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Summary

Background.AntiC抗体: クロアチアのSplit-Dalmatia郡の産科集団におけるD変異体保因者の抗D抗体の発生率、結果、予防策を評価すること。 方法 1993年から2012年までのRhD免疫事象をレトロスペクティブに評価した。 女性はRhD抗原と不規則抗体について検査されました。 血清学的にD-でない抗D抗体のある人は、RHDの遺伝子型を調べました。 産科歴、輸血歴、抗D抗体価を評価した。 新生児は、RhD状態、直接抗グロブリン試験（DAT）、ヘモグロビンおよびビリルビン値、輸血療法、光線療法および転帰について評価されました。 結果 104,884人の出産のうち、102,982人の女性がRhD抗原の検査を受けました。 184人の女性が抗D抗体を接種しており、これは抗D抗体形成のリスクのある人の0.9%に相当します。 181例は、血清学的にD-と判定された女性で発生しました。 3人の女性は部分Dキャリア（DVa n = 2, DNB n = 1）で、最初はRhD+と判定され、予防接種後にD変異体キャリアと判定されました。 抗D力価は1:1から1:16まで様々でした。 6人の子供がRhD+で、4人がDAT陽性で、2人が光線療法を受けた。 結論 妊娠中の部分Dキャリア（DVa, DNB）に抗D抗体接種が行われた。 RhD+児には胎児と新生児の溶血性疾患（HDFN）の血清マーカーがあったが、重症HDFN例はなかった。

© 2016 S. Karger GmbH, Freiburg

はじめに

抗Dが胎児と新生児の溶血性疾患（HDFN）の原因となり、産科医療にとって重要で高い免疫原性の抗原である． D抗原は、通常のD+以外に、現在Dバリアントとして知られている200以上のバリアントが提示される可能性があります。 D抗原の発現が低下したものを「弱いD」、突然変異や遺伝子再配列の結果、赤血球外表面の特定のポリペプチドが欠損したタンパク質配列が変化したものを「部分D」と呼ぶが、弱いDと部分Dの区別は流動的で、弱いD型も若干からかなり変わったD抗原を持つことが証明されていた。 白人の弱D型には弱D1型、2型、3型があり、これらはアロ抗原を形成しないことが知られている。 逆に、部分的なD型キャリアは抗Dを形成しやすい。 DVI型は白人の中で最も臨床的な部分Dであり、HDFNと同様に抗D免疫に関与することが最も多く報告されているD型である 。 抗DのあるパーシャルDの母親から生まれた乳児のHDFNは記録されていますが、ほとんどの場合、稀な例外を除いては軽度でした。

弱いDタイプ1、2、3の女性におけるRhD免疫のリスクが低いことが、多くの著者が弱いDタイプの女性がRhD免疫予防を必要とせず、弱いD患者は安全にD+赤血球を受け取ることができるとする理由です 。 逆に、部分D型の女性は、出生前の管理とRhD免疫予防を考慮すると、D-に分類されるべきです。 ヨーロッパでは、妊娠中のDVIキャリアーを意図的にD-とする抗D試薬が選択され、そのような母親が第2期または産後にRhD免疫予防を受けることができるようにします。 D変異体の分布は集団によって異なり、その認識は使用するD型別試薬の選択によります。

我々は20年間の妊婦のRhD同種免疫とRhD抗原の症例をレトロスペクティブに評価しました。 血清学的にD-でなかった女性については、免疫の原因（輸血か妊娠か）、血清反応性、RHD遺伝子型を分析した。 また、RhD抗体免疫のあるD型変種の母親の子供の中にHDFNの症例があったかどうかも調べました。 本研究の目的は、Split-Dalmatia郡の産科集団におけるD変種キャリアの抗D同種免疫の発生率とその結果を評価することでした。

材料と方法

本研究は、クロアチア、Split-Dalmatia郡のSplit大学病院センターの輸血医学科で実施されました。 Split-Dalmatia郡では1年間に約5,000人の出生がある。 同病院は、妊娠全般のケア、RBC免疫のある女性のモニタリング、分娩管理を担当する地域機関である。 この地域のすべての妊婦は、初診時にABOとRhD抗原のタイピングと不規則抗体の検査を受けている。 その後の各診察では、間接抗グロブリン試験（IAT）管理のみが行われた。 RhD免疫予防は、RhD+の子供の出産後、RhD-の女性にルーチンに投与されます。 D型女性は、輸血療法が必要な場合はRhD-として扱われましたが、RhD免疫予防は受けませんでした。 RHD遺伝子型検査で部分D抗原が見つかった場合は、RhD+児の出産後に免疫予防を行いました。

Pregnancies with D Variant and Anti-D

1993年1月1日から2012年12月31日までの産科集団におけるRhD予防接種事象についてレトロスペクティブに評価しました。 Split-Dalmatia郡では、1993年1月1日から2012年12月31日の間に104,884件の生児が登録されました。 この期間中、102,982の妊娠が当科でABOとRhD抗原の検査と不規則抗体の検査を受けました（スクリーニング率は98％で、これは当院の産科集団に関する以前の研究と一致します）。 RhDタイピング検査の回数と血清学的に認識されたD変異体の数は、1993年から2001年までの産科患者の検査に関する手書きのプロトコルから、また2002年から2012年までのコンピュータデータベースから収集されました。 これらのフォームから、RhD免疫のある妊婦の全体の数を分析し、血清学的にRhDでないRhD免疫のある妊婦を詳細に分析しました。 これらの女性について、RhD免疫の原因となりうる免疫イベント、過去の妊娠、過去の輸血、産後のRhD免疫予防投与について分析し、さらにDバリアント女性のRHD遺伝子型について分析しました。 妊娠中、抗D抗体価を2-4週間間隔で測定し、各測定結果を予防接種記録用紙に記録した。 この用紙には、乳児のRhDの状態や直接抗グロブリン試験（DAT）についてのデータも含まれていました。

抗D抗体を持つD型女性からのRhD+児に関するデータは、小児科と新生児科で患者の病歴から収集されました。 収集された情報には、HDFN、新生児ヘモグロビンおよびビリルビン値、新生児輸血療法および光線療法、その他の新生児転帰に関するデータが含まれています。

RhD抗原の血清型別

1993年1月1日から2008年4月10日まで、以下のモノクロナル試薬のうち2つを用いて直接凝集管テストによりRhD型を定例的に実施した。 抗D M MonoGnost® (MS-201; BioGnost, Zagreb, Croatia); NovaClone® Anti-D IgM+IgG Monoclonal Blend (CI 175-2, D415, 1E4, Immucor Gamma, Dartmouth, NS, Canada); 抗D MG MonoGnost® (RUM-1 IgM, MS-26 IgG, BioGnost)です。

RhD抗原が直接凝集で陰性となった場合は、IATでタイピングした。 直接凝集で陰性、IATで陽性のRhD抗原は「D variant」に分類された。 カラム法によるIATでのRhD抗原の検査は、Anti-D BioClone® human monoclonal-polyclonal blend (Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, NJ, USA) を用いて実施されました。

RHD Genotyping

EDTA血液試料からのDNA抽出はQIAamp DNA Blood Mini kit® (Qiaqen, Hilden, Germany) またはQiacube analyser® (Qiaqen) により手動で行われた。 D変異体の分子型別は、PCR-SSPキット（Ready GeneWeak D® および Ready GeneCDE®; Inno-Train, Kronberg im Taunus, Germany）を用いて、メーカーの指示に従って実施した。

結果

観察期間中、ABOおよびRhD抗原と不規則抗体の検査を行った102,982件の妊娠のうち、RhD-またはD variantである女性20,050人のうちRhD alloimmunizationに影響を受けた妊娠女性は184人であった。 これはRhD同種免疫のリスクのある妊婦の0.9％を占めています。 そのうち、血清学的にRhD-と型判定された女性は181人で、3回の免疫（抗D免疫の1.63％）がRhD変異体のキャリアである女性で起こりました。 RHDジェノタイピングにより、3人の女性のうち2人は部分D型Vaで、1人は部分D型DNBのキャリアであることがわかりました（図1）。 3人の女性は、最初のRhD抗原の血清学的タイピングで、当時使用されていた試薬（抗D Mモノグノスト、ノバクローン抗D IgM+IgGモノクローナルブレンド）の選択により、RhD+と表示されました。 そのため、3人中2人はRhD+の赤血球を受け取り、いずれも産前産後の抗D免疫予防を受けなかった。 抗D抗体を接種した部分D女性の特徴を表1に示す。 そのうちの1人（DVa）は妊娠によってのみ免疫されましたが、他の2人（DVaとDNB）については、免疫されたのはRhD+赤血球を輸血された結果である可能性が高いです（表1）。

調査期間中、484人の女性が血清型判定法のみを用いてD variant (Du) として型判定されました。 これらの女性には免疫予防薬は投与されなかったが、輸血の場合にはD-赤血球が投与された（図1）。 その中で抗D型形成の症例はなかった。

表2に免疫した母親の抗D力価、および患児のデータ（新生児DAT、ヘモグロビン、ビリルビン、光線療法、輸血療法など）を示す。

DNB変種の女性は新生児のDAT陽性を調査中に免疫があることが判明しました。 この女性はボスニア・ヘルツェゴビナの市民であり、出産直前にクロアチアに到着していたため、以前の免疫血液学的検査のデータは入手できなかった。 しかし、彼女の健康歴の情報から、前の子の出産後にA+赤血球の投与を受けていたことがわかった。 その新生児は光線療法のみで済んだ。 その後の妊娠でDATが強陽性となり、生後8日目に輸血を必要とした。 1078>

2人目の女性（Va型パーシャルD）は2人目妊娠34週目に不規則抗体スクリーニングを繰り返し、同種免疫であることが判明した。 輸血歴は陰性であった。 彼女はRhD+の子供を身ごもっていましたが、抗D力価は妊娠中ずっと非常に低いままでした。 出産後の新生児のDATは陰性で，ビリルビンとヘモグロビンは基準範囲内であった． しかし、彼女の2番目のRhD+児はビリルビン値が病的に高く、光線療法が必要でした。

3番目の女性（部分D型Va）は、2番目の妊娠時のルーチンの血液型検査とスクリーニングで同種免疫が見つかり、彼女の最初の妊娠は問題なく行われたが、続いて2単位のA+ RhD+赤血球の輸血を行いました。 その後の4回の妊娠のうち、2回はDATが1+陽性のRhD+児が生まれ、彼女は3人の女性の中で最も高い抗D力を持っていましたが、彼女の子供のいずれにも病的に高いビリルビン値、目に見える黄疸、貧血は検出されず、産後は何事もなく、合併症なく病院を退院しています。 全体として、部分Dバリアントと抗D免疫の女性は、合計でRhD+児を含む6回の妊娠をしました。 1078>

考察

本研究は、Split-Dalmatia郡におけるD variantsのキャリアである妊婦のRhD免疫について分析したものである。 抗D抗体を持つ妊婦は184人であり、抗D抗体形成リスクのある人の0.9%に相当することがわかった。 これは、私たちの産科医集団の抗D抗体に関する最近の研究結果と一致している。 このような高い割合は、わが国では出生前予防が実施されていないことに起因しており、標準的な習慣とする必要性がすでに強調されている … 181人の同種免疫女性が血清学的にRhD-と型判定されました。 当初RhD+と判定された3人の同種免疫者は、部分Dキャリアーでした。 当初D型と認識されDuとされた妊婦に抗Dが形成された症例はない。

いくつかの国の抗D抗体免疫予防のガイドラインでは、弱いDまたはDuの女性は予防を必要としないとされていますが、新しい勧告では、不明瞭なRhD型別結果を解決すること、弱いDタイプ1、2、3以外のすべてのD変異をD-として扱うことの重要性が強調されています。 チューブ法で直接凝集でRhD-でも間接凝集でRhD+と判明した女性はD variantまたはDuとし、RhD免疫予防は行わず、輸血療法を考慮しRhD-としました。 この方法では、部分D抗原の妊婦はD variantまたはDuに分類され、免疫予防薬は投与されず、妊娠による免疫イベントは予防されなかった。 当センターでは、2008年より血清学的RhD型別検査の結果が不明確な症例に対して分子的RHD解析を行い、部分Dキャリアと遺伝子型別された女性に対して免疫予防を実施しました。 他の研究でも、免疫予防投与が必要な部分Dキャリアを正しく特定するために、Dバリアント抗原を持つ妊婦のRHD遺伝子型決定の重要性が指摘されています。

私たちの研究で3人の免疫不全の部分D女性全員が免疫予防を受けず、そのうち2人は当初D変種のキャリアと認識されず、RhD+として型判定されたため、RhD+単位のRBCを受け取りました。 部分D女性における1つの免疫イベントだけが、完全に妊娠と関連していました。 残りの2つのRhD免疫については、輸血と妊娠のどちらが免疫の原因となったかを決定することはできませんでした。 このことから、血清型別中にDバリアントを認識することは、妊娠中の部分Dキャリアが輸血療法や免疫予防を考慮してRhD-として扱われることを保証するために不可欠であることが示唆されます。

2008年にIATでのRhD型別が廃止された後、IAT型別で使用する抗D試薬による間接凝集反応でDVIが陽性となるため、我々の産科集団にDVI variantがいればD variantまたはDuと判定されていたものがRhD-と判定されたのである。 しかし、DVIの母親には抗Dの症例はなかった。 DVIは白人の中で最も臨床的意義のあるD型であるとされているが、本研究ではDVaとDNBに属する女性が罹患していた。 さらに、同じ地域の献血者を対象にした調査では、DVI型の保因者はいなかった。 DNBは、中央ヨーロッパの近隣地域で最も多く見られるD型部分変異であることが知られている。 今回のケースでは、DNB保因者はボスニア・ヘルツェゴビナの近隣地域出身であり、DVa保因者は2人とも調査地域のスプリット・ダルマチア郡出身であった。 このことは、RhD型別や免疫予防の基準を実施する際に、D型変異の有病率の地理的なばらつきを考慮する必要性を示唆しています。

記録された同種免疫症例にジェノタイピングを行ったところ、当初RhD+またはDuとされた女性で弱いD型に起因する抗D形成症例は見られませんでした。 クロアチアで流行している弱いD型は3型、1型、2型であり、本研究が行われたクロアチアの地中海地域では1型が最も多く、次いで3型、2型であることから、これは予想されたことでした。 非白人集団における著者らの知見とは反対に、抗 D 型を形成しやすい弱い D 型が一般的であることから、我々の産科集団における弱い D 型キャリアは免疫予防を必要としないと考えてもよいであろう 。 しかし、以前発表されたクロアチア人に関する研究では、抗Dを作ることが知られている弱いD型4.2がクロアチアの地中海地方に存在することが判明しているので、注意が必要である。 さらに、HylandらによるRhD陽性妊婦の研究では、同種免疫のある女性の中にD型キャリアが見出されています。 部分D赤血球の中には、IATを用いても抗Dと反応しないものがあります。 私たちの研究では、RhD-免疫のある女性では遺伝子型判定が行われなかったので、当時使われていた私たちの血清学的手法では抗DのあるD変異体が見落とされていたかもしれません。

他の多くの著者の所見と同様に、部分D女性への抗D免疫の結果、ほとんどがHDFNの血清学的マーカーとなりましたが、深刻な臨床的影響はありませんでした。 我々の研究では、3人の女性のうち最も高い抗D力価を持つ女性がDATが1+の子供を産み、低い力価の女性の子供はDAT 4+と、より顕著な血清学的影響を受けていることは興味深いことであった。 HDFNの重症度に関する要因は、まだ研究の余地がある。 パーシャルD母親のHDFNは軽症例が多いが、致死的な結果も報告されている。

非RhD-女性における抗D形成は非常にまれですが、示された免疫事象は、輸血療法と免疫予防を考慮してRhD-とみなす必要がある部分Dキャリアを正しく特定することが重要であることを確認します。 アメリカの最近の研究では、血清学的に弱いD表現型を持つ妊婦にRHD遺伝子型判定を行うことは、コスト的に中立の戦略であり、時間の経過とともにコスト削減効果はわずかに増加する可能性があることがわかりました。 もし最初の血清型別でD型が認識されず、D型キャリアがRhD+と判定された場合、遺伝子型の必要性が認識されないため、RHD遺伝子型の重要性を強調することが必要です。 我々の研究では、3人の妊婦の抗Dは、当時使用されていたモノクローナル試薬で赤血球の反応性が強かったため、当初はD型と認識されなかったのです。 血清学的RhDタイピングの試薬の選択は、D亜型の認識、ひいては分子的RhDタイピングの必要性の認識に極めて重要であると結論できる。

最後に、この研究では、最初にD変種と型別された妊婦にはRhDの免疫例がありませんでしたが、RhD+と型別された女性には免疫例がありました。 このことは、我々の母集団において抗D抗体免疫のリスクのあるD変異体を検出できるような血清学的RhDタイピングの試薬を適切に選択するために、さらなる調査が必要であることを示唆しています。

このretrospectiveな研究の限界は、長い追跡期間、研究期間中に使用された方法と試薬の変更、および検査アルゴリズムである。 2008年以降のIATではRhDタイピングが省略されたこと、2008年以前はD抗原を持つ女性には予防投与が行われなかったのに対し、2008年以降は部分D抗原を持つ妊婦に免疫予防投与が導入されたことなどが変更点としてあげられる。 本研究のもう一つの限界は、同種免疫のRhD-女性には遺伝子型判定が行われなかったことです。

この限界にもかかわらず、産科集団を長期間にわたって追跡調査することが非常に重要であると考えます。 これによって、D型変異を持つ妊婦のRhD抗原血清型別戦略および免疫予防投与が適切であるかどうかを評価することができます。

謝辞

著者らは、Pera Erceg-Maglic, Hanija Dadic-Jadric, Branka Skelin, Dejana Bogdanic, Ivica Bradaric, Vedrana Burilovic and Nina Ipavecが研究中のデータ収集に感謝します。

Ethical Prerequites

研究はスプリト大学病院センターの倫理委員会によって承認されています。

Disclosure Statement

著者は利益相反を開示しない。

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