Establishing temperature range
Macrostomum lignano培養によく用いられる条件、それは温度20℃、湿度60%、明暗周期14h/10hであった。 これらの条件は、主にワムシの主な餌である珪藻のNitzschia curvilineataの生育に最適であることから選ばれたものである。 実験に使用できる温度条件を評価するために、まずワムシが生存できる温度範囲を設定した。 冷凍保存は致命的だが、4℃で2週間以上保存すれば生存できることがわかった。 しかし、この条件下では珪藻が成長しないため、4℃は今後の実験から除外することにした。 その他、20 °C以下の温度も、成長と発達を促進する条件を見つけることが第一の目的であったため、実験対象から除外した。 一方、42 °Cで2時間飼育すると虫は溶解し、37 °Cで1週間培養すると死んでしまうという温度差がありました。 そこで、我々は20℃、25℃、30℃、35℃を実験条件とし、M. lignanoの長期間の温度影響を調べることにした（図1）
研究のデザイン。 DV1とNL10の2つの野生型株の胚と動物を20℃から35℃の温度範囲で培養し、発生時間、繁殖、再生時間、熱ショック反応、RNA干渉による遺伝子ノックダウン効率を測定した
熱ショック反応
どの温度が虫にストレス反応を誘導するかを調べるために、熱ショック20プロモータ (Mlig-hsp20) の活性をモニターした。 まず、20℃、25℃、30℃、33℃、34℃、35℃で定量RT-PCRを行い、Mlig-hsp20の発現量を測定した。 20℃と25℃の間でHsp20の発現量に大きな差は見られなかった（Fig. 2a）。 しかし、30 ℃では20 ℃に比べてわずか（2倍）ながら有意（P = 0.027, t-test）に発現量が増加した（Fig. 2a）。 33℃では10倍以上の発現量増加が観察され、試験した最高温度である35℃では100倍以上に増加した（Fig.2a）。 2回目の試験では、Mlig-hsp20プロモーターの制御下でmScarlet-Iタンパク質を発現するトランスジェニック株を作成し（図2b）、20℃から37℃までの異なる温度で2時間インキュベートした24時間後の蛍光レベルを測定した（図2c、d）。 図2
M. lignanoにおける熱ショック応答異なる温度でのMlig-hsp20遺伝子発現のqRT-PCR解析。 グラフは20℃での発現量に正規化した。 ns, P > 0.05; *, P ≦ 0.05; **, P ≦ 0.01; ***, P ≦ 0.001. 各条件で3つの生物学的複製を使用した。 エラーバーは95%信頼区間を示す b トランスジェニック熱ショックセンサー構築物KU#49の構造。 熱ショック応答性遺伝子 Mlig-hsp20 遺伝子のプロモーターが mScarlet-I の発現を駆動し、ユビキタス発現遺伝子 Mlig-EFA のプロモーターが mNeonGreen の発現を駆動し、遺伝子導入のポジティブ選択マーカーとして使用。 c hsp20::mScarlet トランスジーン発現の温度による蛍光強度 d hsp20::mScarlet トランスジーン発現計測に用いた NL28 トランスジェニック動物の画像例。 各温度におけるDICおよびdsRedチャンネルを示す。 スケールバーは100μm
胚発生速度
Morrisらによると、20℃で飼育した場合、マクロストマムの卵は完全に発生するまで約120時間（5日間）かかるとされる。 そこで、温度が胚の発生や孵化の速度にどのように影響するかを調べるため、産みたての胚を採取し、異なる温度で孵化するまでの発生を観察した。 遺伝的背景による潜在的な違いを調べるために、現在M. lignanoの研究の大部分に用いられている2つの系統、DV1系統とNL10系統を使用した。 これらの系統は、同じ地域の野生型個体群から独立に派生したものであり、全染色体重複によって異なるが、それ以外は実験室条件下で非常によく似た挙動を示す … 我々はまず、低温の影響を調べた。 4℃では卵の発育は停止し、少なくとも1ヶ月は保存可能であり、高温に戻せば発育を再開する。 次に、20 °Cから35 °Cの温度で、卵がどれだけ早く発育するかを調べた。 図3に示すように、標準状態（20 ℃）で保管した場合、卵は6日後に孵化を開始した。 温度を上げると、それに比例して胚の発達も早くなり、35℃では20℃に比べて2倍早く、3日で孵化した。 なお、20℃では8日間培養しても約10％の卵が孵化しないのに対し、高い温度では5％以下となり、試験した最高温度の35℃でも胚の生存に有害な影響を及ぼさないことが示唆された。
M. lignanoの異なる培養温度での胚発生の時間。 実験にはDV1（赤）とNL10（青）のM. lignano系統を用い、1条件あたり20個の卵をモニターした。 実験は3回繰り返した。 平均値±標準偏差を示す
繁殖
モデル生物にとって繁殖率は非常に重要な要素であり、世代時間が短い動物ほど遺伝実験でのデータ作成が早くなるため、繁殖率は非常に重要である。
M.リグナノの繁殖率に対する温度の影響を評価するために、異なる温度条件で飼育したワムシが5週間の間に生み出した子供の数を比較した。 実験は、胚発生後の様子を研究に取り入れるため、子ガメから開始し、DV1系統とNL10系統の両方を使用した。 20 °Cでは両系統とも子虫が成長し、最初の子孫を残すのに3週間かかったが、25 °CではNL10系統は2週間で子虫が確認されたが、DV1では確認されなかった。 30℃と35℃では、両系統とも2週間後にすでに子孫を産んでいた（図4）。 3週間以降、1週間あたりの子ガメの生産数は、20℃では200匹以下であったが、20℃以上では300匹以上となり、子ガメの数は30℃で飼育したワムシで最も多くなった。 これはどちらの遺伝的背景でも同様であり、DV1系統とNL10系統の間に有意な差は見られなかった（図4）。
Effect of incubation temperature on reproduction rate in DV1 and NL10 M. lignano lines. 各条件で20匹の子ガメを選び、その孵化した卵を1週間ごとに数えた。 実験は3連で行った
30℃以上の温度はより多くの孵化をもたらすが、熱ショック反応も活性化させる(Fig. 2)。 高温とそれがもたらす潜在的なストレスの長期的な影響を調べるために、選択した温度でワムシを飼育し、3ヶ月と6ヶ月の培養後に形態的な異常がないかモニターした。 25 °Cで飼育したワムシは、20 °Cで飼育したワムシと比較して、両方のチェックポイントで形態的な変化を示さなかった（図5）。 しかし、30 °Cと35 °Cの温度条件では、一般的な形態に様々な異常が観察された。 3ヶ月後には、DV1およびNL10系統の両方で、シストの増加、組織の損傷、精巣の肥大が共通して見られた（図5）。 35 ℃で飼育した虫はいずれも6ヶ月のチェックポイントまで生存せず、30 ℃で生存した虫はすべて形態異常を示した(Fig. 5)。 したがって、30℃以上の温度への長期暴露はM. lignanoにとって有害である。
高温への長期暴露がM. lignanoの形態に及ぼす効果． 20℃または25℃で最長6ヶ月間培養した後、目に見える異常はない。 スケールバーは100μm
再生時間
モデル生物としてのM. lignanoの最大の魅力はその再生能力なので、次に温度が再生にどう影響するのかについて調べた。 一般に、温度が高いと全体の代謝活性が上がると言われている。 そこで、精巣上部を切断したワムシが完全に体を再生するまでに要する時間に対する温度の影響を評価するために、精巣および精子特異的なELAVプロモーターの制御下でGFPを発現する、以前に確立したトランスジェニック系統NL22を用いて、精巣再生と精嚢内の精子出現を追跡した。 このようなトランスジェニックマーカーを用いることで、再生の程度をより正確に、一貫性を持って、効率的に評価することができる。 実際、切断後のGFPシグナルの出現時間を評価したところ、試験したすべての温度で有意な変動は観察されなかった（表1）。 20℃の再生時間を標準速度とすると，精巣の再生では，計算上の温度係数は25℃でQ10=4，30℃と35℃ではQ10=3であった。 このことから、25℃まで温度を上げると最大の効果が得られ、30℃では最も早く再生が行われ、再生時間に対する温度上昇の効果はそれ以上ないことがわかる。 そのため、M. lignanoの再生実験では、実験時間を2〜3倍に短縮できる25℃と30℃の温度を考慮する必要がある（表1）。
RNA interference
RNA干渉（RNAi）によって遺伝子発現をノックダウンする方法は、現在M. lignanoの機能喪失研究において最もよく行われているアプローチである。 この方法では、動物を標的遺伝子に対する二本鎖RNAに浸し、表現型を観察するためには、しばしば数週間の長期の処理が必要である。 我々は、温度がRNAi処理による表現型の発現速度にどのような影響を与えるかを調べた。 そのために、M. lignanoの細胞増殖に機能する遺伝子として知られるMlig-ddx39をノックダウンし、強固な致死的ノックダウン表現型を得た . 生殖試験と同様に、この実験にはDV1株とNL10株を用いた（表2）。 20 ℃では、Mlig-ddx39ノックダウンにより全ての動物が死亡するまでに約20日かかった。 25℃では11日、30℃では8日と、より高い温度で飼育した場合、より早く死亡した。 実験に用いた2つの菌株の間には、目に見える違いはなかった（表2）。 次に、ddx39 RNAi表現型の発現速度が高温になるほど速くなることが、RNAiによる遺伝子ノックダウンの効率が高いことに起因するのか、それとも他の要因に起因するのかを検討した。 このため、異なる温度でRNAi実験を開始した後、異なる時点でのMlig-ddx39の転写物の存在量をqRT-PCRで測定した（図6）。 gfpに対するdsRNAで処理した動物を参照対照として使用した。 すべての試験温度において、実験の過程で対照試料間のMlig-ddx39の発現レベルに有意な変動は観察されなかった（図6）。 同時に、Mlig-ddx39 dsRNA処理動物では、20℃または25℃での処理1日後にすでにddx39転写物のレベルが約80%低下し、30℃ではさらに約90%の低下が観察された。 しかし、その後の日数では、すべての温度でノックダウンレベルは約95%で安定した。 したがって、RNAiの動態そのものは温度に大きく影響されないと結論づけた。
qRT-PCRで測定したMlig-ddx39 dsRNAによる処理温度と期間の異なるMlig-ddx39遺伝子の発現水準。 gfpに対するdsRNAでの処理を対照として用い、グラフは所定の温度での対照処理動物における1日目のMlig-ddx39の発現レベルに正規化されている。 ns, P > 0.05; *, P ≤ 0.05; **, P ≤ 0.01; ***, P ≤ 0.001. 各条件で3つの生物学的複製を使用した。 エラーバーは95%信頼区間を示す。 Mlig-ddx-39で処理した動物はこの時期にはほぼ全て死んでいたため、30℃で7日目の測定は行わなかった
高温でのRNAi表現型の発現加速が他の遺伝子に一般化できるかどうかを調べるために、精子の形態異常と精巣の肥大を引き起こすMlig-sperm1遺伝子をノックダウンしたものを調べた . これは、20 ℃で2-3週間かかるゆっくりとしたRNAi表現型である。 RNAi処理4日目に、精巣が互いに触れ合う程度に肥大した動物の割合を数え、異なる温度での表現型の程度を定量化した。 (Fig. 7)。 Mlig-ddx39 RNAiの結果と同様に、温度が高いほど表現型の発達が早く、20℃ではdsRNA処理4日目で十分に肥大した精巣は観察されなかったが、25℃と30℃ではそれぞれ25%と85%の動物が肥大した精巣を発達させた（Table 2）。 したがって、再生と同様にM. lignanoでもRNAiの表現型は温度によって加速され、より高い温度で実験期間を短縮することができる。
dsRNAで4日間処理した後のMlig-sperm1ノックダウンの表現型． 20℃と30℃の精巣の大きさ（破線）の違いに注意。 スケールバーは100μm
である。