Alai

A brief history of T. reesei

The most ancient biotechnology practices involving fungi production of beer, wine and cheese may back several millennia, e.s. exactly started of literate civilization itself.と、セルラーゼと酵素の研究は、その始まりから、数千年前まで、遡ると言われています。 一方、糸状好中性子嚢菌であるTrichoderma reesei（当時はTrichoderma viride）が細胞外セルラーゼを生産する驚くべき可能性を発見したのは、わずか70年余り前のことであった。 当初、第二次世界大戦中にソロモン諸島で米軍の腐敗した機器から分離されたオリジナルのTrichoderma sp.の破壊力はかなり問題視された。 しかし、メアリー・マンデルズとエルウィン・T.が率いるナティック陸軍研究所の研究者たちは、すぐにこのトリコデルマ属菌に注目した。 しかし、メアリー・マンデルスやエルウィン・T・リースの率いるナティック陸軍研究所の研究者たちは、この問題だらけの潜在能力を、目的のある製品に変えようとした。 Quartermaster Collectionの14,000のカビをスクリーニングしたところ、Trichoderma sp. QM6aは、天然の結晶性セルロースを分解する優れた能力を示した。 QM6aは、ナティックにあるクォーターマスターコレクションに保管されていた6つの培養物のうちの6つ目であることを示す、最後に残ったオリジナルのトリコデルマ菌の名称であり、この菌はそのまま残った。 この特定の菌株は、T. reesei 基準菌株とみなされているだけでなく、今日産業界で使用されているすべての変異体がそこから派生した 1 株です。

T. reesei の研究は、当時も今も、その分泌するセルラーゼが、200 年に及ぶ、再生可能でリグノセルロース系のバイオマスから燃料を経済的に生産するという戦いに大きなインパクトを与えるかもしれないという考えに基づいて推進されてきました。 T. reesei の研究は、異なるセルラーゼ活性の相乗的な組み合わせによるセルロースの酵素的糖化という概念を開拓し、関連する酵素の制御に関する現在の理解の基礎を築いた。 また、その主要なセロビオヒドロラーゼであるCBH1（CEL7a）は、真核生物で初めてクローニングされたセルラーゼであり、その構造が解明された最初のセルラーゼでもあった。 T. reesei セルラーゼの工業的応用に向けた重要なステップは、1970 年代に効率的な菌株の変異誘発とスクリーニング方法が開発されたことであった。 その後 20 年間に、Natick と Rutgers 大学で行われた変異導入プログラムにより、オリジナルの QM6a 株が生産する細胞外タンパク質の力価は最大で 20 倍に増加した。 後者は、RUT-C30株（「RUT」はRutgersの略）の単離で頂点に達した。 産業界におけるセルラーゼ生産のゴールドスタンダードは100 g/L以上と報告されていたが、この株はセルラーゼ誘導基質ラクトース上で細胞外タンパク質の力価が30 g/Lに達する、一般に入手できるセルラーゼ超生産株のプロトタイプである

しかし当初、リグノセルロース系バイオマスから発酵性糖類への効率的かつ完全な糖化には当初予想していたより多くの酵素活性が必要なことがわかってくると、他の商業用途も開発された。 ここでもまた、T. reesei の研究は、セルロースとヘミセルロースの両方の分解酵素学において新境地を開拓し続け、現在もなおその成果を維持している。 高速の原子間力顕微鏡によってセルロースの分解も可視化され、主要なセロビオヒドロラーゼであるCBH1/CEL7Aがセルロース表面に沿って一方向にスライドしている様子が明らかになった。 1990年代初頭には、T. reeseiの遺伝子工学を促進する形質転換技術が利用できるようになった。 その後10年間、これらの技術は、T. reeseiの酵素の制御に関する新たな知見を得るとともに、菌が分泌する酵素のプロファイルを変化させるのに役立った … 当時、T. reeseiはまた、cbh1 (cel7a) 発現シグナルによる子牛キモシンの発現に代表されるように、哺乳類タンパク質の発現の最初の宿主のひとつであった

1990年代末には、KuhlsらがHypocrea jecorinaが実際にはT. reeseiの性形態であると発見したが、これがその後の多くの出版物がT. reeseiではなく H. jecorinaという種名を使っている理由である。 性発生に関するより詳細な研究により、QM6a株は実際には雌性不妊であるという仮説が生まれ、これはその後、MAPキナーゼ足場をコードする遺伝子ham5の突然変異と関連づけられるようになった。 彼らは、T. reesei ゲノムの 5000 種以上の転写産物に対応する cDNA を基に DNA マイクロアレイを構築し、トランスクリプトーム研究を行いました。 その 5 年後、最初の T. reesei 分離株 QM6a のゲノム配列決定と解析が行われ、ゲノ ムワイド研究の広範な応用の基礎が築かれたのです。 その後、多くのセルラーゼ高発現株と低発現株のゲノム比較解析により、核細胞質輸送、液胞タンパク質輸送、mRNAターンオーバーなど、セルラーゼ高発現に関わる新規因子が発見された。 これらの比較解析は、学術・産業界で使用されているすべてのT. reesei株がQM6a株から派生しているという事実から恩恵を受けている。 Elwyn Reesei が T. reesei によるセルロース分解を最初に研究してから 65 年が経ち、現在、世界中に設置されているセルロース系バイオ燃料生産能力は、年間 480.5 百万リットル（MMLY）のエタノールで、そのうち 380.5 MMLY（約 80%）がアクセラーゼや Cellic などの T. reesei 製酵素製剤で生産されている（図 1a）。 この取り組みには、プロセスエンジニアリングや基質の前処理など、いくつかのレベルで基礎技術の成熟が必要であったことは間違いない。 しかし、バイオマス糖化工程における酵素製剤の製造と最適化は、セルロース系エタノールプロセスのコストパフォーマンスを決定する重要な要因の1つであり、現在もそのことに変わりはない。 さらに、T. reesei を用いた酵素生産は、決してバイオリファイナリー用酵素の生産に限定されるものではあり ません。 実際、酵素製品製造業者および製剤業者協会に登録されている全技術用酵素製剤の約 11 % が T. reesei を発現宿主として製造されている（図 1b, c）。

The T. reesei biomass enzyme mix: new insights and limitations

自然界ではリグノセルロースの分解が1つの生物によって行われることはほとんどない。 むしろ、異なるポリマーを分解するために複数の炭水化物活性酵素（CAZymes）を生産する複数の生物の順序と集団的努力によって達成されるのである。 したがって、リグノセルロースを完全に糖化するために、T. reeseiの分泌型セルラーゼミックスをコスト競争力のある酵素製剤に大幅に適合させる必要があったことは驚くには当たらない。 T. reesei のβ-グルコシダーゼ活性は、そのほとんどが菌体細胞壁に結合しているため、十分な活性を有していないことが早くから研究者によって認識されていた。 その結果、β-グルコシダーゼ活性を高めると、エンドグルカナーゼとセロビオヒドラーゼの協同作用によって放出されるセロビオースによる生成物阻害を打ち消し、セルロースの分解を向上させることができた。 このフィードバック機構がなければ、セルロースの糖化は著しく遅くなる。 同様に、ヘミセルロース由来のキシロマンノリゴ糖はT. reeseiのセロビオヒドロラーゼを阻害することから、リグノセルロースを効率的に分解するには、β-キシロシダーゼとβ-マンノシダーゼが十分に作用することが強く示唆されている。 2003年、Foremanらは、主要なセルラーゼと共誘導される2つのタンパク質を報告し、セルロース誘導タンパク質1および2（CIP1およびCIP2）と名付けた。 その後、これらのタンパク質は、リグノセルロースの効率的な分解に重要であることが示された。 最近の研究により、CIP1はリアーゼと構造が似ているが、リアーゼ活性は証明されていないこと、CIP2はCE15ファミリーのグルクロノイルエステラーゼであることが示された。 もう一つの重要な分泌タンパク質はスウォレニンSWO1であり、これは糖鎖結合モジュール（CBM）とエキスパンシン様ドメインを結合している。 SWO1はセルロース分解活性を持つが、前処理したコーンストーバーの酵素加水分解において、エンドグルカナーゼやセロビオヒドロラーゼ活性よりもむしろエンドキシラナーゼ活性を相乗的に増強する。 その作用機序として、リグノセルロースのキシラン部分がキシラナーゼによる分解を受けやすくなり、それによってセルラーゼの作用が間接的に促進されるという説がある。 セルロース分解における近年の最大の革命は、溶菌性多糖類モノオキシゲナーゼ（LPMO）の発見であろう。 この酵素は、多糖類の分解に新たな酸化的なメカニズムを導入した。 セルロースの分解では、LPMOが結晶性セルロースフィブリルの表面に作用し、セルラーゼがよりアクセスしやすくしていると推測される。 興味深いことに、これらの酵素は、このプロセスに必要な電子を長距離電子移動によって植物細胞壁リグニンから得ることができ、それによって植物の防御機構を敵に回すことになる . あるいは、GMC酸化還元酵素やセロビオース脱水素酵素が電子供与体として働くこともできる。 この発見は、T. reeseiがどのようにしてLPMOを生成するかを説明するのに十分である。というのも、このようなGMC酸化還元酵素が、実際に麦わらによって誘導されることが以前に明らかにされているからである . しかし、この酸化的なメカニズムは、決してセルロースの解重合に限定されるものではない。 LPMOはもともとキチンについて証明されたが、キシログルカンやアミロースの分解にも関与している。 CAZyデータベースでは、このグループに属する酵素は、以前はグリコシド加水分解酵素（GH61など）に分類されていたが、「補助活性」（AA）に再分類され、AAファミリー9-11および13に分類されている . ヘミセルロース分解活性はリグノセルロースの完全な糖化に重要である（Harris et al.による総説）。 基質中に存在するヘミセルロースの種類によって、それぞれの活性が必要とされる量は異なる。 したがって、T. reeseiの酵素レパートリーには、ある種のヘミセルロース特異的結合に対して明確な限界があることは注目に値する。 そのような欠落した活性の1つがα-キシロシダーゼである。 市販の T. reesei 酵素製剤に α-xylosidase を添加すると、前処理したコーンストーバーからのキシロースとグルコースの放出が促進された。 同様に、グルコマンナンとキシランに対して活性を持つGHファミリー5セルラーゼを添加すると、合成T. reesei酵素製剤が著しく改善された。 T. reeseiセルラーゼミックスに存在しない、あるいは非常に限定的な他の活性としては、エンドアラビナーゼといくつかのペクチナーゼ活性がある。 市販のセルラーゼミックスにこれらの酵素活性を補うことで、結果的に様々な基質の糖化を向上させることができた。 また、T. reeseiゲノムにコードされた分泌型ラッカーゼ様多価銅酸化酵素の生体内での機能についても未解明である。

タンパク質生産ホストとしてのT. reeseiの改良

セルラーゼや他のリグノセルロース分解酵素の大部分が協調的かつ条件的に発現するという事実から、その転写制御は菌によるセルラーゼ生産向上のための論理的エンジニアリングターゲットであると考えられる。 その制御因子の一つが、C2H2型転写因子であるCRE1である。 CRE1は、グルコースのようなより好ましい炭素源が存在する場合、その標的遺伝子の転写を停止させる。 CRE1の切断は、T. reesei QM6aのランダム変異導入プログラムによって、より高い基礎レベルおよび誘導レベルのセルラーゼ産生を示すRUT-C30株に到達した主な原因の1つであった。 同様に、主要なセロビオヒドロラーゼである cel7a のプロモーター領域の CRE1 結合モチーフを、既知のセルラーゼ活性化因子のモチーフに置換すると、炭素異化作用の抑制が減少し、活性化および抑制条件下で cel7a の転写が増加する。 さらに、セルラーゼ、キシラナーゼ、その他多くのリグノセルロース分解酵素遺伝子の転写は、Zn(II)2Cys6型転写活性化因子XYR1に厳密に依存する。 このことは、XYR1オルソログがキシラナーゼ遺伝子の発現を独占的に調節している放線菌Neurospora crassaやFusarium fujikuroiなどの他の真菌とは対照的である。 XYR1の切断型につながる突然変異が、Natickの突然変異誘発プログラムに由来するQM9136株のセルラーゼ陰性表現型を引き起こすことが判明した。 従って、セルラーゼ過剰生産変異体や過剰生産変異体は、転写活性化因子xyr1のmRNAのレベルが上昇している。 また、XYR1の過剰発現はセルラーゼの高発現をもたらし、グルコース存在下での異化率抑制を消失させることも証明されている . さらに、XYR1の推定制御領域内に点変異があると、同様に発現パターンが制御されることがわかった。 T. reeseiでは、XYR1とCRE1の他に、3つの転写因子ACE1、ACE2、ACE3がセルラーゼとキシラナーゼの発現を制御している … CRE1と同様に、ACE1はC2H2ジンクフィンガーリプレッサーであり、その欠失はセルラーゼとキシラナーゼの両方の産生を向上させる。 ACE2 と ACE3 は XYR1 と同様に Zn(II)2Cys6 型の転写活性化因子である。 ソフォロースによるセルラーゼの誘導は影響を受けないが、ce2が欠損すると、セルラーゼとキシラナーゼの転写がそれに伴って減少する。 ace3の欠損はセルラーゼの転写を完全に停止させるが、キシラナーゼの転写は減少させるだけである。 ACE2の過剰発現はまだ試みられていないが、ACE3の過剰発現は両酵素の活性を増加させ、他の6つの未知の制御因子の過剰発現も同様であった。 その中には、2つのZn(II)2Cys6型転写因子、2つのWD40蛋白、ブロモドメイン蛋白、gcn5関連アセチルトランスフェラーゼが含まれている。 Zn(II)2Cys6型転写活性化因子（XYR1、ACE2、ACE3）の3つは全て、よく知られているセレビシエのGal4タンパク質に類似している。 Gal4はGcn5を含むSAGA複合体をリクルートし、それによってヒストンアセチル化とユークロマチン形成を介して標的遺伝子の転写を促進することがよく知られている。 実際、T. reeseiのGcn5オルソログはセルラーゼの発現に必須であり、cbh1プロモーターにおいてヒストンのアセチル化に関与している。 近年、菌類におけるセルラーゼおよび関連するCAZymesの転写は、多くの転写因子の組み合わせによって支配されており、相反する活性化因子と抑制因子の影響を受けた複雑な転写制御ネットワークであることを示す図式が浮かび上がってきている。 例えば、Penicillium oxalicumでは、20の転写因子がセルラーゼ遺伝子の活性化または抑制を調節している。 その中で、ClrBは他のすべての制御因子とその標的遺伝子を統合する重要な因子として同定された。 これらの制御因子のホモログは T. reesei でも見つかっているが、植物の細胞壁制御における適応の多様性を考えると、他の異なる制御因子も重要な役割を果たすと予想される。 セルラーゼ制御におけるもう一つの鍵は、様々な菌類で二次代謝産物遺伝子群の制御に関与している謎めいた麹菌 LaeA の T. reesei のオルソログである。 この推定タンパク質メチル化酵素の欠失は、様々なセルラーゼや他のCAZyme遺伝子の強いダウンレギュレーションを引き起こすが、その過剰発現はそれらの発現を強く促進することができる。 同様の効果は、VELVET複合体のLAE1相互作用VEL1タンパク質でも見られた。

前述の研究のほとんどは、セルラーゼ生成の制御に関する基本的な洞察を提供する。 これらの研究のほとんどは、オリジナルのT. reesei分離株QM6aまたは中程度の過剰生産株QM9414で行われたため、これらの効果が過剰生産株で実行できるかどうか、どの程度実行できるかは不明なままである。 これらの菌株では、転写よりもむしろ、翻訳、分泌、分泌酵素のターンオーバーなどのプロセスが、セルラーゼ産生のさらなる増加を制限している可能性がある。 セルラーゼ遺伝子発現を改善するために報告された方法のいくつかを積み重ねることができるかどうか、そしてそのような株が、ランダムな突然変異誘発によって得られたハイパープロデューサーと比較したときにどのように機能するかは興味深いところである。 特に非真菌性タンパク質の場合、単に転写量を増やしただけでは産物が得られないことがある。そこで、高発現遺伝子のプロモーターとターミネーター領域に加えて、コードされているタンパク質を発現増強剤として用いる融合遺伝子法が有効である。 T. reeseiでは、セルラーゼ誘導条件下で最も強く発現するタンパク質であるcel7Aをコードするセロビオヒドロラーゼがこれに該当する。 これらの遺伝子融合は、一般にmRNAの安定性を高め、ERへの取り込みと分泌経路の通過を増加させると信じられている。 このため、CEL7Aの触媒モジュール、リンカー、CBMからなるモジュール構造を利用し、C-末端のCBMを目的の遺伝子で置き換えることが多い。 この遺伝子融合アプローチのバリエーションは、タンパク質のフォールディング、ジスルフィドブリッジ形成、グリコシル化をERで行い、その後、細胞外プロテアーゼによる目的の産物の分解を避けるために細胞内へのタンパク質蓄積を目指すものが利用できるようになった。 そのような戦略の一つとして、ER保持シグナルが付加されたハイドロフォビンをキャリアとして用いる。 これらの融合タンパク質はミセル様構造に自己集合し、界面活性剤ベースの水性二相系を使用して精製することができる。 さらに、タンパク質をERに誘導する戦略として、トウモロコシの貯蔵タンパク質に由来するγ-zeinペプチド（ZERA）を使用している。 同様に、これらの自己組織化融合タンパク質は、小胞体膜に囲まれたタンパク質ボディを形成し、タンパク質分解から保護される。 哺乳類タンパク質の効率的な生産宿主として菌類を開発するためには、発酵ブロス中で頻繁に遭遇するプロテアーゼを不活性化することも必要である。 抗体、インターフェロンα2b、インスリン様成長因子など、バイオ医薬品の分解に関連する様々な分泌プロテアーゼを系統的に同定し、そのいくつかを不活性化した。 その結果、プロテアーゼ活性が大幅に低下しただけでなく、3つの組換えタンパク質すべての安定性が向上し、特に抗体は最も顕著な効果を示しました。 N-グリコシレーションパターンを工学的に改変して、価値の高い治療用タンパク質を生産することは以前から試みられていたが、真菌の発現宿主で本物のヒトのグリコシレーションパターンを作り出すことは、今のところ実現可能とは思われない。 特にCHO細胞の急速な発達を考えると、このようなバイオ医薬品が将来的に菌類細胞工場で生産されるかどうかは疑問である。

上述のハイドロフォビンは、その表面活性のために大きな注目を集めた別のタンパク質群である。 これらの小さな細胞外タンパク質は、その両親媒性により疎水性/親水性界面でタンパク質層に自己集合し、疎水性表面を濡れやすくしたり、親水性表面を疎水性にしたりすることができる。 疎水性物質の分散、泡の安定化、表面への異なる分子のターゲティングなど、食品や医療への幅広い応用が期待されている。 セラトプラタニンは、4つの保存されたシステインを持つ小さな分泌タンパク質のグループである。 キチンやN-アセチルグルコサミンオリゴ糖に結合し、疎水性/親水性界面で自己組織化する性質を持っている。 疎水性タンパク質とは対照的に、セラトプラタニンは表面の極性・極性を向上させる。 また、様々なCAZymesに存在するCBMsには、ターゲティング機能があるとされている。 CBMは、結合している触媒ドメインの加水分解活性を向上させ、より好ましいpHと温度の最適値に導くことができる。 その糖鎖結合特性はさらに、例えばセルロースカラムを用いた融合タンパク質のアフィニティー精製に利用することができる。 このような、組換えCBMの幅広い用途については、最近、別のところでレビューしています。

Trichoderma reesei for consolidated bioprocessing and whole cell catalysis

Consolidated bioprocessing (CBP) は、古典的には、セルロース系エタノール生産プロセスにおけるセルラーゼ生産、酵素による加水分解、発酵工程を単一のユニット操作に組み込むことだと理解されています。 したがって、良好なセルロース分解特性と効率的なエタノール発酵経路を有する単一の生物が望ましいと考えられる。 しかし、微生物コンソーシアムを利用することも注目されている。 しかし、残念ながら、この2つの要件を満たす単一生物は、現在のところ存在しない（図2）。 そのため、エタノロゲンをセルロース分解に、あるいはセルロース分解生物をエタノロゲンにするための技術開発が行われている。 最初のシナリオでは、T. reeseiはしばしばCAZymeの遺伝子供与体として、特にその2つのエンドグルカナーゼをコードするcel5aおよびcel7bと2つのセロビオヒドロラーゼcel6aおよびcel7aについて用いられてきた（表1）。 すべての発表された研究において、S. cerevisiaeの分泌能力は比較的低いため、分泌型あるいは膜固定型の異種CAZymesによる基質変換は制限されている。 したがって、現実的なセルロース系基質で高いエタノール収率を得るには、市販の T. reesei 酵素カクテルで補う必要があった。 しかし、現在、S. cerevisiae の人工株の分泌能と表面表示能を向上させる努力が続けられているが、現在利用可能なセルラーゼ表示株は、バイオマス糖化に必要な酵素添加量を大幅に削減する可能性を既に持っている。 第二のシナリオでは、T. reesei 自身が有望な標的生物である。 しかし、この菌はもともと、バイオマスに関連するすべての糖を代謝してエタノールに変換する能力を持っているが、収量は低く、不要な副産物として酢酸が生成される。 一方、T. reeseiは商業用酵素生産に広く応用されているため、大規模な発酵レジームが確立されており、その遺伝子工学のための分子ツールも非常によく開発されている。 T. reeseiをCBP生物として利用するための残された大きな課題の1つは、そのセルラーゼや解糖系遺伝子のいくつかが、エタノール生産に必要な低酸素によって抑制されることである。 さらに、エタノール存在下でのセルラーゼの転写抑制は、克服すべきさらなる課題である。 しかし、セルラーゼ高発現株 RUT-C30 は、Natick 系列の株 QM9414 と比較してエタノール耐性が高いため、T. reesei を CBP として開発するための完璧なプラットフォーム株であり、特に炭素異化作用が抑制されていることが特徴である。 さらに、リグノセルロースパルプの存在下では、RUT-C30は発酵の初期段階でペレット状の形態を示し、これは界面活性剤Triton X-100を添加することで増殖に依存しない方法で達成でき、さらに高い酵素生産量につながる。 このことは、T. reeseiをCBP生物として使用する際に、糸状菌の増殖の結果、混合性が悪く、最大細胞密度が低いことがこれまで妨げになっていたので、重要である。 より一般的に言えば、統合バイオプロセスは、基質が必ずしもリグノセルロース系バイオマスではなく、キチンやデンプンなどの他のバイオポリマーで、生成物がエタノールではなく、他の代謝物である他の統合プロセスを説明するために使用することもできる。 このため、最近では、T. reesei の工学的手法により、さまざまな代謝物を過剰生産することを目的とした研究が数多く行われている（表 2）。 しかし、達成できた収量はほとんどの場合、商業化にはほど遠く、さらなる最適化が必要でした。

Tools for cell design and engineering

T. reesei および他のトリコデルマ種の分子ツールボックスに関する包括的なレビューが最近2件行われたが、この分野の最新の進歩を反映させるために、これらのレビューを更新したいと思います。 セルラーゼ産生能の向上や代謝工学を目指したターゲット株工学では、生物に直接的な遺伝子改変を導入する効率的な方法が必要である。 一般に遺伝子ターゲティングの効率が低いため、欠失カセットや発現カセットの相同組み込みによって適度な数の形質転換体を得ることは、長い間大きな課題であった。 この問題は、主に tku70 や tmus53 のような DNA 修復の非相同末端結合 (NHEJ) 経路の構成要素を不活性化することで解決されてきた。 Tku70 欠損株では、遺伝子ターゲティングが改善されているが、相同組み込みの効率は標的遺伝子座に よって異なるため、30 %程度まで低下する可能性がある。 この改良に基づき、特定のゲノム領域に発現カセットを挿入することで、ランダムな統合によって生じる多面的な影響を回避する新しいアプローチが数多く開発された。 Jorgensen らは、tku70 バックグラウンドを用いて、スクリーニングが容易な ade2 遺伝子座を優先的に組み込む発現プラットホームを開発した。 この遺伝子座に発現カセットを組み込むと、ade2が破壊され、得られた形質転換体は明瞭な赤色色素を形成する。 別の研究では、pyr4とasl1遺伝子座を選び、ウリジンとl-アルギニンのオーストロフィーを持つ株を開発し、これらの部位に直接組み込むことを可能にした。 Ouaedraogoらは、別の戦略で、S. cerevisiaeのI-SceIメガヌクレアーゼをT. reeseiで発現させた。 I-SceIは、あらかじめ定義された遺伝子座に導入されたI-SceI認識部位に人工的な二本鎖切断を生成し、形質転換と相同組込みの効率を向上させた。 さらに、I-SceIによる二重鎖切断とtku70欠失を組み合わせた研究も行った。 NHEJによる二本鎖切断の修復ができないため、カセットの組込みに有利であり、相同組換え効率は最大100%であった。 CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) /Cas9 システムによって、遺伝子操作やゲノム編集の革命がもたらされました。 このような技術の必要性と、酵素生産者としての重要性が高まる中、糸状菌であるT. reeseiで初めてこのシステムのテストが行われた。 このシステムは、特定のDNA二本鎖切断を導入して遺伝子ターゲティングを刺激し、Cas9（CRISPR associated）ヌクレアーゼにのみ依存し、単一のキメラガイドRNAを使用してターゲティングを行うものである。 このRNA誘導型Cas9の特定のDNA配列への正確なターゲティングは、単純な塩基対形成を介してガイドRNAのプロトスペーサー配列によって達成される。 遺伝子欠失コンストラクトに200bpの上下流フランキング領域を用いることで、90%以上のHR頻度に到達することができた。 また、1回の形質転換で二重欠損と三重欠損がそれぞれ45%と4%の頻度で発生した。 本研究では、in vitroで転写されたガイドRNAを欠失カセットとともにCas9発現T. reeseiに共形成したが、Nødvigらは、異なる麹菌でCas9酵素もコードする大きな転写物からガイドRNAを遊離させるために、二つのフランキングリボザイム配列を使用した。 組換えタンパク質の発現と株工学の両方に必要なもう一つの必須ツールは、制御可能な方法で遺伝子発現を可能にするプロモーターである。 セルラーゼプロモーター領域の異なる誘導性・抑制性プロモーターが多数存在するが、通常、発現が宿主代謝に連動し、プロモーター滴定効果により活性化剤が制限される可能性があるという欠点がある。 このような問題点を解決するために、T. reeseiのセルラーゼ遺伝子のうち、基礎発現強度の異なるl-メチオニン抑制性遺伝子を利用した。 これらのプロモーターの1つが、小麦ワラを含むいくつかの炭素源で、異なるレポーター遺伝子を抑制的に発現させることができることが示された。 同様の研究において、T. reesei の銅パーミアーゼ遺伝子のプロモーターを用いて、銅の非存在下で主要なセルラーゼおよびヘミセルラーゼ制御因子 xyr1 の発現を制御した. しかし、AAファミリー9の銅含有酵素がT. reeseiセルラーゼミックスの重要な構成要素であることを考えると、このシステムがセルラーゼ生産シナリオに適用できるかどうかは疑問である。 T. reeseiの系統開発は、長い間、この菌が無性であるために系統交配ができないと考えられていたことが障害となっていた。 この点で画期的だったのは、QM6aがMAT1-2の交配型遺伝子座を持ち、ある種のMAT1-1 T. reesei野生型分離株と容易に交配できることを見出したことである。 しかし、QM6aのMAT1-2遺伝子座をMAT1-1遺伝子座に置き換えると、元のMAT1-2 QM6a株と対峙してもストロマータは形成されない。 このため、QM6a 株に由来する様々な学術的・産業的な T. reesei 株において、交配を利用した株工学を行うことは不可能であった。 システム生物学的なアプローチにより、雌性不妊の原因となる欠失遺伝子を ham5 と同定した。 N. crassaでは、ham-5は、細胞融合時にMAPキナーゼの足場となるタンパク質をコードしている。 ハム5の機能的な導入により、QM6a株の間質形成が回復し、QM6aバックグラウンドに由来する他の株でも雌性稔性を回復させることができた。 この発見は、前述のH. jecorina分離株との交配により、分節性異数体子孫を得ることができるため、特に重要である。 このツールにより、例えばセルラーゼの過剰生産につながる関連変異を同定するための基礎が築かれた。 このことは、T. reeseiのような種では、突然変異の表現型を引き起こす遺伝子を特定する従来の相補的アプローチはほとんど成功しなかったので、重要なことである。 また、ハイスループットな配列決定と比較ゲノム解析により、セルラーゼ超生産菌と非生産菌のQM6a株における変異を容易に特定することができるが、これによって特定の表現型に変異が関連付けられたケースはすでに少数にとどまっている … しかし、多数の変異が見つかった場合や、変異が機能不明の遺伝子に影響を及ぼしている場合、比較配列解析では目的の標的遺伝子の性質が明らかにならなかった。 そこで、いくつかの研究者は、関連する突然変異を同定するために、次世代シーケンサーと組み合わせたバルクセグスタント分析を適用することに成功しました。 この方法では、変異体を基準株と交配し、目的の表現型を示す分離株のゲノムDNAをプールして配列決定する。 この配列決定されたDNAのプールと親株のゲノムを比較することにより、表現型に関連する保存された変異を明らかにすることができる。 表現型に関係のない突然変異は、あまり見かけない。 関連する変異に近い変異は通常共存しているので、この方法が単一の変異の同定につながることは期待できないが、さらなる調査の対象となる変異の数はかなり少なくなる。