Alai

RTT線維芽細胞における不完全なオートファジーの活性化。 (a）20μMのCQの存在下または非存在下で、DMEMまたは飢餓培地（2時間）のいずれかで培養したRTTおよび健常線維芽細胞のWB分析（上図）。 フィルターは、抗LC3Bまたは抗GAPDH抗体でプローブした。 利用可能な細胞株（健常者とRTT線維芽細胞の両方についてn = 4）について行った3つの独立した実験の代表的なイムノブロットを報告する。 GAPDHに対するLC3B含有量のデンシトメトリー判定は、ImageJソフトウェアで行った（下段）。 結果は、3つの独立した実験の平均±S.E.である。 同一グループ内の異なる実験条件間の差は有意に異なる（*p < 0.05; **p < 0.001, one-way ANOVA, followed by Tukey’s test, n = 32）。 (b) CQ非存在下で飢餓培地で2時間および4時間培養した健常線維芽細胞とRTT線維芽細胞（いずれもn = 4）を、WBによりp62/SQSTM1およびPSMA-3含有量を測定した（上図）。 バンドの平均強度は，ImageJ ソフトウェアにより，β-tubulin（p62 用）および GAPDH（PSMA-3 用）の強度に正規化した（下段）。 表示された画像は、4つの独立した実験の代表である。 飢餓の4時間におけるRTT線維芽細胞の生存率がすでに低下していたにもかかわらず（図1参照）、この時間点は、通常遅れるp62の分解を追跡するために必要であった32。 結果は、三重に行った 4 つの独立した実験の平均値±S.E.である。 *,**,*Significantly different from the specific (see bars) experimental condition (*,* p < 0.05; **p < 0.001 one-way ANOVA; followed by Tukey’s test, n = 24)． (c) 健常線維芽細胞（上段）およびRTT線維芽細胞（下段）によるオートファジー活性化の免疫蛍光顕微鏡分析（両者ともn = 4）。 安静時（左）、飢餓時（中）、飢餓＋20μMのCQ（右）の細胞を抗LC3B抗体で染色した。 安静時ではオートファゴソームの検出率が低いため、飢餓状態でオートファジー誘導に陽性の細胞は、少なくとも10個のドットを表示したものの割合として定量化した。 結果は3回の独立した実験の平均値±S.E.である。 **特定の（棒グラフ参照）実験条件と有意に異なる（*p < 0.001; **p < 0.005, Unpaired τ Student’s test, n = 24）

標準培地で培養した健康線維芽細胞では、LC3B-Iは明確に免疫検出されたが、LC3B-IIは微弱であった。 CQ非存在下および存在下の標準培地で培養した健常線維芽細胞のLC3BIII/GAPDH比は同等であった（図2a、左図）。 この観察から、健常線維芽細胞では基礎的なオートファジーはほとんど検出されないことが示唆された（図2a、左図）。

これらの細胞を飢餓培地およびCQ非存在下で2時間培養すると、LC3B-II/GAPDH比は上昇し（60±4.8%, p < 0.05），CQ非存在下または存在下のいずれかの標準培地で培養した健常線維芽細胞（前述のとおり，同一であった）と比較して，その比が増加した（図2a，左および右パネル）． この挙動は、実際、LC3-I が実際に脂質化を受け、オートファジー活性化の初期マーカーである LC3B-II を形成したことを示している24,25,26,27,28,29,30。 このオートファジー活性化の有無を調べるために、CQ存在下の飢餓培地で2時間培養したところ、標準培地で培養した健常線維芽細胞に対してLC3B-II/GAPDH比がさらに増加（94 ± 5.5%, p < 0.001）した（図2a、左右のパネル）。

さらに、CQ非存在下および存在下の飢餓培地で培養した健常線維芽細胞のLC3B-II/GAPDH比の差は統計的に有意だった（p < 0.05、Fig. 2a, left panel）

したがって、WB分析によるLC3B-IIパターンの標準的な解釈によれば、全体として、栄養がない場合、健康な線維芽細胞はオートファゴソームの形成を刺激し、CQの存在下で蓄積を受けることが示された。 この挙動は、正常なオートファジー流束24,25,26,27,28,29,30と一致する。 興味深いことに、標準培地で培養したRTT線維芽細胞の場合、LC3B-Iは明確に免疫検出されたが、LC3B-IIはCQ非存在下および存在下の両方の細胞で非常に微弱だった（図2a、左パネル）。 飢餓状態でも CQ 非存在下でも，RTT 線維芽細胞で LC3B-II に相当する微弱なバンドが出現したのは，フィルターを長時間曝露した後であり，少なくとも LC3B-I の最小限の脂質化が起こったことを示唆している（図 2a，左側パネル）． したがって，CQ 非存在下の飢餓培地で増殖した RTT 繊維芽細胞の LC3B-II/GAPDH 比は，CQ 非存在下の標準培地で増殖した RTT 繊維芽細胞のそれに対して増加した（93 ± 5.5%，p < 0.001）（図 2a，右図）．

しかし，飢餓培地で培養したRTT線維芽細胞にCQを投与しても，LC3B-II/GAPDH比はさらに増加せず，CQ非存在下で標準培地で培養した細胞と比較すると増加したが（95 ± 3.5%, p < 0.001），CQ 非存在下で飢餓培地で培養したRTT線維芽細胞の LC3B-II/GAPDH比に対しては有意差なく増加した（図2A, 左パネル）． この発見は、RTT細胞ではオートファゴソームの蓄積が起こらないことを示唆し、WB分析はオートファジーフラックスにおけるあるレベルでのブロックを支持した24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31。

オートファジーフラックスの欠陥の可能性に関する我々の仮説をさらに強化するために、CQ非存在下で2時間と4時間飢えた健康およびRTT線維芽細胞の、2つの認められたオートファジー報告基質の分解、すなわちを確かめた。 (i) p62/SQSMT1タンパク質は、ポリユビキチン化タンパク質凝集体のクリアランスを補助し、それ自体はリソソームヒドロラーゼによって分解される36; (ii) 20Sプロテアソームは、飢餓状態で速やかに分解される37、38。 健常線維芽細胞では、2つのタンパク質の基底レベル（すなわち時間0）に関して、p62/チューブリン比（4時間後44 ± 10%、p < 0.001）およびPSMA-3/GAPDH比（すなわち20Sプロテアソームのα7サブユニット）の経時減少（2時間後45 ± 3.1%, 4時間後11 ± 5.2%, いずれの場合もp < 0.001）が観察されている（図2b、上図参照）。

RTT線維芽細胞の場合、p62/チューブリン比の経時的減少は4時間後（89±9%）でも統計的に有意ではなかったが、2時間後（81 ± 4.4%, p < 0.05） と4時間後（78 ± 5.1%, p < 0.05 ）でのPSMA3/GAPDH比の減少はタンパク質の基礎レベル（すなわち時間0）と比較すれば有意差があった（図2b、下図）。 しかし、p62/チューブリン比の場合は4時間後にのみ健常群とRTT群の差が統計的に有意であった（p < 0.05）のに対し、PSMA3/GAPDH比は2時間後（p < 0.05）でも実験群の間で有意差があった。興味深いことに、p62染色およびPSMA3染色の内部コントロールとしてそれぞれ使用したβ-チューブリンおよびGAPDHパターンは、健常線維芽細胞において飢餓の4時間にわたって変化していないことがわかった。 しかし、β-チューブリンバンドの強度およびGAPDHバンドの強度は、4時間飢餓させたRTT線維芽細胞において、これらの細胞の時間0または時間2において観察されたものと比較して著しく減少した（図2b、上段）。 この減少は、おそらくこの時点で採取した生きたRTT線維芽細胞の数が少ないためであり（図1aで報告した4時間の飢餓状態でのRTT線維芽細胞の生存率の低さと一致する）、時間経過によるβ-チューブリンのダウンレギュレーションによるものではなかった。 全体として、RTT線維芽細胞はこれらのオートファジー報告基質を効率的に分解しないことがわかり、オートファジーの欠陥という仮説を支持した。

このブロックの特徴にさらに光を当てるために、LC3B抗体を用いて免疫蛍光分析を行った。 CQ非存在下の標準培地（静止状態）および20 µM CQ存在下または非存在下の飢餓培地で2時間培養した健常線維芽細胞とRTT線維芽細胞を分析した（図2c）。 初代細胞の代謝速度が遅いことと一致して、安静状態の健常線維芽細胞とRTT線維芽細胞は、10個以上のドット（すなわちオートファゴソーム）を示す細胞の割合が低く（それぞれ8±5%と1±0.5%）、免疫蛍光法で、図に報告したデータと一致して基礎オートファジーはあまり検出されないことが分かった。 2a.

標準培地で培養した細胞に関して、少なくとも10個のLC3B+オートファゴソームを表示する飢餓培地（CQの非存在下）で培養した健康線維芽細胞の割合は著しく増加し（82±10％、p<0.005）、一方、飢餓培地で培養したRTT線維芽細胞はわずかに増加（17 ± 8% 、p<0.001）していることが示された。 実際、飢餓培地で培養した健常線維芽細胞では、少なくとも10個のオートファゴソームを示す割合が、同じ実験条件で培養したRTT線維芽細胞よりも有意に高かった（p < 0.005）。 オートファゴソームは主に核周辺に局在していた。 CQの存在下では、予想される拡散した強いLC3B+染色がさらに観察されたが、この場合、拡散した染色はドット数を正確に定量することはできなかった。

CQの投与はRTT線維芽細胞では効果がなく、オートファゴソーム生合成が著しく損なわれていることが明らかになった（図2c）。

オートファゴソーム生合成に関する推定上の障害の関連性を考慮して、この観察を確認するために追加のアプローチが採用された。 CQ非存在下で2時間飢餓状態にした健常線維芽細胞とRTT線維芽細胞の両方を、オートファゴソーム膜の特異的色素（Cyto-ID）で染色し、免疫蛍光法で分析したところ、オートファゴソームの生合成に障害があることがわかった。 この場合でも、健常線維芽細胞では実際にいくつかのオートファゴソームが検出されたが、RTT線維芽細胞では限られた数の小さな孤立した小胞しか観察されなかった（補遺図S2）。 健常線維芽細胞とRTT線維芽細胞の間で、少なくとも5つのCyto-ID陽性ドットを表示する細胞の割合の差は著しく有意であった（それぞれ80 ± 4% vs 8 ± 6%, p < 0.001） 。 したがって、全体的な解析は、RTT初代線維芽細胞においてオートファゴソーム生合成の欠陥が生じるという証拠を提供した。

MeCP2 R255X変異を持つRTT患者の成熟赤血球はミトコンドリアを保持している

次に、RTT患者においてオートファジー欠陥の別の兆候が生体外で観察され得るかどうかを調べました。 ミトコンドリアのクリアランスは、赤血球への成熟の最終段階で循環網状赤血球で起こる古典的なオートファジーに基づくメカニズムであるという事実から32,33,34、我々は調査を生体外のヒト赤血球にも広げ、これらの細胞でミトコンドリアが保持されているかを検証した

したがって、RTT患者（n = 15）および健康ドナー（n = 11）の赤血球は透過電子顕微鏡（TEM）で分析された。 TEM調査の結果、RTT患者の大部分（15人中11人）から分離した二凹型の赤血球にミトコンドリアに似た構造（SRM）が存在することが浮き彫りになった。 これらの11人のRTT患者のうち、3人は最も重篤な症状を示し、赤血球の頻度も高かった（20±4％）（Fig.3a-h）。 予想通り、健康な赤血球ではSRMは検出されなかった（Fig. 3I）。 健常者とRTT被験者の間の差は統計的に有意であった（p < 0.0004; 図3下段）。

TEM取得によるRTT患者の成熟RBCにおけるミトコンドリアの表示。 上段。 RTT患者（n＝3）および健常者（n＝3）（右下）の赤血球の透過型電子顕微鏡の取得画像。 R255X MCP2変異を持つ患者のRTT赤血球では、異なる形状のミトコンドリアに似た構造（SRM）が有意な頻度で観察された（15人中合計3人）（a-h）。 これらの構造は健常者では検出されなかった(i)。 画像は20,000×から60,000×の範囲で異なる倍率で取得された。 下段。 統計解析。 10フィールドで少なくとも1つのSRMを示す赤血球の数をカウントした。 3111>

IF によるRTT患者の成熟RBCにおけるミトコンドリアの同定。 上段。 R255X MeCP2変異を有するRTT患者（n＝3）（左パネル）および健常者（n＝3）（右パネル）から分離したRBCの免疫蛍光顕微鏡による分析。 赤血球はサイトスピニングによりガラスに付着させ、抗COX-IV抗体でプローブした。 RTT赤血球はCOX IV+の点線パターンを示したが、健常赤血球では検出されなかった。 明視野撮影により、赤血球の正常な二凹型が強調された。 実験は同じ血液検体を用いて3回に分けて行った。 下図：少なくとも1個のミトコンドリアを表示している赤血球の割合を10個の異なるフィールドで計算した（左パネル）；赤血球あたりのミトコンドリアの平均数を異なるフィールドの各赤血球の点の数をカウントすることによって計算した（右パネル）。 結果は平均値±S.E.である。**対照と有意に異なる（**p < 0.005, unpaired τ Student’s test）。

これらの結果をさらに確かめるために、抗CD71 (transferrin receptor) 抗体および抗COX-IV抗体を用いて、健康人とRTT患者3人の赤血球の細胞蛍光分析が行われた。 未熟な赤血球のマーカーであるCD71の陽性頻度は、健常者とRTT患者で有意差はなかった（1.34 ± 0.13% vs 1.03 ± 0.3%; Supplementary Fig. S3）。 この研究に参加したRTT患者は、正常な血液学的パラメータを示し、網状赤血球指数が、少なくとも数人の被験者で、健常者に見られるものよりも低かったにもかかわらず、2つの患者グループの間の全体の差は統計的に有意ではなかった（表1）ことを強調しておく必要がある。 逆に、健康な赤血球では非常に微弱なCOX-IV+集団が観察されたが、RTT赤血球ではより高い頻度でCOX-IV+細胞が検出された（それぞれ0.056 ± 0.004% vs 1.15 ± 0.19%, p < 0.01 ）。 これらの結果は、ミトトラッカー・グリーン（MT）染色（補足図S3）によりさらに確認され、RTT患者（R255X MeCP2変異を有する）1人と健常者1人でMT+赤血球の増加（0.37％対0.16％）を記録し、以前に述べたCOX- IV抗体で認められたのと同様であることが示された。

SRMの同一性をさらに検証するために、同数の赤血球を溶解し、変性および還元条件下でWBにより分析しました。 フィルターは、ミトコンドリアマトリックスに特異的に発現する脱アセチル化酵素であるサーチュイン-3に対する抗体で染色された40。 サーチュイン3は、COX-IVや他のミトコンドリアマーカーとは異なり、電気泳動パターンにおいてヘモグロビン鎖やヘモグロビンオリゴマーと分子量が重ならないことから、このアプローチでミトコンドリアマーカーとして選択された。 調査した3人のRTT患者において、サーチュイン-3/GAPDH比は、健康な赤血球からのライセートにおける同じ比に対して、各患者で統計的に有意な増加が観察された（p < 0. 001）（補足図S4）。

これら3人の患者はすべてMeCP2突然変異（すなわち、R255X）を持ち、最悪の表現型を示し、赤血球の非常に高い割合は少なくとも一つのミトコンドリアを示していた。 しかし、患者数が非常に限られているため、疾患の重症度と成熟赤血球内のミトコンドリア保持の程度との関係の可能性について、統計的に有意な結論を導き出すことは困難であった。 もう一つのポイントは、先に引用したUlk1-/-およびNix-/-マウスモデルにおいて成熟赤血球内にミトコンドリアが保持されると、脾臓マクロファージによるこれらの異常赤血球の除去が増加することによって、貧血や他の血液病変が引き起こされると思われる点である32,33。 この研究で登録されたRTT患者では、血液学的値の非常に限られた、統計的に有意でない低下のみが記録され、貧血や他の血液病変を患っていないようであった。 我々の結果とマウスモデルからの結果の相違は、マクロオートファジーまたはマイトファジー遺伝子（すなわち、それぞれUlk1-/-およびNix-/-マウス）のノックダウンにより、ミトコンドリア保持赤血球の非常に高い割合と赤血球内のいくつかのオルガネラの保持が引き起こされるという事実による可能性があるが、これはRTT患者で報告されたものと比較してかなり深刻な欠陥である32,33。 R255X変異を持つ患者では、ミトコンドリア保持赤血球の数が著しく多いことが観察されたにもかかわらず（図4）、RTT赤血球では各細胞内のオルガネラの数が非常に少なかった（図4）。 このことは、赤血球の形態的・機能的な大きな変化を引き起こすには十分でないのかもしれない。 赤血球内のミトコンドリアの滞留は、RTT赤血球で観察されるエネルギー状態および代謝の著しい変化に伴う深刻な酸化還元不均衡を決定する少なくとも一つの要因である可能性は言及に値する（すなわち…）。 ATP/ADPおよびNADH/NAD比）、最近の研究では、ヘモグロビンへの酸素結合および酸素拡散の動態は、健常者のそれとほぼ一致することが報告されている16,17,23,41。

マウスモデルから得られた結果と我々の結果の明らかな不一致は、RTT症候群がほとんど女性のみに影響を与えるX連鎖障害であり、X染色体の2コピーのうちの片方の不活性化（XCI）が胚発生時にランダムに起こる現象であることも広く報告されていることから説明がつくかもしれない42, 43. したがって、RTT症候群の場合、ランダムなXCIは、体細胞において、細胞の半分が野生型アリルを発現し、残りの半分がMeCP2遺伝子の変異アリルを発現するモザイクを生じさせることが予想される。 興味深いことに、少なくともいくつかのMeCP2変異が神経組織における非ランダムなXCIと関連している可能性は、RTT患者（およびRTTの身近な症例）の表現型の多様性と一致し、この特徴は広く記録されている42,43。 理論的には、骨髄の血液学的前駆細胞の半分がMeCP2突然変異を持つX染色体を保持していれば、循環する成熟赤血球の半分だけが病的対立遺伝子を持つことになるので、循環するミトコンドリア保持赤血球の数が制限されることになる。 それにもかかわらず、散発性RTT患者の循環白血球では、野生型アレルを好む非ランダムなXCIの有病率が増加していることが観察されている42,43。 この点に関して、ミトコンドリア保持赤血球の数が少ない患者が、マイトファジーの障害や非ランダムXCIもそれほど大きくなく、野生型MeCP2対立遺伝子を持つ血液学的前駆細胞が積極的に選択されることになるのか、あるいはならないのかを論じることは非常に困難であろうと思われた。

したがって、RTT病理の複雑さを考慮すると、RTT患者は、ピアソン症候群の患者とともに、ヒト成熟赤血球におけるミトコンドリア保持の最初のケースであると主張することが好ましい44。

Evidence of defective autophagy in the cerebellum of Mecp2-null mice

RTTが神経発達障害であることから、全身性のオートファジー障害を指摘する我々の結果をさらに裏付けるために、我々は小脳（すなわち、ユビキチン）のp62およびユビキチンの免疫組織化学分析を実施した。9週齢の野生型マウス、5週齢（無症状）および9週齢（有症状）のMecp2 -/y マウスの小脳（ミトコンドリア変化などの主要な組織異常が観察される器官）21,45について、p62とユビキチンの免疫組織化学的解析を行った。 各実験条件について、3匹から単離した臓器を解析した。 RTT小脳はwtと比較して、全層（顆粒層、プルキンエ層、皮質層）でp62（図5a）およびUb（図5b）の染色強度が増加し、それは動物の年齢とともに直線的であった。 さらに、高染色構造は、細胞内凝集体に類似していた。 p62/SQSTM1およびUbの染色強度を半定量的に評価したところ、5週齢動物と健常動物、9週齢動物と5週齢動物の小脳の間で統計的に有意な差が認められた（p＜4891＞0.05）。

RTTのマウスモデルの小脳におけるオートファジー報告基質の蓄積を示した。 9週齢の野生型マウス、5週齢（無症状）および9週齢（症候性）のMeCP2ノックアウトRTTマウスの小脳の免疫組織化学分析（各実験群についてn＝3）。 3つの実験条件について、異なる動物から単離した臓器を調査した。 各臓器のスライス（n = 4）を抗p62/SQSTM1（a）および抗Ub抗体（b）でプロービングした。 RTTマウスの小脳全層で、p62/SQSTM1とUbの両方の染色が、野生型動物の小脳と比較して、年齢的に直線的に増加していることが観察された。 (c) p62/SQSTM1およびUbの免疫反応性を半定量的に評価し、任意の単位で表した棒グラフである。 結果は平均数±S.E.で表され、観察者間の再現性は±95％であった。 5週齢マウスの小脳の染色性を野生型マウスのそれと比較し、9週齢マウスの染色性を5週齢マウスのそれと比較した。 差はStudentのτ検定で評価し、p値≦0.05で有意とした。

無症状動物と有症状動物の組織学的差異は、オートファジー変化は出生時には無いか弱いが、生後数週間で徐々に増強し（おそらくMeCP2活動がピークに達すると）症状を発生させる可能性を示唆するものだった。