Viral strains
HCoV-…229E (VR-740) と HCoV-OC43 (VR-1558) をヒト二倍体肺 MRC-5 線維芽細胞 (CCL-171) と WI-38 (CCL-75) で増殖させました。 それぞれ（すべてATCC、Manassas、VAから）。 両ヒト細胞株は、10％ウシ胎児血清（FBS）、2mM L-アラニル-L-グルタミン、100U／mlペニシリンおよび100μg／mlストレプトマイシン（Sigma-Aldrich Corp. St.Louis, MO, USA）を補充したMEM中で培養した。 ウイルス感染培地は、HCoV-229EおよびHCoV-OC43については、それぞれMEMまたはRPMI-1640に2%の熱不活性化FBSを加えたものであった。 ウイルス株は、80-90%コンフルエントになった24時間経過した宿主細胞を含むフラスコに接種することにより増殖させた。 1時間の培養後、細胞単層を洗浄し、新鮮な感染培地中で、HCoV-229Eについては35℃、HCoV-OC43については33℃で3日または4日間インキュベートした。 その後、作業用ウイルスストックを含む上清を遠心分離（300 g、15分）により回収した。 ウイルス力価は、明視野顕微鏡（10×）で細胞質の空胞化、細胞の丸み、スロッピングとしてスコア化した細胞病理効果（CPE）を評価して、50％組織培養感染量TCID50で決定した。
Bentop aerosol irradiation chamber
1-pass, dynamic aerosol/virus照射チャンバーを使用して、以前に記述したように、エアロゾル試料の生成、暴露および採取を行った23。 ウイルスエアロゾルは、高出力拡張エアロゾル呼吸療法ネブライザー（Westmed, Tucson, AZ）でウイルス溶液を加え、入力流量11 L/minの空気ポンプを使用して操作することにより生成した。 ウイルスはチャンバーに流入し、乾燥および加湿された空気と混合して湿度を約50～70％に維持した。 相対湿度、温度、エアロゾルの粒度分布は、運転中ずっとモニターされていた。 エアロゾルは遠紫外線に曝露され、最終的にBioSampler (SKC Inc., Eighty Four, PA) を用いて収集した。
遠紫外線ランプは紫外線曝露室から約22cm離れた位置に配置し、26cm × 25.6cm × 254μmの紫外線透過プラスチック窓 (TOPAS 8007 × 10, TOPAS Advanced Polymers Inc., Florence, KY) に照射した。 このチャンバーを用いた我々の以前の実験23と同様に、システムを通る流量は12.5 L/minであった。 紫外線照射領域の容積は 4.2 L であったため、各エアロゾルは窓を通過する際に約 20 秒間照射された。
Irradiation chamber performance
The custom irradiation chamber simulated the transmission of aerosolized viruses produced via human coughing and breathing.特注照射室は、人間の咳や呼吸によって発生するエアロゾルの感染をシミュレートしました。 照射室は全運転において平均相対湿度66％、平均温度24℃で運転されました。 平均粒径分布は、0.3μmから0.5μmが83%、0.5μmから0.7μmが12%、>0.7μmが5%であった（表3）。 エアロゾル化したウイルスは、明確なウイルス統合を示す対照（ゼロ曝露）から明らかなように、システムを介して効率的に伝達された（図 2 および 3、左上パネル）
遠赤外線ランプと線量測定
この研究で使用した遠赤外線源は、USHIO America製の12 W 222-nm KrClエキシマランプモジュール（商品番号9101711、Cypress、カリフォルニア）であった。 このランプには、222nmのKrCl発光ピーク以外のランプ発光を低減するための独自の光学フィルタリング窓が装備されている。 ランプは露光機の窓から22cm離し、窓の中心に向けて配置した。 光パワー測定は，818-UV/DB 低出力 UV エンハンスドシリコン光検出器と 843-R 光パワーメーター（Newport, Irvine, CA）を用いて実施した． エアロゾルの位置でチャンバー内のフルエンスを測定するため、実験を開始する前に線量測定を行った。
ランプと照射チャンバーの間の距離により、1つのランプで照射窓領域全体に均一に照射することができた。 シリコン光検出器による測定では、露光エリア全体で約90μW/cm2の露光強度を示した。 露光窓の反対側にはアルミの反射面を設けている。 このチャンバーでの以前の研究23 と同様に、この表面の反射率は約15%であった。 従って、露光エリア全体の強度を控えめに100μW/cm2と見積もった。 ランプが窓から 22 cm の位置にあり、エアロゾル粒子が露光窓を通過するのに必要な時間が 20 秒であることから、粒子への総露光量は 2 mJ/cm2 と計算された。 さらに、紫外線を透過するプラスチック窓のシートを追加して、露光領域全体の強度を均一に下げ、異なる露光条件を作り出しました。 これらのシートを用いた以前の研究では、65%に近い透過率を測定しましたが23、今回のテストでは、各シートの222nmの透過率を約50%と測定しています。 この透過率の低下は、経時的なプラスチックの光分解によるものと思われる4。 露光窓を覆うプラスチックシートを1枚または2枚追加すると、露光量はそれぞれ1mJ/cm2および0.5mJ/cm2に減少する。
Experimental protocol
先に述べたように23、ネブライザー内のウイルス溶液は、107-108 TCID50のコロナウイルスを含むModified Eagle’s Medium (MEM, Life Technologies, Grand Island, NY) 1ml、脱イオン水20ml、カルシウムとマグネシウムを含むハンクのバランス塩溶液 (HBSS++) 0.05ml から構成された。 照射室は、所望のRH値を確立するために、各サンプリング前に5分間、エアロゾル化したウイルス粒子を照射室およびバイパスチャネルに流した状態で運転した。 サンプル採取は、三方弁を使用してバイパスチャネルからBioSamplerへの空気の流れを変えることによって開始された。 バイオサンプラーには、エアロゾルを捕捉するために20 mlのHBSS++が最初に充填された。 各サンプリング時間（30分）の間、照射チャンバー内はプラスチック窓から入る222nmの遠紫外光に曝された。 エアロゾル粒子に照射される遠紫外線量は、上記のように紫外線透過性プラスチックフィルムを追加挿入することにより、0.5、1.0、2.0 mJ/cm2の3種類の試験線量を照射することで変化させることができた。 エキシマランプをオフにした状態でゼロドーズコントロールスタディを行った。 サンプリング期間終了後、バイオサンプラーからの溶液をウイルス感染性アッセイに使用した。
ウイルス感染性アッセイ
TCID50
ウイルス感染性の測定には、50%組織培養感染量アッセイを使用した28。 簡単に説明すると、実験の前日に96ウェルプレートの各ウェルに105個の宿主細胞をプレーティングした。 細胞をHBSS++で2回洗浄し、バイオサンプラーから露出したウイルスの感染培地での連続1:10希釈液を2時間、細胞に重ねた。 その後、細胞をHBSS++で2回洗浄し、新鮮な感染培地で覆い、34℃で3日または4日間培養した。 細胞障害作用（CPE）は，明視野顕微鏡（10×）で細胞質の空胞化，細胞の丸み，スロッピングとしてスコア化した。 TCID50はReed and Muench法28,38で算出した。 CPEスコアの確認のため、試料を100%メタノールで5分間固定し、0.1%クリスタルバイオレットで染色した。 結果は、ポアソン分布29を適用してPFU/ml = 0.7 TCID50に換算し、プラーク形成単位（PFU）/mlの推定値として報告した。
免疫蛍光染色
222nmの光量の増加により感染細胞数が減少するか評価するために、宿主のヒト細胞でウイルス抗原を検出する標準蛍光免疫染色プロトコルを実施した23。 簡単に言うと、実験の前日に、2×105 個の宿主細胞 (HCoV-229E では MRC-5 細胞、HCoV-OC43 では WI-38) を 48-well プレートの各ウェルにプレーティングした。 照射室を30分間通過させた後、BioSamplerから採取したウイルス懸濁液150μlを宿主細胞の単層上に重ねた。 細胞はウイルスとともに1時間インキュベートした後、HBSS++で3回洗浄し、新鮮な感染培地で一晩インキュベートした。 次に感染細胞を4℃の100％氷冷メタノールで5分間固定し、1％ウシ血清アルブミン（BSA；Sigma-Aldrich Corp.セントルイス、米国）を含むHBSS++中1：200の抗ヒトコロナウイルススパイク糖タンパク質（40021-MM07、Sino Biologicals US Inc.、チェスターブルック、PA）で穏やかに振りながら室温で1時間標識した。 細胞をHBSS++で3回洗浄し、ヤギ抗マウスAlexa Fluor-488 (Life Technologies, Grand Island, NY) 1:800 in HBSS++ containing 1% BSA, 室温で30分間、穏やかに振りながらラベル化した。 HBSS++で3回洗浄した後、細胞をDAPI（4′，6-ジアミノ-2-フェニルインドール）を含むVectashieldで染色し（Vector Laboratories, Burlingame, CA）、フォトメトリクスPVCAM高解像度、高効率デジタルカメラおよびImage-Pro Plus 6.0ソフトウェア（Media Cybernetics, Bethesda, MD）を備えたOlympus IX70蛍光顕微鏡の10X対物レンズを使用して観察した。 各222nmの線量とウイルス属について、代表的な結果を2回繰り返した。 各サンプルについて、DAPIとAlexa Fluor-488をマージした最大10視野の画像を取得した。
データ解析
ウイルスの生存率（S）は、それぞれの紫外線用量における割合PFU/mlをゼロ用量における割合（PFUcontrols）で割ることによって計算された。 S = PFUUV/PFUcontrols. 各繰返し実験について生存値を計算し、誤差分布を正規分布に近づけるために自然対数（ln）変換を行った39。 これらの正規化したln値を従属変数とし、紫外線量（D、mJ/cm2）を独立変数として、R 3.6.2 ソフトウェアで反復再重み付け最小二乗法（IWLS）40，41を用いたロバスト線形回帰を実施した。 この方法を用いると、ウイルスの生存は式4:
ここでkは紫外線不活化速度定数または感受性因子（cm2/mJ）であり、一次速度論によって説明された。 回帰は、切片項をゼロに設定し、各研究ウイルス株について別々に、紫外線量ゼロでの相対生存率100%の定義を表して行われた。 ゼロ線量でのデータは、定義上、ln = 0を表し、回帰に含めなかった。 各ウイルス株のkパラメータの不確実性（95％信頼区間、CI）は、各回帰法についてブートストラップにより推定した。これは、ここで用いたような小規模のデータセット（HCoV-229Eはn＝3、HCoV-OC43はn＝4）では、漸近正規性に基づく標準的な解析的近似と比較して、ブートストラップにより、より現実的な不確実性が推定される可能性があるからである。 適合度は決定係数(R2)によって評価された。 自己相関と異種分散の残差分析は、それぞれDurbin-Watson検定42とBreusch-Pagan検定（lmtest Rパッケージで実装）43を使用して行った。 各ウイルス株のパラメータ推定値（k）は、サンプルサイズ、k値、その標準誤差を用いて、95％CIに基づき、直接t検定で互いに比較された。 ウイルス不活性化断面積D90（曝露したウイルスの90％を不活性化する紫外線量）は、D90 = – ln/kとして算出した。 その他のD値も同様に算出した
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