コロナウイルスは過去20年間にSARSと中東呼吸器症候群（MERS）という二つの大規模パンデミックを引き起こした8，9． 主にコウモリに存在するSARSr-CoVは、将来的に病気の大流行を引き起こす可能性があると一般的に考えられている10,11。 今回、我々は、中国中央部の湖北省武漢市で発生した未確認の肺炎疾患による一連の症例について報告する。 この疾患は、地元の海産物市場から発生し、202012年1月26日現在、中国国内で2761人が感染、80人が死亡し、さらに10カ国で33人が感染するまでに大きく拡大しました。 これらの患者の典型的な臨床症状は、発熱、乾いた咳、呼吸困難（dyspnoea）、頭痛および肺炎です。 発症すると、胸部CT（コンピュータ断層撮影）画像による肺胞損傷により呼吸不全が進行し、死に至ることもあります。 本症は、体温の上昇、リンパ球および白血球の減少（白血球は正常値を示すこともある）、胸部X線写真における新しい肺浸潤、3日間の抗生物質治療後も明らかな改善が見られないなどの臨床症状から、臨床医がウイルス性肺炎と判断したものであった。 初期の患者のほとんどは、元の水産物市場との接触歴があったようですが、現在ではヒトからヒトへの接触によって感染するまでに進行しています。
発生初期に武漢金銀壇病院の集中治療室に入院した重症肺炎患者7名（うち6名は海鮮市場の販売員または配達員）の検体を武漢ウイルス研究所（WIV）の検査室に送り、原因病原体を診断した（拡張データ表1）。 CoVを研究している研究所として、我々はまず、SARS感染と同じ環境である冬と市場で発生したことを考慮し、pan-CoV PCRプライマーを用いてこれらの検体を検査した13。 その結果、5つの検体がCoVのPCR陽性であることが判明した。 気管支肺胞洗浄液（BALF）から採取した1検体（WIV04）については、次世代シーケンサーを用いたメタゲノム解析により、病因となりうる物質を同定した。 10,038,758個のリードのうち、ヒトゲノムからのリードをフィルタリングして残った1,582個のリードが、SARSr-CoVの配列に一致した（図1a）。 de novoアセンブリとターゲットPCRにより、SARS-CoV BJ01 (GenBank accession number AY278488.2) と79.6%の配列同一性を持つ29,891塩基対のCoVゲノムを取得した。 このゲノムに全リードを再マッピングすることにより、高いゲノムカバレッジが得られた(Extended Data Fig. 1)。 この配列はGISAID (https://www.gisaid.org/) に提出されている（アクセッション番号 EPI_ISL_402124）。 世界保健機関（WHO）が付けた名称に従い、我々はこれを新型コロナウイルス2019（2019-nCoV）と仮に呼ぶことにする。 その後、次世代シークエンスとPCRを用いて、さらに4人の患者から互いに99.9％以上同一の2019-nCoVの完全長ゲノム配列（WIV02、WIV05、WIV06、WIV07）（GISAIDアクセッション番号 EPI_ISL_402127-402130）を得た（拡張データ表2）。
a, 患者ICU06からのBALFの次世代シーケンスによるメタゲノム解析. b, 2019-nCoV WIV04 のゲノム構成. M、膜。c、2019-nCoV WIV04の全長ゲノム配列に基づく類似性プロット。 SARS-CoV BJ01、コウモリSARSr-CoV WIV1、コウモリコロナウイルスRaTG13およびZC45の全長ゲノム配列を参照配列として使用した。 MHVはマウス肝炎ウイルス、PEDVは豚流行性下痢症ウイルス、TGEVは豚伝染性胃腸炎ウイルス、スケールバーは塩基位置ごとの0.1置換を表す。 7233>
ウイルスゲノムはコロナウイルスに共通する6つの主要なオープンリーディングフレーム（ORF）とその他多数の付属遺伝子から構成されている（図1b）。 さらに分析したところ、2019-nCoV遺伝子の一部はSARS-CoVと80%以下の塩基配列同一性を有していた。 しかし、CoVの種分類に用いたORF1abの7つの保存されたレプリカーゼドメインのアミノ酸配列は、2019-nCoVとSARS-CoVで94.4%同一であり、この2つのウイルスは同一種であるSARSr-CoVに属することが示唆されました。
次に、雲南省のRhinolophus affinisから過去に検出されたコウモリコロナウイルス（BatCoV RaTG13）のRNA依存性RNAポリメラーゼ（RdRp）の短い領域が2019-nCoVと高い配列同一性を示すことを見いだした。 このRNAサンプルについて全長配列を決定した（GISAIDアクセッション番号EPI_ISL_402131）。 Simplot解析の結果、2019-nCoVはRaTG13とゲノム全体で高い類似性を示し（図1c）、全ゲノム配列の同一性は96.2％であった。 2019-nCoV、RaTG13、SARS-CoVおよび以前に報告されたコウモリSARSr-CoVのゲノム配列のアラインを使用して、2019-nCoVのゲノムに組換え事象の証拠は検出されませんでした。 全長ゲノムとRdRpおよびスパイク（S）の遺伝子配列の系統解析により、すべての配列について、RaTG13は2019-nCoVの最も近い親戚であり、それらは他のSARSr-CoVとは異なる系統を形成することが示された（図1dおよびExtended Data図2）。 S遺伝子によってコードされる受容体結合スパイクタンパク質は、他のCoVから高度に分岐しており（Extended Data Fig.2）、RaTG13に対する93.1%の塩基配列同一性を除いて、これまでに記述されたすべてのSARSr-CoVに対して75%未満の塩基配列同一性を示した（Extended Data Table 3）。 2019-nCoVとRaTG13のS遺伝子は、他のSARSr-CoVよりも長い。 2019-nCoVのS遺伝子の配列の大きな違いは、SARS-CoVの配列と比較して、N末端ドメインに3つの短い挿入があることと、受容体結合モチーフの主要残基のうち4つが変化していることである（Extended Data Fig 3）。 2019-nCoVのSタンパク質のN末端ドメインの挿入が、MERS-CoVのようにシアル酸結合活性を与えるかどうかは、さらに研究する必要がある。 RaTG13との系統的関係が近いことから，2019-nCoVがコウモリを起源とする可能性を示す証拠となる。
我々は，ゲノムの中で最も変動が大きいS遺伝子の受容体結合ドメインの配列をもとに，qPCRに基づく検出方法を迅速に開発した（図1c）。 このプライマーは、SARS-CoVと95％の同一性を持つコウモリSARSr-CoV WIV1を含む他のすべてのヒトコロナウイルスと2019-nCoVを区別できることを示す（Extended Data Fig.4a, b）。 7人の患者から得られたサンプルのうち、6つのBALFと5つの口腔スワブサンプルは、qPCRと従来のPCRで評価すると、最初のサンプリング中に2019-nCoVに陽性であることがわかった。 しかし、2回目のサンプリング時にこれらの患者から採取した口腔スワブ、肛門スワブ、血液サンプルでは、もはやウイルス陽性サンプルを検出することはできませんでした（図2a）。 しかし，2019-nCoVのルーチン検出には，RdRpまたはエンベロープ（E）遺伝子を含む他のqPCR標的を使用することを推奨する． これらの知見に基づき、我々は本疾患が空気感染によって伝播する可能性を提案するが、より多くの患者を含むさらなる調査が必要であるため、他の可能な感染経路を排除することはできない。
a, 7人の患者での2019-nCoVの分子検出結果。 患者情報は、拡張データ表1、2に記載されている。 検出方法は、Methodsに記載。 AS、肛門スワブ、OS、口腔スワブ。 b、2019年12月23日に疾患の兆候を示した1人の患者（ICU-06）における2019-nCoV抗体レベルの動態。 OD比、450-630nmの光学密度。 右のY軸はIgM、左のY軸はIgGのELISA OD比を示す。 c、5人の患者における2019-nCoV抗体の血清学的検査（拡張データ表2）。 アスタリスクは、2020年1月10日に患者ICU-06から収集したデータを示す。 b、c、カットオフは、健康な対照のレベルに従って、IgM分析では0.2まで、IgG分析では0.3までであった。
2019-nCoVの血清学的検出のために、我々は、コウモリSARSr-CoV Rp3から以前に開発したヌクレオキャプシド（N）タンパク質を、このタンパク質が2019-nCoVのNタンパク質と92％のアミノ酸同一性を共有していたため、IgGおよびIgM酵素結合免疫吸着測定法（ELISAs）の抗原として用いた（拡張データFig. 5）、SARSr-CoV7を除く他のヒトコロナウイルスに対して交差反応性を示さなかった。 ウイルス感染患者7名から5名の血清検体しか得られなかった。 1人の患者（ICU-06）について，発症から7，8，9，18日後にウイルス抗体価をモニターした（Extended Data Table 2）． IgGとIgMの力価には明確な傾向が認められ、最後のサンプルでIgM力価が低下したことを除いて、時間とともに上昇した（図2b）。 2番目の解析として、発症から20日前後のウイルス陽性患者7人のうち5人の検体について、ウイルス抗体の有無を調べた（拡張データ表1、表2）。 その結果、すべての患者検体（健常者の検体は含まず）がウイルスIgGに強く陽性であった（図2b）。 7233>
次に、患者ICU-06のBALFサンプルを用いて、Vero E6およびHuh7細胞の両方からウイルス（2019-nCoV BetaCoV/Wuhan/WIV04/2019 と呼ぶ）を分離することに成功した。 3日間培養した後の細胞で、明確な細胞病原性作用が観察された（拡張データ図6a、b）。 WIV04株の同一性は、Vero E6細胞において、交差反応性ウイルスN抗体を用いた免疫蛍光顕微鏡検査により確認され（Extended Data Fig.6c, d）、メタゲノム配列決定により、そのリードのほとんどが2019-nCoVにマッピングされ、qPCR解析により、ウイルス量が1日後から3日後まで増加した（Extended Data Fig.6e, f）。 感染細胞の超薄切片中のウイルス粒子は、電子顕微鏡で可視化したように、典型的なコロナウイルス形態を示した（Extended Data 図6g）。 ウイルスIgG陽性サンプルの中和活性をさらに確認するために、IgG陽性の5人の患者血清を用いて、Vero E6細胞で血清中和アッセイを行った。 その結果、すべての試料が1:40〜1:80の希釈で100 TCID50（50%組織培養感染量）の2019-nCoVを中和できることが実証された。 我々はまた、このウイルスが1:40の希釈でウマ抗SARS-CoV血清（L.-F. Wangからの贈り物）によって交差中和できることを示すが、SARS-CoV抗体との交差反応の可能性は、ヒトの抗SARS-CoV血清で確認する必要がある（拡張データ表4）
ACE2 は SARS-CoV14 の細胞受容体となることが既知である。 2019-nCoVもACE2を細胞侵入受容体として利用しているかどうかを調べるため、ヒト、チャイロカブト、ハクビシン、ブタ、マウスのACE2タンパク質を発現するHeLa細胞または発現しない細胞を用いてウイルス感染性試験を実施した。 その結果、2019-nCoVはマウスACE2を除くすべてのACE2タンパク質を侵入受容体としてACE2発現細胞に侵入できるが、ACE2を発現していない細胞には侵入できないことから、2019-nCoVがACE2を介して細胞に侵入する細胞受容体であると考えられることがわかった（図3）。 また、2019-nCoVはアミノペプチダーゼN（APN）やジペプチジルペプチダーゼ4（DPP4）などの他のコロナウイルス受容体を使用しないことも示した（拡張データ図7）
ACE2を発現した又は発現しない（トランスフェクトしていない）HeLa細胞におけるウイルス感染性の決定.
。 Sタグ付きACE2プラスミドの発現は、マウス抗Sタグモノクローナル抗体を用いて検出した。 hACE2、ヒトACE2；bACE2、Rhinolophus sinicus（コウモリ）のACE2；cACE2、シベットACE2；sACE2、豚ACE2（ブタ）；mACE2、マウスACE2。 緑：ACE2、赤：ウイルスタンパク質（N）、青：DAPI（核）。 スケールバー、10μm.
本研究は、中国などで流行中の急性呼吸器症候群の原因物質と考えられる2019-nCoVについて詳細な報告を行うものである。 ウイルス特異的なヌクレオチド陽性およびウイルスタンパク質のセロコンバージョンが検査したすべての患者で観察され、本疾患とこのウイルスの存在との関連性を示す証拠を提供するものである。 しかし、まだ多くの緊急の疑問が残されています。 2019-nCoVと本疾患の関連性は、微生物と疾患の因果関係を確立するためのコッホの仮定を満たすための動物実験によって検証されていない。 このウイルスの宿主間の感染ルーチンはまだわかっていない。 このウイルスはヒトの間で感染しやすくなっているようである。 このままウイルスが強毒化するような進化を遂げるかどうか、注意深く見守る必要があります。 特異的治療法の不足と2019-nCoVとSARS-CoVの関連性を考慮すると、SARS-CoVに対するいくつかの薬剤と前臨床ワクチンがこのウイルスの治療に使用される可能性がある。 最後に、SARSr-CoVが自然貯蔵庫で広く拡散していることを考慮すると、今後の研究では、より広い地域に対するこれらのウイルスの積極的な監視に焦点を当てる必要がある。 長期的には、このようなウイルス群によって引き起こされる将来の新興感染症に対する広域抗ウイルス薬やワクチンの準備が必要である。 そして何より、野生動物の家畜化や消費に対する厳しい規制を実施することが必要である。 この論文が受理された後、ICTVはこのウイルスをSARS-CoV-215とした。さらに、WHOはこのウイルスによる病気の正式名称をCOVID-1916と発表した。
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