Spectroscopic Methods
Absorbance Spectroscopy.comでは、酵素アッセイに関連する情報を提供しています。 酵素アッセイの中には、反応物や生成物をその吸光度特性に基づいて直接測定することが可能なものがある Fersht (1999). グルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼ (EC 1.1.1.49) が触媒する反応では、1つの生成物 (NADH) が340 nmで光を吸収するため、この波長での吸光度の増加を追うことで反応を監視できる。
グルコース6-リン酸 + NAD+ → 6-ホスホグルコン酸 + NADH + H+
他のケースでは、反応物や生成物は間接的に測定することになる。 例えばアセチルコリンエステラーゼ（EC 3.1.1.7）では、アセチルチオコリンが基質として用いられ、酵素に触れることでチオコリンが遊離される。 チオコリンはエルマン試薬と反応して発色し、吸光度の上昇を追うことで反応をモニターすることができる。
Acetylthiocholine + H2O → acetate + H+ + thiocholine
Thiocholine + エルマン試薬 → colored derivative
Coupled assayは酵素活性のモニターとして用いられることもある。 この場合、関心のある酵素反応と、測定に便利なようにカップリングされた第二の反応とが対になる。 この例は、ヘキソキナーゼ（EC 2.7.1.1）のアッセイにある。 この場合、過剰のグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼとNAD+をアッセイ混合物に含め、340nmの吸光度をモニターする。
反応I：グルコース＋ATP → グルコース6-リン酸＋ADP
反応II：グルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼとNAD+の反応
反応II: グルコース6-リン酸＋NAD＋ → 6-ホスホグルコン酸＋NADH＋H＋
この例では、反応Iが律速となり、グルコース6-リン酸の濃度はラグ期間を経て定常状態となるはずである。 Cleland Cleland (1979)は、カップリングアッセイが酵素の反応速度を正確に測定していることを確認するための手順を定式化した。 可能であれば、反応を連続的にモニターすることが望ましい。 上記のアッセイでは、分光光度計は、時間の関数として連続的な読み出しを与えるようにプログラムすることができる。 放射能、電気泳動、クロマトグラフィーなどの分離技術では、不連続またはエンドポイントアッセイが採用される。 アッセイに直線的な時間を設定した後、直線的な時間内の1つの時点（最も好ましくは、直線相の中間付近の時点）でパラメータを測定する。 その後、その時点と反応開始時点のシグナルの差から速度を決定する。 エンドポイントアッセイでは注意が必要であり、タイムコースをチェックして直線性を確認する必要がある。 温度、pH、基質濃度などのインキュベーション条件の変化は、アッセイの直線性を変化させることがある。 ルーチンの酵素アッセイでは、反応容器には1つの成分を除くすべての成分が含まれており、不足する成分（酵素または基質の1つ）を加えることで反応が開始される。 他の成分は、pH、温度、イオン強度の点で平衡化されている必要がある。 反応は通常、不足成分の濃縮原液を少量添加することで開始される。 少量の添加は、すでに確立された平衡条件を乱さないようにするためである。 少量の成分を加えることができない場合、分離した成分を同じ温度、イオン強度、pH にする必要がある。2 つの成分を完全に混合する必要があるが、激しく振盪すると酵素タンパク質を変性させる可能性があるので避けるべきである。 混合は、ストッパー付きのチューブを反転させるか、パラフィルムシール付きのキュベットを使用することで行うことができる。 希薄なタンパク質は濃厚なタンパク質よりも安定性が低いことが多いので、精製酵素を安定化させるために、ウシ血清アルブミン（0.25 mg/ml）のような不活性タンパク質の存在下でアッセイを行うことがよくある。 タンパク質が不活性であることを確認するための実験を行う必要があります。 アルブミンなどは疎水性の基質と結合することがあるため、この目的には必ずしも適さない場合があります。 不連続アッセイでは、タイマーをセットし、混合後、特定の時間間隔で試料を吸引することができます。 ほとんどの分光光度計では、検出は装置パネルまたはコンピュータのキーボードを使用して手動で開始されます。 キュベットに成分を添加する場合、キュベットを分光光度計にセットし、コンピュータのキーを押して検出を開始するまでに約20秒を必要とする。 ほとんどの反応では、アッセイは10分から30分程度で終了するので、この時間は通常あまり重要ではありません。 コントロール測定には、非酵素を含むブランクと非基質を含むブランクが含まれる。 このようなコントロールにより、不純物反応が起きていないことを確認することができます。 コントロール（非酵素ブランク）速度は、酵素反応の実速度を提供するために、実験によって生成された日付から差し引かれる。 多くのアッセイでは、生成物のさらなる生成を防ぐために、特定の時間に反応をクエンチまたは停止することが必要である。 例えば、所定の期間、5分間隔でサンプルを採取し、HPLCで生成物を測定することができる。
各クロマトグラフィー分析を完了するのに30分かかることもある。 反応を終了させる方法としては、通常、酸を加えて酵素を変性させるか、沸騰水槽に浸漬する方法がある。 金属酵素の中には、EDTAなどの金属イオンキレート剤で活性を消せるものがある。 ほとんどの酵素アッセイは分光学的手法に基づいており、最もよく使われるのは吸収と蛍光の2つである Fersht (1999)。 反応速度を追うために使用する波長は、基質と生成物の間で吸収の差が最も大きくなる波長であることが望ましい。 吸収測定は、試料を専用のセル（キュベット）に入れ、標準的な分光光度計で行われる。 1mlまたは3mlの試料を入れることができる使い捨てのプラスチック製キュベットが市販されている。 使用できる波長域は可視域（350～800 nm）に限られます。 350nm以下の波長域の測定には、石英キュベットを使用する必要があります（ガラスやプラスチックは紫外域の光を吸収してしまう）。 キュベットの光路長はメーカーから提供されています。 一般的な光路長は1.00 cm、0.40 cm、0.20 cmです。 底がプラスチックまたは石英でできている96ウェルマイクロタイタープレートで行うアッセイが増えてきています。 A = εcl,
ここでAは特定波長における試料の吸光度、cは試料の濃度、lは光路長、εは消衰係数、またはモル吸光率である。 εはM-1cm-1またはmM-1cm-1の単位を持つ。 ある物質についてεの値がわかれば、その物質の溶液中での吸収を測定することにより、溶液中の濃度を算出することができる。 また、ベールの法則を用いれば、反応に伴う濃度の変化率を算出することができる。 吸光度の測定は、有限な範囲の吸光度に対してのみ成り立つので、Beerの法則から逸脱することにより、誤差が生じる可能性がある。 したがって、1以上の吸光度では適用できない可能性があるため、実験値をこれより小さくするようにアッセイを設計する必要がある。 これらの問題のいくつかは、光路長の短いキュベットを使用することで回避できる可能性があります。 1.00cmのセルで1.00の吸光度を持つサンプルは、0.20cmのセルでは0.20の吸光度を持つことになります。 一般に、0.5程度の吸光度は、分光光度計に特有の光学ノイズを最小限に抑えつつ、測定に適したシグナルを得るための妥協点となります。 溶液の濁りは、光を散乱させ、見かけ上の吸光度を生じさせることがある。 これらの粒子を除去するために、ろ過や遠心分離が行われることがある。 直線性からの逸脱（吸光度が高すぎて分光光度計が正確に測定できない場合）は、光路長の変化で回避できる場合もあるが、多くの場合、逸脱は吸収種間の分子間相互作用に起因するものである。 二量体化（または高次のエキシマーの形成）は、吸収種の濃度が高い場合に起こる。 このような場合、生成物の濃度を下げるとBeerの法則に従うようになる。 これは反応を遅くする(酵素濃度を下げる)か、短時間で測定する(Beerの法則からの逸脱が起こる前に)かのどちらかで達成できる
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