プロテインC PT プロトロンビン時間 aPTT 活性化部分トロンボプラスチン PPP 貧血血小板 PS プロテイン S AT アンチトロンビン TG トロンビン生成 著作権譲渡 Fundación Clínica Médica Sur (FCMS) が私の投稿を検討し編集する措置を取ることを考慮し、以下のとおり著作権を譲渡する。 以下に署名した著者は、連帯して、ここに、現在または今後知られるあらゆる形式および媒体におけるあらゆる著作権を含む、そのすべての権利、権原および利益をFCMSに譲渡、移転、および割り当てるものとします。 著者は、当財団に適切な著作権表示がなされることを条件に、本論文の全部または一部を将来の自らの著作物において非独占的に使用する権利を保持する。 FCMSが前述の投稿を公表しない場合、FCMSはその権利を放棄することに同意します（注：連邦政府の職員が公務で作成したものは、著作権で保護されない場合があります）。 365＞著者責任＜8938＞私、以下に署名した著者は、知的内容、データの分析（該当する場合）、および記事の執筆に十分参加し、それに対して公的責任を負うことを証明する。 私は、本論文の最終版を確認し、それが有効な仕事であると確信し、掲載を承認します。 私は、本論文の著者として、本論文の内容が過去に発表されたものではないこと、他の原稿に含まれていること、または現在他の場所で発表が検討されているものではないことを証明します。 また、本論文は他で出版が認められておらず、本論文のいかなる権利または利益も第三者に譲渡されていないことを証明する。 財務公開 私、以下に署名する著者は、投稿論文に関連して利害の対立をもたらす可能性のある商業的関連（例：コンサルタント、株式所有、出資、特許ライセンス契約）がないことを保証する。 この研究は、公的、商業的、または非営利セクターの資金提供機関から特定の助成金を受け取っていない。 Institutional Review Board/Animal Care Committee Approval 私、以下に署名する著者は、私の所属機関が、ヒトまたは動物を含むあらゆる調査のプロトコルを承認し、すべての実験が研究の倫理および人道的原則に準拠して行われたことを証明する。 Hela Baccoucheが生物学的試験を実施した。 Asma LabidiとHela Baccoucheがデータを分析した。 Asma labidiはHela Baccoucheの支援を受け、原稿を執筆した。 全著者が結果を議論し、最終原稿に貢献した。 利益相反 なし。 インフォームドコンセント 全患者が症例詳細の公表にインフォームドコンセントを行った。 |
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