B. germanicaのゲノムにおけるAMPドメインを持つタンパク質の遺伝子
B. germanica6ゲノムにおいてAMP機能を持つ注釈付き遺伝子を特定するには二つの戦略を使用しました。 一つは、defense、drosomycin、tenecin、phormicin、attacin、coleoptericinという用語を含む製品名の検索であった。 もう一つは，抗菌ペプチドに関連する注釈付きPfamドメインからの検索である。 これらは、Pfamデータベースの3つのクランドメインに含まれている。 Knottin_1 (CL0054, Scorpion toxin-like knottin superfamily), Defensin (CL0075, Defensin/myotoxin-like superfamily) and Omega_toxin (CL0083, Omega toxin-like) の3つのクランクドメインに含まれていた。 検出されたPfamドメインは5つであった。 PF11581 (Argos), PF03769 (Attacin_C), PF01097 (Defensin_2), PF00304 (Gamma-thionin) and PF11415 (Toxin_37). C0J52_07645 (Giant-lens protein) と C0J52_08617 (putative defense protein 3) は AMP をコードしていないため削除し、24 のコード遺伝子を保持した（補足表 1）。 これらは当初、以下のグループに分類された。 (i) Defensin_2タンパク質（以下Defensin）（10CDS、うち2つはpartial = 5′の注釈付き）、(ii) Drosomycin (Gamma-thionin domain) (10CDS), (iii) Termicin (Toxin_37 domain) (3 CDS) および (iv) CDS C0J52_26498 の各グループに分類した。 後者は仮説的タンパク質と注釈され、Attacin_Cドメインを持つ長いタンパク質（541アミノ酸）であった。 しかし、より厳密なドメイン解析の結果、このタンパク質にはAttacin_CやColeoptericin（PF06286）と類似した2〜3個の追加ドメインが存在する可能性が示された。
注釈付きAMPコード遺伝子を修正するために、いくつかのB. germanica RNA-Seq SRA実験（PRJNA389591）は、BLASTNといくつかのAMP CDSをクエリーとして、その発現をスクリーニングした。 AMPリードが豊富なSRAランの中から、RNA-SeqランSRR6784710（全身、成人女性）を選択した。 ランSRR6784710をde novo Trinity25でアセンブルし、転写データベースを作成した。
各クラスのAMP遺伝子の完全なセットを特定する目的で、注釈付きゲノムを転写データベースと比較した。 精査の結果、39個のAMP遺伝子（ディフェンシン、ターミシン、ドロソマイシン、アタシン様、ブラテリシンの5種類に属する）を同定した（以下、記述する）。 そのうち34個は10のゲノムスカフォールドに分布し、5個は配置されていなかった（表1；補足表2）。
ディフェンシンAMP遺伝子
ディフェンシン領域を持つ注釈付きAMP CDS10個をSRR6784710転写データベースに対するBLASTN（e値=1.0E-20）でクエリーとして使用した。 いずれも少なくとも1つの転写産物がヒットした。 合計で16種類の転写産物が同定された。 転写産物の存在量はTPM（transcripts per million transcripts）値で323.64-0.00の範囲にあった。
ゲノムアノテーションと組み立てた転写産物の情報を比較し（材料 & Methods参照）、16種類のディフェンシン遺伝子を特定した（補足表2および3）。 これらはdefensin_g1〜defensin_g16の名称を受け、defensin_g1とdefensin_g16にはコード領域に影響を与えない2つのalternative isoformsが含まれている。 defensin_g1のアイソフォームi1とi2は3′-UTRイントロンを除去するかしないかの違いがあり、一方defensin_g16の2つのアイソフォームは異なるポリ(A)シグナルを使用するかの違いがあった。
defensin遺伝子（配置されていないdefensin_g1を除く）は4つのスキャフォールドにクラスタリングされていることが確認された。 配置されていないdefensin_g1は、プログラムがクラスタTRINITY_DN1123_c0に属する3つの転写物を同定したため含まれた。 そのうちの1つ（defensin_g2に相当）は遺伝子C0J52_24001（仮説的タンパク質をコード）と関連している可能性があるが、第2エキソンの開始点を正しく配置した後に正しい読み枠を回復させた。 他の2つの転写産物は100％の同一性を示したが、453-ntの3′-UTRイントロンの代替スプライシングの点で異なっていた。 これらは7塩基（CDSに2塩基）＋3′-UTRの大きさの異なる3つのインデルが異なることから、defensin_g2の別遺伝子であるdefensin_g1のアイソフォームであるとみなした。 しかし、そのような配列はどの足場配列にも検出されなかった。
高発現転写物（TRINITY_DN13842_c0_g1_i1）は、ゲノム中のほぼ同じ配列（defensin_g3からg6）を持つ4つの座位のリードをTRINITYで誤って組み立てたことから由来すると思われた。 そのうちの3つは、以前はC0J52_27569, C0J52_22338, C0J52_24004というlocus_tag修飾子でアノテーションされていたものである。 しかし、C0J52_27569（scaffold PYGN01003429の遺伝子=DEFI_4）は2つの遺伝子（defensin_g3およびdefensin_g4）のタンデムであった。 defensin_g3と重複するassembly gapが、両遺伝子を展開した単一のmRNAがゲノムにアノテーションされた理由と考えられる。
defensin_g7とdefensin_g8は同一のCDS配列を示し、mRNA配列のUTRセグメントにはいくつかの相違点がある。 これらはそれぞれPYGN01002380とPYGN01001185というスキャフォールドに配置された。 そのうちの1つであるdefensin_g8のみ、以前に遺伝子C0J52_22336として注釈されていた。
Defensin_g9 は、91アミノ酸のタンパク質であるPhormicinをコードする遺伝子C0J52_24005に相当した。 転写解析の結果、コードされているタンパク質は71アミノ酸と短く、アミノ末端に20アミノ酸のシグナルペプチド配列があることがわかった（下記参照）。 Defensin_g10も別のscaffoldに位置するPhormicinであったが、第2エキソンのみがゲノムに存在し、第1エキソンは連続した1kbのアセンブリギャップに配置されている可能性が高い。
Defensin_g11, g12, g13は以前に注釈された遺伝子と同等である（補足表2および3）。 Defensin_g14はscaffold PYGN01001185に存在するが、アセンブリギャップのため第2エキソンの配列のほとんどが欠落している。 defensin_g15とC0J52_20459のCDS配列は同一であったが、defensin_g15の転写解析から、3エキソンのC0J52_20459ではなく、2エキソンのmRNAであると考えられた。
すべてのディフェンシンではN末端に18から22アミノ酸のシグナルペプチド、C末端にPF01097 (Defensin_2) のドメインを示した（図1のドメイン組織の例参照）。 アミノ酸鎖の長さは63から81残基で、平均72アミノ酸であった。 一部のDefensinタンパク質は同一であったが、一対の相違点の平均数は29アミノ酸と多かった。 最尤法による系統樹の推定では、7つのクラスターに分布していた（図2a）。 Defensinタンパク質のアラインメントのロゴは、疎水性のN末端配列と、6つの保存されたシステイン残基を持つDefensin_2ドメイン（C末端）を示している（補足図1）。 各クラス1つのタンパク質を示す。 オレンジ色の四角はシグナルペプチドである。 赤い楕円はグルタミン/グルタミン酸に富む領域に相当する。 緑の楕円はPfam-Aドメイン PF03769 (Attacin_C)。 青い楕円は上から順にPfam-AドメインPF01097 (Defensin_2), PF11415 (Toxin_37), PF00304 (Gamma-thionin) である。
B. germanica DefensinおよびDrosomycinタンパク質系統樹。 (a)18種類のディフェンシン蛋白質の最尤系統樹（16遺伝子の転写産物から算出）。 モデルWAG＋Iで完全欠失。 アラインメント長57サイト。 ブートストラップは100回。 中点ルーティング。 (b) ドロソマイシンタンパク質の最尤系統樹。 完全欠失のDayhoff + Gモデル。 アラインメント長66サイト。 ブートストラップは100回繰り返される。 中間点ルート化。 50より小さいブートストラップ値は非表示。
16のディフェンシン遺伝子の転写レベルの間の比較は、各CDSの41-190塩基でのBLASTN検索に基づいたBLASTN戦略で推定された。 150ntの配列は、defensin_g3とg5が同一である以外は、少なくとも1塩基が異なっており、転写レベルを特定の遺伝子に割り当てることはできなかった（補足表3）。 TRINITYで推定したTPM値と今回のBLAST戦略で推定した転写量から、この雌成体ランでは、defensin_g15とg16（Defensin様タンパク質をコード）、g9とg10（Phormicinをコード）、g1、g2、g3とg5（Tenecin-1タンパク質をコード）が最も高発現なディフェンシン遺伝子であると観測した（Supplementary Table3）。
TBLASTN戦略を用いて、Blattodea26目をカバーする45種のディフェンシン転写物を検索した(Supplement Table 4)。
テルミシンAMP遺伝子
PfamドメインPF11415を持つ小型タンパク質をコードする3つの遺伝子がゲノムにアノテーションされている（Supplementary Table 1）。 SRR6784710の転写産物データベースに対してBLASTN検索を行ったところ、2つの非常に類似した転写産物のみがヒットした。 最初の転写物であるTRINITY_DN10017_c0_g1_i1は、CDS配列においてC0J52_00758またはC0J52_26761と1つの違いを示し、残りのmRNA配列では複数の違いを示したことから、ゲノム内に2つの独立した遺伝子が存在することが示唆された。 2番目の転写物であるTRINITY_DN10017_c0_g2_i1は、C0J52_26762のCDSとmRNAの両方と100%同一であり、3番目のターミシン遺伝子があることが示唆された。 3つのコードされたタンパク質は、13番目の部位に1つのS/Aの違いがあるだけで、ほぼ同一である（補足図1）。 アミノ酸1-19間にシグナル疎水性ペプチド、アミノ酸30-63間にToxin_37ドメイン（PF11415）が予測される（図1）。 TRINITYで推定したTPM値とBLASTNで推定した転写量（ターミシンCDSの4つの多型部位を含む150bpセグメント）から、termicin_g3（C0J52_26762）が最も高発現のターミシン遺伝子と結論できる（補足表5）
異なる分類群に属するblattodea 29種からターミシンmRNAが検出された（補足表4）。
Drosomycin AMP 遺伝子
B. germanica ゲノムの3つの足場には、ドメイン Gamma-thionin (PF00304) を持つタンパク質をコードする10の遺伝子がアノテーションされていた。 これらの抗真菌性タンパク質はDrosomycinsと命名された。 このCDSをSRR6784710転写産物データベースとBLASTN検索したところ、完全なCDSを含む転写産物は6件、CDSセグメントのみを含む重要でない転写産物は2件のみであった。
注釈付きCDSとこれらの転写産物から得られたものを比較したところ、注釈付き遺伝子の3つ（C0J52_03170, C0J52_03171, C0J52_12810）だけがこれらの転写産物の3つと同等（前者は2塩基差あり）であることが判明した。 これらはdrosomycin_g2、g3、g5と注釈された（補足表2、6）。 残りの3つの転写産物のうちの1つ、drosomycin_g6に相当するものは、数塩基の違いを伴い、注釈のないセグメントでゲノムに配置することができた。 最後に、他の2つの転写産物の配列は、CDS配列がC0J52_03170と高度に類似していた（6塩基と8塩基の違いがある）が、ゲノム中に検出されなかった。 これらの違いから、これらは対立遺伝子ではなく独立した遺伝子であると考えられ、drosomycin_g1およびg4と注釈した（補足表2および6）。
一方、locus_tagsで注釈した6つの遺伝子、C0J52_12811-13およびC0J52_23105-08は成虫女性のトランスクリプトームでは検出できなかったが、他の発生段階においては発現していると思われる。 これらはdrosomycin_g7からg13と注釈された。
13個のDrosomycinタンパク質の系統樹は、defensin_g6が最も遠い遺伝子であり、他の12遺伝子は6遺伝子ずつ2つのクラスターを形成していることが示された。 成熟雌で発現する遺伝子drosomycin_g1〜g5と非発現のdrosomycin_g9はよく支持された一つのクレードを形成し、他の6つの非発現遺伝子は他のクレードを形成した（図2b）。
転写レベルを推定すると、drosomycin_g5（C0J52_12810）が最も発現量の多い遺伝子であり、このセグメントのdrosomycinリードの86.1％がこれに由来していた（補足表6）
コードされている13のタンパク質のうち12は66アミノ酸長であった。 Drosomycin_g6は、2つのインデル（アラインメントの部位25-26および36-38）に由来する追加のアミノ酸がタンパク質の中央に存在するため、71アミノ酸の長さであった。 観察された残基の中で、コードされたタンパク質における最も顕著な特徴は、8つの保存されたシステインの存在である27 (Supplementary Fig. 1)。 全てのDrosomycinはN-末端にシグナル疎水性ペプチド、C-末端にPF00304ドメイン（γ-thionin）を有する（図1）。
DrosomycinのmRNAはBlattodea属24種で検出されたが、 Isoptera属とその近縁種Cryptocercus wrightiでは認められなかった（Supplementary Table 4）。
Attacin AMP genes: attacin-like and blattellicins
コンティグPYGN01001824にあるC0J52_26498遺伝子にかかる47kb領域には、Attacin_C domain（PF03769）と何らかの類似性を持つ領域が最大4つ検出された。 組み立てられたトランスクリプトームを予備的に解析した結果、10以上のmRNA配列が同定された。 これらは、2種類のアタシン遺伝子に属するmRNAの完全配列または部分配列に類似している。 最初のタイプは、N末端にシグナルペプチド、C末端にAttacin_Cドメインを持つ典型的なAttacinタンパク質（約120アミノ酸）をコードする遺伝子で、Attacin様遺伝子と命名した。 2番目のタイプは、グルタミン/グルタミン酸残基を長く含んでいるため、非常に異なっていた。 これらの遺伝子はB. germanicaの進化的革新と思われるので、我々はこれらをブラッテリシンと呼んだ。
トランスクリプトーム中に3つのアタシン様転写物が検出された（補足表2および7）。 これらは357-360ヌクレオチドのコード配列を含んでいた（118-119個のアミノ酸がコードされている）。 これらはattacin-like_g1〜attacin-like_g3という名称を与えられた。 これらのmRNAのリードの抽出とアセンブリにより、それらの存在が確認されたが、第4の遺伝子の可能性も示唆された。 attacin-like_g3Aとattacin-like_g3Bは、attacin_g3Bの5′UTRの9ヌクレオチド部分の欠失とCDS288位の同義の差（1リードの長さが301塩基であることを考えると、2差分の部位がリード内に入ることは非常に少ない）のみを示している。 差分が2つしかなく、ゲノム上で配置されていないことから、同一遺伝子のアレルと考えた。
Attacin-like_g1 CDSはattacin-like_g3 CDSと比較的似ており、差分は9-10であった。 しかし、両者は独立した遺伝子座と考えるには十分な違いであった。 また、Attacin-like_g2は85-88の差があり、他の遺伝子に対してコドンが1つ余分にあり、最も乖離した遺伝子であった。 アタシンライク_g1とg2の配列のみがゲノムに存在した（補足表2、7）。
ブラテリシンのアノテーションはより複雑であった。 予備解析の結果、長いCDS（> 250コドン）が不思議な構造で観察された。 N末端の疎水性シグナルペプチドから始まり、中間に長いGlxに富んだセグメント（> 70残基、主にグルタミンとグルタミン酸）、C末端のAttacinドメイン（図1）。
この種の配列を含む最大13のmRNA転写物（すべて不完全なCDSセグメントを含む）が検出された。 その主な理由は、いくつかのブラテリシン遺伝子と長いGlx-rich領域の存在が、転写産物の組み立てに劇的な影響を与えたためである。 この事実は、B. germanicaゲノムのアセンブリとアノテーションの際に起こったと考えられる5,6。
ブラテリシンCDSの5′配列をクエリーとして、SRR6784710ランのブラテリシン遺伝子の発現から得られたリードをBLASTNで同定した。 抽出・アセンブルの結果、ブラテリシン遺伝子の4種類の開始点が明らかになり、mRNAの5′のペアワイズヌクレオチドが7から18の範囲で異なっていた。 これらの4つのmRNAの開始点を用いて、CDSが完成するまで残りの遺伝子配列を募集した。
ブラテリシン_g1のCDS配列は、2つのアセンブリギャップにより約200bpが欠如していたが、ほとんどのゲノムを確認できた（補足表2、7）。 その他は、blattellicin_g2とg4の最初のコーディングエキソンのみが特定のコンティグセグメントに明確に割り当てられたが、CDSの他のセグメントも検出されたが、100％の同一性はなかった。 ブラテリシン_g3の第1エキソンと同一の配列はゲノム上に確認されなかった。 最も可能性の高い説明は、4つのブラテリシン遺伝子はゲノム中にタンデムコピーで存在するが、その特殊な中心反復構造により、手動でアラインメントを検査する場合を除いて、ゲノムまたはトランスクリプトームで正しいアセンブルを行うことができないということである。 さらに、集団におけるGlxコドンのコピー数の変動も否定できない。
我々は、ブラテリシンがアッタシン様遺伝子よりも高いレベルで発現していることを検出し、Blattellicin_g4がこの転写産物において最も高く発現していた（補足表7）。
ゲルマニカAttacin様タンパク質とBlattellicinタンパク質のアミノ酸組成とアラインメントのログです。 (a)3つのAttacin様タンパク質のアラインメントロゴ。 (b)4つのブラテリシンのアラインメントのロゴ。 (c)アッタシン様タンパク質とブラテリシンタンパク質の平均アミノ酸組成(%)。
アッタシンmRNAはほとんどのBlattodea種で検出された（補足表4）。 BlattellicinのHitはGlx領域は含まず、attacin_Cドメインのみであった。 B. germanicaにおけるアタシン様遺伝子とブラテリシン遺伝子の進化の歴史を理解するために、7つのBlattellinae TSA project26 (Symploce sp., B. germanica) からアタシン転写物を抽出し、ブラテリシン遺伝子がどのように進化してきたかを調べた。 AD-2014, Loboptera decipiens, Episymploce sundaica, Ischnoptera deropeltiformis, Paratemnopteryx couloniana, Lobopterella dimidiatipes, Asiablatta kyotensis)からアタシン転写産物を抽出した。 これらのトランスクリプトームは、I. deropeltiformisを除く成体全体から得られている（発生ステージに関する情報はなし）。 各ゲノムのすべてのアタシン遺伝子を網羅する可能性があるが、発現していない遺伝子の可能性も捨てきれない。 アタシン遺伝子の数が最も多かったのはE. sundaicaの3つであった。 L. decipiens、Symploce sp.では2つの遺伝子が観測された。 AD-2014、A. kyotensisに2つ確認されたが、前者ではコピーの1つが不完全で非常に分岐しており、おそらく偽遺伝子と思われる。後者では2つのコピーがCDSの5′末端で数コドン不完全であった。 SRAプロジェクトでは、CDSの開始点をカバーするリードをスクリーニングし、回収したものをもとに、一方は完成しており、もう一方では、4つのコドンのみが欠落していることがわかった。 この残存種には、1つの遺伝子コピーが含まれていた。 また、アウトグループとして、P. americanaで唯一検出されたものを抽出した。
トリミングしたアライメント（103部位）を用いて系統樹を行った（図4）。 配列の長さが短いため、ほとんどのノードで高いブートストラップ値が得られず、この遺伝子ファミリーの進化史を完全に確信を持って決定することができなかった。 しかし、この系統樹からいくつかの事実が観察された。 まず、アタシン様遺伝子は祖先の遺伝子タイプである。 Blattellinaeのいくつかの種は、1つまたは2つの遺伝子しか持っていない。 B. germanica, E. sundaica, L. decipiens, Symploce sp.のクレードの場合、アタシン様遺伝子は祖先の遺伝子型である。 AD-2014では、分岐前に祖先のアタシン様遺伝子の重複が起こり、アタシン様_g1型とg2型が出現している。 L. decipiensのattacin-like_g1は系統樹に含まれていなかったが、このタイプの転写物の不完全で分岐したコピー（GDYK01026461.1）が検出され、おそらく偽遺伝子に由来すると思われる。
Blattellinaeにおけるアタシン様タンパク質とブラテリシンタンパク質の系統樹。 (a) Blattellinae亜科のAttacin_Cドメインを含むタンパク質の最尤系統図。 完全欠失のLG＋Gのモデル。 N末端のシグナルペプチドとC末端のAttacin_Cドメイン（長さ103サイト）を結合するようにアラインメントをトリミングした。 P. americanaはアウトグループとして使用。 Bootstrap replicates 100. 50より小さいブートストラップ値は非表示。 Symploce sp.を除き、種名はすべて略称（右トポロジーのコード参照）。 略号のないものはB. germanicaのタンパク質である。 (b) 26.による分類関係
ブラテリシンの起源は非常に新しいと思われる。 有意なブートストラップ値では支持されないが、潜在的には祖先のattacin-like_g2型遺伝子が重複し、そのうちの1つが速い進化の後、blattellicinsを生成した可能性がある。 この重複は、E. sundaicaとB. germanicaが分岐する前に起こったものである。 前者のタンパク質は、サイズが大きい（182残基）、C末端に数個の余分なアミノ酸（B. germanicaではRK、E. sundaicaではGKGK）など、ブラテリシンの新しい特徴のいくつかを含む前ブラテリシンであることが明らかであった。 しかし、ブラテリシンの主な特徴である長いポリGlx領域は存在せず、E. sundaicaのプレブラテリシンにはアタシンドメインの開始点に近い7グルタミン酸のトラック（真ん中にAを持つ）がある。
AMP expression in B. germanica
B.germanicaの組織、発生段階または性別におけるAMP遺伝子の発現を調べるために、17種類のAMP遺伝子（defensin_g2、g3、g7、g9、g11、g13、g15； termicin_g1；drosomycin_g1、g5、g6、g11、g12； attacin-like_g1 およびg2；blattellicin_g1およびg4）のCDSを選びました。 これらは、同じグループから選択されたもの同士の重要な交差結果を避けるために、十分に異なるものである。 しかし、同じファミリーのいくつかの遺伝子はCDSの類似性が高いため、得られた値はほぼ同じ配列を持つ遺伝子セット（例えば、3つのtermicin遺伝子やattacin-like_g1とg3）の発現を示した。
発現量はBLASTN戦略でSR実験のヒット数/Gbとして推定した（Supplement Table 8）。 異なる発生ステージのサンプルに対応する28の全身SR実験のヒートマップ解析（図5）により、いくつかの結論が得られた。 まず、成体雌はほとんどのAMP遺伝子で高発現を示したが、最も関連性が高いのはblattellicin_g1とg4の高発現であった。 また、いくつかのdrosomycinも高発現しており、特にdrosomycin_g5が高発現していた。 いくつかの遺伝子の発現は発生と関連していた（例えば、成虫の雌ではdrosomycin g11とg12が発現しないが、ニンフでは高発現することを参照のこと）。 ディフェンシンでは、ほとんどの発生段階において最も高発現していたのはdefensin_g9とg15であった。 ディフェンシンg2およびg3はニンフよりも成熟雌で高発現した。 Termicin_g1はニンフおよび成体で低い発現を示した。 アタシン様遺伝子も成虫で発現しており、アタシン様_g1の値はアタシン様_g2の値よりも高く、これは先に述べた結果（補足表7）と一致し、またアタシン様_g1の検出ヒットがおそらくg1およびg3遺伝子に由来することを考慮すると、アタシン様遺伝子は成虫でも発現していることが示唆された。
B. germanicaの全身における17個のAMP遺伝子の遺伝子発現量。 B. germanicaの様々な発生段階の全身に対応する28のSequence Read実験における、選択された17のAMP遺伝子の転写物の存在量を示すヒートマップ解析、いくつかの場合、サンプルの性別の表示。 その値は、1.0E-40より小さいe-valueでヒットしたリードの数（BLASTN検索のクエリーとして完全なCDS配列を使用）とSR実験のサイズ（Gb）との商として推定された。 残念ながら、オスだけのSR実験はSRAデータベースに登録されていないが、オスとメスが混在したサンプルはいくつか報告されている（補足表8）。 一般に、drosomycin_g5とdefensin_g9は、これらのサンプルのほとんどで発現しているようである。 雄成虫頭部からの2つの実験では、defensin_g7とg9、drosomycin_g5とattacin-like_g2など、いくつかのAMP遺伝子が関連するレベルで発現していた。 一般に、これらのサンプルにおける発現レベルは、全身から得られたサンプルよりもはるかに小さい。 このことから、脂肪体、卵巣、表皮とは異なる他の部位が、全身成体雌で観察される高い発現レベルに関与していると考えられる（図5）。
ブラテリシン_g1およびブラテリシン_g4は、おそらく雌組織との汚染による、ある非産卵試料でのほとんど検出できない発現を除いて、どの組織または部位試料でも全く発現が観察されなかった。