Von Willebrand Factor, ADAMTS13, and Thrombotic Thrombocytopenic Purpura
VWF は染色体 12p13.31 上の 178 kb にわたり 52 エクソンを含む大きな遺伝子から合成されます 49。 この遺伝子によって産生されるメッセンジャーRNA（mRNA）は、22アミノ酸のシグナルペプチド、742アミノ酸のプロペプチド、および血漿中に見られるVWFの単量体構築ブロックを構成する2050アミノ酸の配列を含む2813アミノ酸のポリペプチドを規定している。 小胞体でシグナルペプチドが切断された後、プロペプチドを含む単量体は、分子のC末端に近いCys残基が関与する鎖間ジスルフィド結合を介して二量体に結合される。 この二量体はゴルジ装置に運ばれ、プロペプチドはD3ドメインの残基間の二量体間ジスルフィド結合を触媒し、両端にN末端を持つ二量体が頭から順に結合した長い多量体を得ることができる。 その後、プロペプチドはフリン様酵素によって切断され、得られたULVWFの大部分は貯蔵顆粒にパッケージされ、後に分泌が調節される。
VWFを合成することが知られているのは内皮細胞と巨核球の2種類の細胞のみである。 内皮細胞では、VWFはWeibel-Palade小体と呼ばれる顆粒に貯蔵され、血小板では、α-顆粒に貯蔵される。 血中のVWFの大部分は内皮由来である。 エピネフリン、デサミノバソプレシン（DDAVP）、ヒスタミン、トロンビン、志賀毒素、腫瘍壊死因子（TNF）-α、インターロイキン（IL）-8、IL-6（IL-6受容体と複合体）などの炎症性サイトカインなど多くの刺激により内皮VWFの放出が促されます。50 その他の薬剤も内皮のVWF放出を促すことがあり、TTPにおけるいくつかの誘発因子を示す手がかりになると思われます。 52 酸化剤は、ULVWFの分泌を誘導する能力があるだけでなく、VWFを酸化させて、ADAMTS1353で切断できないようにし、粘着性を高めることができます。
内皮細胞と血小板の両方は、正常血漿中の多量体よりも大きなVWF多量体を放出する(56)。 これらのULVWF多量体は、通常血漿中に見られるものよりもはるかに大きいだけでなく、接着性も高く、血小板VWF受容体の糖タンパク質Ib（GPIbα；GPIb-IX-V複合体の最大のポリペプチド）と自発的に結合し、調節因子リストセチンまたはボトロセチン存在下で血漿VWFのGPIbαとの結合で得られるよりも高い結合強度で結合することができる57。 57 このことは、生体内では、ULVWFがせん断応力のない、あるいは低い状態で血小板と結合できるのに対し、加工された血漿VWFが血小板と結合するには高いせん断応力に起因するアンフォールディングを必要とすることを意味する58。
新たに放出されたULVWFの一部は直接循環血液に入り、別の一部は内皮に付着したままであり、そこでULVWF多量体は自己会合して数百マイクロメートルから数ミリメートルの紐状になり、内皮表面に固定されたままになる59。表面結合型ULVWF紐は接着性が高く、自然に血小板に結合して内皮表面に「ビーズオンストリング」外観の血小板を飾る紐状に形成された。 生理的なせん断応力下では、ULVWFストリングはADAMTS13によって切断され、内皮表面から除去される。 さらに、VWFは、まだ十分に解明されていない処理によって、自発的に血小板と結合することができなくなる。 血小板で装飾されたULVWFストリングが、循環中のADAMTS13の濃度低下または欠如によって内皮表面に蓄積すると、微小血管血栓症が始まり、微小血管に血小板に富んだヒアルロン酸血栓が形成・蓄積される（TTPの特徴）
ULVWF stringsはVWF多量体の束からなり、それぞれのストリングはいくつかのアンカーサイトで内皮表面に固定化されている。 Ca2+とMg2+がない場合（あるいは低濃度の場合）、ULVWFストリングはP-セレクチンと結合して内皮表面に付着する60。 生理的濃度の二価陽イオンが存在する場合、ULVWFストリングはインテグリンαvβ3との相互作用を通して内皮表面に固定される61。他の分子がVWFストランドのこの固定に関与していることは間違いないが、まだ同定されていない。 Savageらは、せん断応力下、血小板の存在下で、液相のVWF多量体がコラーゲン表面に固定化されているVWF多量体と同型かつ可逆的に会合することを示した；自己会合したVWF多量体は、せん断応力で血小板付着を支持する62。 流動相のVWF多量体は、内皮表面に付着したULVWFストリングとも会合することができ63 、自己会合するためには、せん断応力によるVWF分子の部分展開64、65やリストセチンの結合によって促進される66。 せん断応力下では、液相のVWF多量体は、血小板表面のGPIbαとの相互作用を通じて、血小板に結合しているVWF多量体と会合することも可能です67。 血小板表面におけるVWFの自己会合能力は、血小板活性化の引き金となり、血小板凝集を促進し、血栓の成長を促進する可能性があります
VWFの自己会合能力は、フィブリン重合によって生じるものと同等かそれを上回る長さと厚さの鎖を作り出すことができます。 アゴニスト刺激によりVWFの分泌が誘導された合成微小血管では、血管壁から分泌されたVWFが集合して、特に分岐部やカーブで血管の内腔をまたぐことができるストランドを形成することができた68。 VWFがそのような巨大なサイズの鎖やケーブルを形成し、流れの道筋にそれらのケーブルを張る能力は、鎖が血小板を捕らえる機会を増やすだけでなく、赤血球を片岩に細断する能力を高める。
VWF 自己会合自体は、シアストレスだけでなくプラズマ因子によって制御されており、おそらくTTPエピソードの経過と重症度を変えることができる。 VWFの自己集合は、高密度リポタンパク質（HDL）およびHDLの主要タンパク質成分であるアポリプロテイン（Apo）A-Iによって抑制される。 両者とも内皮表面に固定化されたVWF線維の長さと太さを著しく減少させる。 これらの高接着構造への血小板の接着も、自己会合VWFの減少に比例して減少します。 ADAMTS13ノックアウトマウスのTMAモデルにおいても、HDLは高用量のヒトVWFの注入によって引き起こされる血小板減少症を著しく抑制した69。ApoA-IのVWF自己会合調節能と同様に、TTPおよび敗血症の患者における血漿濃度と高接着VWFレベルとは逆相関している。 2550>
VWF切断メタロプロテアーゼは、現在までに同定された18種類のADAMTS型酵素のうち、構造的に類似した13番目の酵素である16,17。 ADAMTS13は、N末端のリプリシン型メタロプロテアーゼドメイン（M）に続き、ディスインテグラインドメイン（D）、トロンボスポンジン-1様ドメイン（T）、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸配列を含むシステインに富むドメイン（C）、から構成され、N末端のリプリシンドメインとトロンボスポンジン-1様ドメイン（C）、からなる。 スペーサードメイン（S）、さらに7つのトロンボスポンジン-1様ドメイン（T2-8）、そして分子のC末端にある2つの非同一のCUBタイプドメイン（CUB1-2）（Fig. 24.2). CUBドメインは、補体サブコンポーネントC1r/C1s、胚性ウニタンパク質egf、骨形成タンパク質-1に類似したペプチド配列を持つ70 ADAMTS13は、Zn2+とCa2+を要求する19万ダルトンの糖タンパク質で、遺伝子は染色体9q34に存在し、肝臓の星状細胞で主に生産されている71, 72。 12,14-17,73-77 ヘパリン、クロロメチルケトン（例：フェニルアラニン-プロリン-アスパラギン酸クロロメチルケトン）、ヒルジン、その他の直接トロンビン阻害剤（DTI）で抗凝固した血漿も検査に十分であろう。 ADAMTS13によるVWFの切断は、VWF多量体のコンフォメーションを球状から開放型に変える力であるせん断応力によってもたらされるVWFのコンフォメーション変化に依存している79。 この構造変化により、VWF多量体内の一つ以上のA2ドメインが折りたたまれ、Tyr1605-Met1606ペプチド結合がADAMTS1379による切断や次亜塩素酸によるMet1606の酸化に曝されることになる54。 せん断力に加えて、糖鎖の付着によるA2ドメインの構造の変化80、A2ドメインの折りたたみを不安定にする2A型VWDのアミノ酸置換81、2B型VWD82の変異とリストセチンの結合83によっても、接近可能なコンフォメーションへの移行が促進される。 最近の証拠によると、ネイティブなADAMTS13分子では、C末端のT8-CUBドメインはN末端のMDTCSドメインと接触しており、この分子内相互作用により、VWF-78ペプチド基質に結合して切断するMDTCSドメインの能力が一部阻害されていることが判明した。 84,85 ADAMTS13がこのコンフォメーションに折り畳まれる能力は、T1とT2、T2とT3、T4とT5、T8とCUB1ドメインの間にある4つの推定リンカー配列によってもたらされる柔軟性によって促進されているようである86。 変異解析、結合研究、速度論的解析、合成ペプチド基質の使用に基づき、構造的に活性なADAMTS13とアンフォールドしたVWF A2ドメイン間の複数の相互作用部位が特定され、図 24.3 に模式的に描いたように分子ジッパーモデル87に要約されている。 多量体のVWFが臨界レベルのせん断応力にさらされると、まずA2ドメイン内のエキソサイトが露出する。 このエキソサイトは、切断部位のC末端65アミノ酸にあるGlu1660-Arg1668らせん領域を含み、高い親和性（KD〜10nM）でADAMTS13のスペーサードメインに結合する。88-90せん断応力は、A2ドメイン内のAsp1614（P9´サイト）または付近で第2の低親和性のエキソサイトを暴露し、これはADAMTS13の崩壊ドメイン内のArg349と相互作用している。これら2つの複合体は、ADAMTS13の相補的な領域と相互作用し、VWFのTyr1605-Met1606切断部位とADAMTS13のメタロプロテアーゼドメインの活性中心を位置づける。 これは、VWFのLeu1603（P3部位）とADAMTS13の相補的なLeu198、Leu232、L272（S3部位）、VWFのTyr1605（P1部位）とADAMTS13のLeu151、Val195（S1部位）、VWFのMet1606（P1部位）とADAMTS13のAsp252-Pro256（S1部位）が相互作用することで、この部位は、ADAMTS13のメタロプロテアーゼドメインの活性センターとなる。92 ファージディスプレイとランダム変異解析により、P3-P2’およびP11’（Ile1616）領域のアミノ酸も切断に重要であることが確認され、示されている93。
ULVWFの多量体分解の失敗は、家族性及び後天性の特発性TTPの原因、あるいはこれらの障害に対する個人の素因であると長い間疑われてきた（図24.4）11、94 この概念を確かめるために行われた重要な実験が1997年と1998年に報告されている。 12 酵素の阻害剤が検出されなかったため、この欠損はプロテアーゼの産生、生存、機能の異常によるものとされた。 翌年、より一般的な後天性特発性TTPの病態が解明されました。13-15 後天性特発性TTP患者では、急性期には血漿中ADAMTS13活性がほとんどありませんが、回復するとこの活性は正常に向かって増加します。 これらの研究における血漿アッセイは、生理的なものではな いが、それでも革新的で有益なものであった。 後天性特発性TTP患者のほとんどで、この酵素に対する免疫グロブリン(Ig)G自己抗体がプロテアーゼ活性の欠如を説明したと思われる。 後天性特発性TTPの急性期には、一部の患者の血漿サンプルでULVWF多量体が高感度アガロースゲル電気泳動法で検出されるが、回復後には検出されない。 12-15
家族性TTP患者のほとんどは、血漿が急性発作中か後に得られたかにかかわらず、血漿中のADAMTS13活性が通常の5%未満です(ただし、最近血漿注入を受けていないことが条件です)。 後天性特発性TTP患者のほとんどは、急性TTPエピソード中のみ、血漿中のADAMTS13活性が正常値の5%未満となる12。-TTP患者の血漿中のADAMTS13活性の深刻な欠損は、内皮細胞表面から出てくるULVWF多量体を切断できないことと相関している（図24.4参照）59。その結果、内皮細胞から分泌されたULVWF多量体はこれらの細胞に固定され、長いひも状に自己会合し59、血小板GPIbαと結合して通過する血小板を捕らえることができる（図24.5）。 血小板は、ULVWF多量体の切断後に循環する小さなVWF形態と自発的に結合しない）56。その後、成長する血小板凝集体にさらに血小板が加わり（活性化αIIbβ3によって凝集体に勧誘される）、血管を閉塞するところまで成長することができる（図24.4参照）。59,96 特発性TTPのほとんどの症例は、重度のADAMTS13欠損を示すが、現在利用可能なアッセイで測定すると、酵素活性が著しく欠損していないサブセットもある97。これは、利用可能なアッセイで検出できない抗体による酵素活性への干渉、VWFの切断に対する耐性（例：酸化的修飾による）53、または他の原因によるものかどうかはまだ明らかではない。 ADAMTS13 欠損は、後天性 TTP の診断を下すための感度も特異性もないこと（他の多くの疾患では ADAMTS13 活性が低下する）99 も強調されるべきです。
ULVWF 糸は、ADAMTS13 活動がない場合でも内皮細胞から剥離でき、血小板が付着して凝集すると、流体せん断応力が発生し、張力が増加することで機械的に切断される59。
家族性TTP患者では、血漿中のADAMTS13活性は、ADAMTS13遺伝子のホモ接合体または複合ヘテロ接合体変異の結果として、ほぼ常に欠如しているか著しく低下しています12、100、101。 家族性TTPの変異は、異なるドメインをコードする領域で、遺伝子全体に検出されている（図24.2参照）。 ADAMTS13活性の重度の先天性欠損の場合、TTPのエピソードは通常、乳児期または小児期に始まる。 しかし、患者によっては、明らかなTTPエピソードが何年も（例えば、最初の妊娠中に）発症しない場合もある102。 このことは、一部の患者ではADAMTS13の活性が残存しており、内皮細胞からのULVWFの放出がADAMTS13の処理能力を上回ったときにTTPの急性エピソードが引き起こされることを示唆している。 このようなことが定期的に起こる可能性がある例として、妊娠中が挙げられる。 この概念と一致して、先天性TTPの女性は、しばしば最初の妊娠中に診断されます。29 先天性TTPの新生児発症で、ADAMTS13活性が5％未満の乳児では、一過性または進行性の腎不全が、しばしばこの疾患の顕著な構成要素となります107。 これらの患者は、臨床的には、1960年にシュルマンら108と1978年にアップショー109によって報告された2人の患者に類似しており、したがって、この小児サブグループは、「アップショー・シュルマン症候群」と呼ばれることがある。
後天性TTP患者の多くにおいて、急性エピソード時には血漿ADAMTS13活性がないかひどく低下し、回復すると単一または反復エピソードから上昇します13。-15血漿中ADAMTS13活性を阻害するIgG自己抗体は、これらの患者の44%から94%で検出される。13-15,102,110,111これらの結果は、ADAMTS13欠損を伴う後天性特発性TTP患者の多くに、免疫調節における一過性または断続的に再発する欠陥が存在することを示しています。 血漿中ADAMTS13を阻害する抗体も、チクロピジンまたはクロピドグレル関連TTPの少数の患者で確認されている。34,112 ADAMTS13産生または生存における一過性の重度の欠陥が、この酵素に対する自己抗体が検出されない後天的TTP患者で生じるかどうかはまだ不明である。 あるいは、一部の患者で阻害性自己抗体が検出されないのは、現在使用されている検査システムの感度が低いことを反映している可能性もある。
ある研究では、後天性TTP患者25人のポリクローナル自己抗体によって認識されるADAMTS13エピトープを評価し、抗体標的には必ずシステインリッチ/スペーサドメイン（CS）配列が含まれており、3人の患者ではこの領域だけが抗体の標的になっていたことがわかった。 他の22人の自己抗体は、CSドメインとCUBドメイン（64％）、メタロプロテアーゼ／ディスインテグリン様／第一トロンボスポンジン-1様ドメイン（MDT）配列（56％）、第二から第八トロンボスポンジン-1様反復を含む領域（T2-8、28％）に反応した（図24.2参照）。 プロペプチド領域も20%の自己抗体によって同定された。113 プロペプチドの除去は活性型酵素の分泌には必要ないことを示している114 自己抗体は、ADAMTS13の活性を阻害し、その生存率を低下させる。 7人の患者を対象とした別の研究で、Lukenら115 は、6人の患者のADAMTS13自己抗体がスペーサードメイン（S）内にのみ結合することを確認し、7番目の患者では、抗体はSドメインとT2-8反復の両方に結合していた。 変異導入により、ADAMTS13のスペーサードメインのThr572-Asn579とVal657-Gly666が自己抗体結合の共通エピトープであることが判明した116。 後天性TTP患者のADAMTS13に対する自己抗体は、主にIgGクラスに属するが118、IgMおよびIgAクラスの抗体も検出されている119。 後天性TTP患者のモノクローナル抗体のクローニングと配列決定により、重鎖遺伝子セグメントVH1-69が免疫グロブリンの可変領域に優先的に組み込まれることが示された。120,121 この優先性は、VH1-69のCDR2またはCDR3領域がADAMTS13のスペーサードメイン上のエピトープの特異性に寄与する可能性を示唆している。 118 IgG4は最も一般的なサブタイプで、単独または他のIgGサブタイプとの組み合わせで、患者の90%に存在した。
ADAMTS13自己抗体の産生は、ほぼ確実に遺伝的影響を受けている。 この事実は、ADAMTS13自己抗体による後天性TTPの双子の姉妹における発見によって強調されている122。再発は、後天性TTP患者の23%から44%で、多くの場合、最初のエピソード後の最初の1年間に起こる102, 110, 123, 124。 まず、子癇前症およびHELLP症候群（溶血、肝酵素上昇、血小板低下）には、TTPと重なる多くの臨床的特徴があり、全身性内皮機能障害やタンパク尿などの特定の病態生理的特徴を共有しているかもしれない（32章を参照のこと）。125 HELLP症候群は、微小血管症性溶血性貧血、LDH値の上昇、血小板減少（通常はTTPほど重篤ではない）を示す点で、TTPとの区別が特に難しい場合があります126。妊娠中のTTPは、ADAMTS13に対する自己抗体と関連している場合があり、通常、出産直後または産後に疾患が現れます127。 102
健康な成人における血漿中のADAMTS13活性は、現在利用可能な静的測定法を用いて、正常なプール血漿の約50%から178%の範囲にある。 ADAMTS13活性の低下は、肝臓疾患、播種性悪性腫瘍、128エンドトキシンによるものなどの全身性炎症症候群、129急性膵炎、130重症敗血症および敗血症性ショック、131敗血症によるDIC、132および敗血症による内臓機能不全でも認められます133～135。さらに、妊娠中および新生児においてADAMTS13レベルの低さが認められることがあります136。 顕性TTPを発症した周産期の女性を除いて、102,110 これらの条件を持つ患者で観察されるADAMTS13活性は、家族性または後天性TTP患者のほとんどで見られる極めて低い値（正常値の<5%）まで低下しません。
ADAMTS13 アサイ
ADAMTS13アサイではタンパク質分解活性、抗原レベル、抗ADAMTS13自己抗体のレベルが測定されます。 初期のADAMTS13活性アッセイは、変性剤存在下での精製VWF多量体の分解と、免疫ブロッティングによる切断産物の定量化、74,75残留コラーゲン結合、137またはリストセチン誘発血小板凝集の減少に基づいていた138。 これらの測定法は、組換えVWF断片の研究により、活性測定に必要な最小限の配列が明らかにされた後に取って代わられた。 Kokameと共同研究者は、VWF A2ドメインの部分欠失を行い、73アミノ酸の最小ペプチド（VWF73、Asp1596-Arg1668）を同定し、静置状態で変性剤なしでADAMTS13によって効率的に切断された88。 その後、蛍光共鳴エネルギー移動法（FRET）97、HRP結合VWF78、ELISA、140免疫ブロッティング141、質量分析142など、VWF73を含むペプチドの切断に基づくいくつかのアッセイが開発されてきた。
2015年に、ADAMTS13の最初の国際標準が確立され、14カ国から32の研究所でADAMTS13活性と抗原量について地元の標準に対してテストされた147 WHO IS (12/252) と名付けられたこのプラズマ標準は38人の正常健康ドナーのプーリング血漿から得られたものであった。 この研究では、この血漿の ADAMTS13 活性のコンセンサス平均値は 0.91 単位/mL で、実験室間変動は 12.4% であり、ADAMTS13 抗原の 0.92 単位/mL で実験室間変動は 16.3% であることが示されました。
抗ADAMTS13自己抗体の分析は、通常、熱不活性化した患者血漿と既知量のプールした正常血漿を混合し、残存するADAMTS13活性を測定することにより行われる。 148
これまでのところ、非抗体のADAMTS13特異的阻害剤は同定されていないが、いくつかのタンパク質およびペプチドは、特殊な条件下でVWFのADAMTS13切断を阻害することができる。 これらにはヘモグロビン、IL-6、トロンボスポンジン-1、好中球のα-ディフェンシンなどがある。 いずれの場合も、阻害剤は基質であるVWFと結合し、ADAMTS13によってVWFが切断されるのを防いでいるようである。 ヘモグロビンがこのように作用し、流動下で内皮表面のVWF糸に結合し、ADAMTS13による切断を競合的に阻害することが示された149。このメカニズムは、溶血の著しい鎌状赤血球病患者の血管閉塞性合併症を引き起こし、溶血率が高い場合にはTTPをさらに複雑化させる可能性がある。 高濃度のIL-6（50および100ng/mL）も、in vitroの流動下で、ADAMTS13による内皮ULVWF糸の切断を阻害することから50、このメカニズムは、サイトカインストーム150またはサイトカイン放出症候群時の血栓症に寄与する可能性が示唆された151。 トロンボスポンジン-1は、血小板のα顆粒に豊富に存在し、血小板の活性化により循環中に放出されるタンパク質で、VWFのA2-A3領域に結合し、in vitroでADAMTS13による切断を競合的にブロックし阻害する152。 トロンボスポンジン-1のこの血栓促進特性は、トロンボスポンジン-1ノックアウトマウスで観察された、活性化または損傷した内皮への血小板の動員不良と血小板血栓の塞栓促進との一致が見られる153。 活性化した好中球から放出されるα-ディフェンシンというヒト好中球ペプチドは、VWF A2ドメインと結合し、ADAMTS13による切断を競合的にブロックすることができる。154 後天的TTP患者の血漿中α-ディフェンシン濃度は最大7倍まで上昇する。