細胞内小胞と細胞外環境を酸性化し、多くの生命機能に関与するマルチサブユニットATPase（V-ATPase）は、プロトンポンプとして知られています。 V-ATPaseの構造と機能については、これまでのレビューでエレガントに説明されている。 ここでは、V-ATPaseの機能と正常な生理学における様々な細胞プロセスへの貢献に関する最近の文献を、癌に重点を置いてレビューする。 また、V-ATPaseによるNotchや他のシグナル伝達経路の制御について詳しく紹介し、これまであまり知られていなかったV-ATPaseの細胞シグナル伝達の機能を明らかにする。
Subunit isoforms
構造的にはV-ATPaseは複数のサブユニットからなる回転式ナノモーターで、それぞれが複数のアイソフォームを持つ． サブユニットは、ATP加水分解を担う周辺ドメインV1と、プロトン移動に機能する膜貫通ドメインVOの2つのドメインに分かれて配置され、V1ドメインはATP加水分解を、VOドメインはプロトン移動に機能する。 V-ATPaseの構造は真核生物の細胞間で高度に保存されており、生物種を超えて多様な機能に関与している。 哺乳類では、V1ドメインは8種類のサブユニット（A, B, C, D, E, F, G, H）から構成されているのに対し、VOドメインは6種類のサブユニット（a, c, c’, c”, d, e）から構成されている。 細胞内小胞と細胞外環境における酸性化の要求の違いにより、V-ATPaseの機能と制御が行われている。 V-ATPaseは、ATP加水分解とプロトンポンプの結合を制御し、ポンプ効率を低下させたり増加させたりしている。 このプロセスは、V-ATPaseのa’サブユニットによってもたらされる。 同様に、V-ATPaseの細胞およびコンパートメント特異的なターゲティングも、「a」サブユニットのアイソフォームに依存している。 VOaは100kDaの膜タンパク質で、N末端の細胞質側の尾部と9つの膜貫通ドメインを持っている。 a’サブユニットには4つのアイソフォーム（a1、a2、a3、a4）が存在し、小胞体および細胞型に明確に分布していることが確認されている。 VOa1はシナプス小胞に、VOa2はゴルジ体や初期エンドソームのような細胞内小胞に発現している。 VOa3は破骨細胞の細胞膜に、VOa4は腎間充織細胞の細胞膜に発現している。 さらに、サブユニットaのN末端は、V1ドメインを膜に繋ぎ止める重要なモチーフであり、リソソームにおけるユニークなpHセンサーであることも報告されている。 サブユニット’a’の発現とアイソフォームの局在はV-ATPaseの機能にとって重要である。
V-ATPaseの生理機能
V-ATPaseは至る所に発現し、小胞、ルーミナル、細胞外の酸性化を通じてほとんどの組織の細胞内で多様な生物学的機能を担っている．
小胞の酸性化
エンドソームとリソソーム
V-ATPaseは、エンドソームやリソソームなどの細胞内小胞の酸性化における役割で最も知られています。 エンドソームの表面でV-ATPaseは酸性化し、それによって受容体エンドサイトーシスや小胞輸送のような重要な細胞プロセスを調節している。 V-ATPaseによるエンドソームの酸性化は、受容体リガンド複合体のエンドサイトーシスによる内包に不可欠である。 シグナル伝達が開始された後、エンドソームのpHが下がるとリガンドが放出され、細胞膜に再還元される。 リソソームでは、V-ATPaseは4.5の低いpHを維持するのに役立ち、また新しく合成された酸性加水分解酵素をゴルジ体からリソソームへ輸送するのに重要である。 さらに、マクロファージや腫瘍細胞のファゴソームやオートファゴソームも、これらのコンパートメントの分解酵素の活性のために、V-ATPaseによって維持される酸性のpHに依存している。 重要なことは、ほとんどのタンパク質がゴルジ装置で重要な翻訳後修飾であるグリコシル化を受けるということである。 V-ATPaseのa2サブユニットの変異は、常染色体劣性遺伝のしわしわ皮膚症候群であるcutis laxaを引き起こし、細胞外マトリックスタンパク質のグリコシル化障害が観察される。
特殊小胞
V-ATPaseは、特定の細胞種の特殊な区画に発現する主要なタンパク質であり、V-ATPaseのサブユニットを持つゴルジ体もその一つであった。 神経伝達の間、V-ATPaseはシナプス小胞の形成とそれに続く神経伝達物質の蓄積に必要な重要なプロトン運動力を提供する。 膵臓細胞では、V-ATPaseによる酸性化は、インスリンのエキソサイトーシスに重要である 。 V-ATPaseはまた、Soluble NSF Attachment protein Receptor (SNARE) やGTPaseと相互作用して小胞システムの分裂と融合のバランスを制御している。
内腔酸化
V-ATPaseは当初、細胞内小胞で確認されたが、細胞膜V-ATPaseの重要性も非常に高まってきている。 腎臓の近位尿細管上皮細胞では、V-ATPaseのa4アイソフォームが酸塩基平衡と尿の酸性化（全身性アシドーシス）を維持している。 同様に、精巣上体の透明細胞では、細胞膜V-ATPaseが管腔区画を酸性化し、精子の成熟と貯蔵に役立っている . 骨の破骨細胞では、リソソームのV-ATPaseが骨吸収の際に細胞膜に転移して、ラクナを酸性化する . 形質膜 V-ATPase は、耳の歯間細胞、鼻の上皮細胞、視覚の機能に重要である。 V-ATPaseの機能不全は、腎尿細管性アシドーシス、難聴、嗅覚障害、骨粗鬆症などの病的状態に関連している。小胞および内腔の酸性化におけるV-ATPaseの役割の概略を図に示した。 図1
内腔の酸性化におけるV-ATPaseの生理学的な役割。 V-ATPaseの関与は、骨吸収、腎機能、精子成熟、自然免疫反応および神経伝達を含む多くの特殊な細胞プロセスに関与していることを概説する。 a 骨吸収。 破骨細胞の細胞膜に存在するV-ATPaseは、骨吸収の際に骨脱灰のための細胞外酸性化を媒介する。 腎臓では、頂膜に発現するV-ATPaseのプロトンポンプ活性により、間質細胞が全身の酸性化を維持し、尿の酸性化を実現する。 c 精子の成熟。 精巣上体では、V-ATPaseを発現する透明細胞が内腔を酸性化し、精子が適切に成熟し運動するために重要なプロセスである。 d 自然免疫反応 V-ATPaseを介した小胞の酸性化は、好中球顆粒の輸送とエキソサイトーシスに重要な役割を果たす。V-ATPaseは単球と活性化リンパ球の細胞膜に構成的に発現し、pH関連の炎症反応に寄与する。 e 神経伝達。 V-ATPase は、シナプス小胞の形成とそれに続く神経伝達物質の蓄積に必要な重要なプロトン運 動力を提供します。 V-ATPaseは、分泌性シナプス小胞における神経伝達物質の蓄積に必要な重要な電気化学的電位を提供する
癌における役割
最近、細胞膜V-ATPaseは、癌において広く研究されており、成長に適した細胞内アルカリ性環境と浸潤に適した酸性細胞外環境を保つのに役立つと言われています。 腫瘍では、乳癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、肝臓癌、膵臓癌、メラノーマ、食道癌の増殖する癌細胞の最先端でV-ATPaseの発現が高いことが示されている . 具体的には、乳癌細胞は細胞外空間を酸性化するためにV-ATPaseを細胞膜上に発現しており、V-ATPaseの量的発現は細胞株の浸潤性、転移能と相関しています . V-ATPaseの腫瘍増殖への正確な貢献は、以下に述べる分子メカニズム/パスウェイへの影響によって達成される。
免疫調節
空胞ATPaseのa2アイソフォーム（VOa2またはa2V）は、妊娠およびがんにおいて免疫調節の役割を担っている。 生殖生物学におけるa2Vの研究は、胚の着床に加えて、正常な精子の成熟と生産におけるこの分子のこれまで知られていなかった役割を明らかにした。 腫瘍の微小環境では、a2VのN末端ドメインがマクロファージを腫瘍関連マクロファージ（M2タイプ）に極性化し、エンドサイトーシス経路を通じて様々な単球サブセットを刺激することがわかった。 さらに、腫瘍細胞におけるa2Vの欠損は、腫瘍微小環境における常在マクロファージ集団を変化させ、in vivoでの腫瘍増殖に影響を与えることが明らかになった。 a2Vは好中球の一次顆粒に発現し、好中球活性化中の外分泌経路のpH維持に寄与している。 a2VのリコンビナントN末端ペプチド（a2NTD）でヒト好中球を処理すると、好中球の移動と分極が促進される。 6171>
Warburg effect
癌の特徴として、細胞が酸化的リン酸化から好気的解糖に移行するWarburg効果が挙げられます。 いくつかの研究では、癌細胞は、Na+H+交換体、重炭酸トランスポーター、プロトン-乳酸シンポーターなどの他のどのpHレギュレーターよりもV-ATPaseに依存して、好ましいアルカリ性の細胞内pHと酸性の細胞外pHを達成しているという仮説が指摘されています。 細胞質のアルカリ化は、酸化的リン酸化を抑制する一方で、解糖を活性化する。 さらに、Hypoxia Induced Factor（HIF-1）のような解糖に関連するいくつかの癌遺伝子は、V-ATPaseによって引き起こされるpH変化によって制御される。
酸性プロテアーゼ
腫瘍における細胞外酸性化の結果として、酸性プロテアーゼが活性化する。 これらの酵素は、カテプシン、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）、ゼラチナーゼなどの酸性プロテアーゼのクラスに属し、酸性pHで活性化される。 さらに、小胞内のV-ATPaseの活性が上昇すると、γ-セクレターゼのような酸性pHで活性を持つ細胞内酵素の活性も上昇する。
薬剤耐性とV-ATPase阻害剤
腫瘍微小環境のpH変化は、化学療法薬に対する感受性に影響を与える可能性があります。 アントラサイクリンやアルカロイドはpKaが7から8で、エンドソームコンパートメントに内在化される。 最近のデータでは、V-ATPase阻害剤は細胞質pHを変化させて細胞死を引き起こすだけでなく、薬物の取り込みを促進し、がんに対するコンビナトリアル治療の有効な構成要素になることが示唆されています。 卵巣癌では、a2Vが癌細胞の最先端に発現しており、MMP9の活性を調節していることが知られている。 さらに、a2V はシスプラチンを介した卵巣癌の薬剤耐性に寄与しており、a2V を選択的に阻害することは、薬剤耐性卵巣癌の治療戦略として有効であると考えられています。 V-ATPase阻害剤であるバフィロマイシンとコンカナマシンは、VOセクターを標的とし、V-ATPase活性を効率的に阻害するプレオマクロライドの一群に属しています。 最近、アピクラレンとアーキゾリドがV-ATPaseの強力かつ特異的な阻害剤であることが報告された。 しかし、V-ATPaseが正常な細胞生理学に関与していることを考慮すると、利用可能なすべての低分子阻害剤は重大な毒性を有している。 そのため、細胞特異的に発現しているaサブユニットに対する特異的な中和抗体の開発は、V-ATPaseを直接阻害する効率的な代替手段となり、またコンビナトリアル使用により間接的に多剤耐性に対処できる可能性があります。 腫瘍細胞は、原発性腫瘍から高度に転移した固形腫瘍へと進行するにつれて、オートファジーへの様々な依存性を示すようになる。 オートファジーによって、分解されるべき細胞内物質がリソソームへ運ばれる。 V-ATPaseのプロトンポンプ活性は、オートファゴソームから取り込まれた荷物を分解するリソソーム酸ヒドロラーゼの活性化に関与している。 オートファジーにはV-ATPaseの機能が必要であり、V-ATPase阻害剤バフィロマイシンは古典的なオートファジー阻害剤として使用されているが、オートファジー流束の膜力学におけるV-ATPaseの正確な役割は分かっていない。 最近の研究では、V-ATPaseとCa2+ポンプSERCAポンプの両方の活性を阻害するBafilomycinで処理すると、オートファジー流出が阻害されるが、V-ATPase欠損リソソームは依然としてオートファゴソームと融合する能力があることが報告された。 これらの結果は、V_ATPaseがオートファゴズムフラックスよりもリソソーム内のオートファジー物質の分解に関与していることを示唆し、様々な重要な細胞プロセスにおけるV-ATPaseの正確な役割を研究するための特異的阻害剤および遺伝子操作技術の開発の必要性を浮き彫りにしている。 シグナル伝達におけるV-ATPaseの関与について最初に知られた報告は、BafilomycinによるV-ATPaseの阻害がEGFRの内在化に影響を与えるという研究によるものであった。 それ以来、V-ATPaseはm-TOR (mammalian Target Of Rapamycin)、Wnt、TGF-β、Notchシグナルの調節に関連したシグナル伝達と関連付けられてきた。 これは、Notchシグナル伝達がその活性化、維持、主要な経路メディエーターの分解にエンドリソソーム経路に依存しているという事実に起因している可能性がある。 V-ATPaseは細胞のpHバランスを維持し、エンドサイトーシス、プロテアーゼの活性化、タンパク質の分解に重要な役割を担っている。 特に、a2V (V-ATPase subunit- VOa2) は、これまで、受容体のエンドサイトーシスの場である初期エンドソームに局在していることが知られていた。 リガンド結合後、Notch受容体はエンドサイトーシス経路をとり、プロテアーゼによって切断され、活性化される。 その後、受容体はライソゾームで分解される。 ショウジョウバエでは、シグナル伝達受容体のエンドソームソーティングを制御するESCRT装置の構成要素であるVps25に変異があると、ノッチ受容体がエンドソームに蓄積され、ノッチシグナル伝達が促進される … ショウジョウバエのESCRTのもう一つの構成要素であるHrsの変異を解析した研究では、ノッチはエンドソームに蓄積されるが、ノッチシグナルの異所性活性化は起こらなかった . オートファジーの喪失は、ショウジョウバエの卵巣卵胞細胞において、Notchの分解が妨げられ、Notchシグナルが活性化されることにつながる 。 これらの報告とは逆に、Rabconnection-3の変異がV-ATPaseのプロトンポンプ活性を破壊し、S2切断後の後期エンドソームにNotchを蓄積させ、その結果ショウジョウバエや哺乳類の細胞でNotchシグナルが減少することが独自の研究により明らかにされた . これらの知見に続いて、エンドリソソーム経路の酸性化を通して、V-ATPaseがエンドソームでのNotchの活性化とリソソームでのNotchの分解に必要であることが、ショウジョウバエでさらに報告された。 哺乳類の発生過程において、神経前駆体にV-ATPaseのドミナントネガティブサブユニットを発現させると、Notchシグナルが減少し、神経幹細胞が枯渇して神経細胞の分化が促進されることがわかった . 最近、Nuc1変異ラットの網膜のアストロサイトにおける研究で、Notchシグナルの制御異常が示された。 このNotchシグナルの減少は、V-ATPase活性を制御するβA3/A1-crystallinが変異して、エンドソームの酸性化やγセクレターゼ活性が損なわれ、Notch受容体の処理速度に影響を与えているためであった … これは、視覚におけるV-ATPaseの役割が現在明らかになりつつあることを考えると、興味深い発見である。 これらの発見は、V-ATPaseによるNotchシグナルの制御は、影響を受けるV-ATPase活性の細胞局在（エンドソームとリソソーム）およびNotch受容体プロセシングのエンドソーム経路への依存性によって、正と負の両方の結果をもたらすことができることを示唆している。 V-ATPaseとNotchのクロストークは、V-ATPase依存性のエンドリソソーム酸性化がNotchシグナル伝達に影響を与えるという文脈で研究されてきたが、最近の報告では、その制御が逆もあり得ることが示唆されている。 具体的には、Notch受容体やβ-アミロイドペプチドを切断するγ-セクレターゼ酵素複合体の構成要素であるプレシニリン1（PS1）が、VOa1アイソフォームのV-ATPaseと物理的に相互作用して小胞体からライソームへと標的化していることが示唆された。 我々の研究により、V-ATPase は乳癌および乳腺の発生において Notch シグナルを制御していることが明らかになった。 a2V は増殖乳腺上皮細胞および Triple Negative Breast Cancer (TNBC) 細胞の表面に発現し、正常発生および疾患時の細胞増殖に役割を果たしていることを示している。 TNBCでは、a2Vを阻害すると、Notch受容体のリソソームおよび自己貪食分解が阻害され、Notchシグナルが増強される。 マウス乳腺におけるa2Vの欠損は、Notchの異常な活性化を引き起こし、管状の形態形成に障害を与え、泌乳障害を引き起こす . PGN+poly (I:C) 感染による早産ではNotchシグナルが活性化され、炎症反応が上昇し、その抑制により生きた胎児の胎内生存率が改善される。 さらに、LPS注射による炎症反応で誘発された早産では、Notch関連炎症因子のアップレギュレーションと血管新生因子のダウンレギュレーションが観察された。 また、感染症および炎症性早産モデルでは、γ-セクレターゼ阻害剤（GSI）の投与により、表現型の回復を確認した。 GSIはNotchシグナル伝達の効率的な阻害剤であり、現在いくつかの癌に対して臨床試験中であることから、これは将来の重要な方向性を示すものである。 V-ATPaseとNotchのクロストークは、正常な発生やアルツハイマー病や様々な癌のような疾患において重要であることが明らかになった。 ヒトでは、Wnt シグナル伝達の調節異常が癌に関与しているとされている 。 Wntシグナル伝達異常の典型例は大腸がんで、Wntシグナルの負の制御因子であるAdenomatous Polyposis Coli（APC）の欠損が腫瘍形成の引き金となる。 Wntシグナルは、Frizzed, Fz, LRP (low density-lipoprotein) と呼ばれる細胞表面受容体に結合し、GSK-3の分解とβ-カテニンの遊離によって標的細胞に作用する。 β-カテニンは、Wnt 経路の主要な下流メディエーターであり、c myc や cyclinD1 などの Wnt 標的癌遺伝子 を活性化する。 ATP6ap2 とも呼ばれる (P) RR (Pro Renin Receptor) は、V-ATPase と Wnt 受容体複合体 LRP 5/6 の間のアダプター分子として働いている。 Xenopus や Drosophila では、V-ATPase が LRP 5/6 受容体複合体と相互作用し、V-ATPase の遺伝子ノックダウンや薬理学的阻害がシグナル伝達を妨げ、Wnt シグナルに対する細胞の反応を著しく低下させることが明らかにされている . さらに、V-ATPaseはオートファジーを介して間接的にWntシグナルメディエーターβ-cateninやNotchメディエーターNICDを制御していることが明らかになった。
TGF-β signalaling
a2V遺伝子に変異があるとAutosomal recessive Cutis Laxa (ACL) syndromeとなり、患者はコラーゲンなどの細胞外マトリックスの量の低下によりしわの多い皮膚の表現型を呈する。 これらの知見を裏付けるように、ヒトの皮膚弛緩症の原因となる変異のメカニズムを調べたところ、a2P405L変異は野生型と比較して不安定で、ゴルジ体輸送に欠陥があることが判明した。 さらに、ACLのグリコシレーション異常が、a2V変異を持つこれらの患者のトランスフォーミング増殖因子β（TGF-β）シグナルの上昇を促進することを指摘する報告もある。 V-ATPaseは、ラット近位尿細管上皮細胞のTGF-β誘導による上皮間葉転換を促進する。 a2Vの阻害は、Notchシグナルへの影響に加え、TNBCではWnt経路を、乳腺上皮細胞ではTGF-β経路を活性化させた . このことは、a2Vがシグナル伝達メディエーターを調節する役割は、Notchだけにあるのではないことを示唆している。 さらに、これらのマウスは、グリコシル化の障害により、総コラーゲンの減少を示した。
mTOR シグナル
mTORシグナルでは、セリン・スレオニンキナーゼmTORとmTOR complex 1（mTORC1）の他のコンポーネントがアミノ酸利用可能な細胞ストレスを感知し、成長を調節している .アミノ酸の刺激により、V-ATPaseはRagulatorのRagAに対するGuanine Exchange Factor (GEF) 活性を活性化し、RagCのGTP加水分解を促進する。 GTP結合したRagAとGDP結合したRagCが一緒になって、mTORC1をリソゾーム表面にリクルートする。 活性化されたmTORC1は、成長因子シグナルに応答して、細胞死から増殖への制御スイッチを制御する。 最近の報告では、破骨細胞のプロトンポンプ制御因子Atp6v1c1がmTORC1経路の活性化による乳癌の増殖、V-ATPase活性の上昇による骨転移の促進への関与が示唆されている
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