Alai

Abstract

Rheumatoid Arthritis (RA) は自己免疫疾患であり，その治療法として，スズメバチ毒を用いることが知られている． 中国雲南省の景浦民族の伝統的民間薬とされるスズメバチ毒（WV）は、関節リウマチを緩和する作用がある。 本研究では、実験用ラットを用いて、スズメバチ毒の関節リウマチ症状改善効果を検討することを目的とした。 SDラットにII型コラーゲン（CII）誘発関節炎（CIA）モデルを確立し、炎症と自己免疫反応の抑制を検討した。 WVの抗関節炎作用は、肉球の腫脹、患肢の病理組織学的スコアおよび病理組織学的変化により評価された。 抗炎症作用は、末梢血中のIL-6、TNF-α、IL-1βのレベルおよび炎症細胞数によって評価された。 また、ラットの脾臓におけるT細胞サブセット比率の変化をフローサイトメトリーで検出し、同時に内臓指数と免疫血清グロブリンレベルを評価した。 その結果、WVの各種用量（0.125、0.25、0.5 mg/kg）は、CIAラットの足腫脹および関節炎スコアを無処置対照（）と比較して有意に緩和することが示唆された。 WV (0.25 及び 0.5 mg/kg) は、足関節の滑膜組織病変及び滑膜細胞の過形成と炎症細胞浸潤の病理組織学的スコアを車両群に比べ緩和した(). 免疫調節に関しては、0.5 mg/kgのWVが免疫血清グロブリン値を低下させ()、さらにWV(0.5 mg/kg)がTh細胞の免疫反応を抑制し、脾臓細胞のTc細胞およびTreg細胞の機能を顕著に増強することを見出した()。 WVの免疫抑制作用は、ラット血清中のIL-1β、TNF-α、IL-8、IL-6、COX-2、PGE2濃度の抑制作用に類似していた。 以上の結果より，WVは抗関節炎作用を有し，その作用は免疫調節作用と抗炎症作用に関連する可能性が示唆された． はじめに

関節リウマチ（RA）は、全身合併症、身体障害、早期死亡にまで進行する慢性自己免疫疾患である 。 滑膜細胞の過形成、滑膜の慢性炎症、軟骨と骨の破壊がRAの主な特徴である。 さらに、T細胞、B細胞、炎症性サイトカインの相乗効果も、病態生理学的プロセスに重要な役割を果たしている。 CD4+T細胞が活性化されると、炎症性サイトカインを産生し、他の単核細胞、滑膜線維芽細胞、軟骨細胞、破骨細胞などを刺激して免疫反応を高める。 これらの炎症性サイトカイン、特にTNF-α、IL-6、IL-1βの放出は、滑膜炎に寄与すると考えられる。

現在、RAの治療に用いられる臨床治療薬は、非ステロイド性抗炎症薬（NSAIDs）、疾患修飾抗リウマチ薬（DMARDs）、生物薬剤などの炎症性メディエーターを減らすことに主に焦点を合わせている。 例えば、葉酸アナログのメトトレキサート（MTX）は、NSAIDとして1988年にFDAからRAの適応で承認された。 また、免疫抑制作用、抗炎症作用、安価であることから、RA治療において最も広く使用されるようになった 。 しかし、MTXは神経系、消化器系、免疫系に好ましくない副作用があるため、理想的な治療薬ではなく、他の薬剤も同様である . そのため、これらの薬剤の非効率性や安全性に対処するための新しい代替手段を求める人が増えています。 中国伝統医学（TCM）の理論では、RAは関節痛症候群（TCMでは「Bi Zheng」）のひとつとみなされ、おそらく外来性の風、湿、熱または寒冷病原体によって引き起こされると考えられています。 中医学の疾病予防と治療への応用は、数世紀にわたる歴史があり、顕著な効果と少ない副作用とコストに起因するRA治療における重要性が増している。

補完代替医療のアプローチとして、民間療法で痛み、炎症、関節炎の治療に数世紀にわたって使用されてきたベノム治療。 戦国時代には早くも、黄帝内経（中国語では「黄帝内経」）に、”蜂に刺されると毒性リスクが発生するにもかかわらず治療効果がある “という記録が残っているのだそうです。 現代の医学研究によると、ハチ毒（BV）は、複数のメカニズムを通じて中枢抑制系の活性化と免疫系の調節に起因する抗関節炎、抗炎症、鎮痛効果を示す。 また、いくつかの臨床試験では、BVが関節炎関連の症状を改善する可能性があることが示されています。

スズメバチ毒には、生物活性アミン、高分子物質（酵素、アレルギー物質、生物活性ペプチドなど）、ポリアミン毒素などさまざまな生物学的活性成分が含まれています。 スズメバチ毒は、疼痛、炎症性疾患、神経変性疾患の治療において様々な薬理効果を示した。 Vespa magnifica (Smith) は中国雲南省に生息する社会性スズメバチの一種である。 近年、その毒液から抗凝固作用、抗血小板作用、抗炎症作用、免疫抑制作用を持つ多くの化合物が分離された。 関節リウマチに対する顕著な効果から、中国少数民族の景浦では広く使用される習慣となっている . しかし、スズメバチ毒の抗リウマチ作用に関する報告はほとんどない。 また、RAに対する抗炎症作用の評価には、通常、肉球容積の変化が用いられている。 さらに、同じモデルでWV（Vespa magnificaのスズメバチ毒）の効果も評価した。 最後に、関節組織のH&E染色、脾臓のT細胞サブセットのフローサイトメトリー、血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8、COX-2、PGE2、リウマトイド因子 (IgG, IgA, IgM) のELISA法により、抗炎症と免疫調節に対するWVの有効性を観察しました。

2 材料および方法

2.1. 実験動物

雄のSDラット（60匹、180-220g）を湖南省スレーキ景達実験動物有限公司から入手した。 動物は生皮を敷いた標準的なポリプロピレンケージに収容した(48時間後に更新)。 動物舎は12時間の明暗サイクルで、約22±2℃、相対湿度60～70％に維持され、動物は水と標準飼料に自由にアクセスできた。 ラットは8匹の対照群と52匹のモデル群に無作為に振り分けられ、各実験の適応には最低7日間を要した。 すべての実験手順はGuide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Institutes of Health)に従って行われ、大理大学倫理委員会によって承認された

2.2. CIAの動物モデルと治療プロトコル

ラットをアルコールで消毒し、最初の免疫のために1mg/ml CCII (Chicken type II Collagen) emulsifierを右のvola pedis、背中、尾に皮下注射し、これは1 : 1で不完全フロイントアジュバント (F5506, Sigma)で乳化したものから成っている。 誘導日を0日目として設計した。 ブースター投与は，8日目に1mlのCCII乳化剤とともに，腹部，背部，尾部に再度注射した． 注射した足を炎症足とし、注射していないもう片方の足を副足と記した。 その後、コラーゲン誘発関節炎（CIA）ラットに14日目に投与し、28日目に終了した。 CIA発症後、モデルラットは臨床的スコアに従ってランダムに5群に分けられた。 I群：ビヒクルとして通常生理食塩水を皮下注射（1ml/kg）したモデル群。 II-IV群：CIAラットに治療群として0.125、0.25、0.5mg/kg WV（中国雲南省のVespa magnifica（Smith）由来のスズメバチ毒、スズメバチ尾腺の滲出液から凍結乾燥した粉末、通常の生理食塩水で希釈）をそれぞれ皮下投与した群。 V群：陽性対照群には、TwHF（Tripterygium wilfordii Hook F, No.20181001, Huangshi Feiyun Pharmaceutical Co, Ltd.）9mg/kgを同様にして投与した。 同時に、対照群の正常なラットには、同量の正常な生理食塩水のみを投与した。 以上のラットに14日間毎日投与した。

2.3. 実験的関節炎の基礎評価

CIAの重症度は、肉球の腫脹と関節炎スコアに基づいて定期的に評価された。 試験の0〜28日目にラットの体重を測定し、0、14、28日目にバーニアキャリパーとテープで炎症足（右足）と副足（左足）の足首の厚さと周囲を別々に測定した。 関節炎スコアは、3人の学者の独立した観察に基づいて評価された。 各足は0〜4のスケールで採点され、つまり両後足関節の合計スコアの最大値は8であった。評価基準は以下の通りであった。 0＝浮腫や視覚的変化なし、1＝軽度の浮腫と限られた紅斑、2＝軽度の浮腫と紅斑、3＝明らかな浮腫と著しい紅斑、4＝重度の浮腫と広範囲の紅斑 …とした。 28 日目に動物を犠牲にし、血清と二次的な足関節を採取し、さらなる分析のために処理した。 足関節の病理組織学

近隣組織を淘汰しない左後肢を直ちにPBSで2〜3回洗浄し、10％ホルマリンで48時間固定し、5％硝酸で24時間、骨皮質が針先で容易に通るまで脱石灰した。 試料はパラフィン切片に包埋し，ルーチンのヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色用にスライス（5μm）に切り出した． 関節の病理学的変化は、光学顕微鏡（オリンパス、日本）で検出し、写真に収めた。 写真は200倍の倍率で撮影した。 滑膜細胞の過形成と炎症性細胞の浸潤の変化も検出された。 病理組織学的な変化は、以下の基準でそれぞれスコア化した。 0＝検出可能な変化なし；1＝軽度；2＝中等度；3＝重度 .

2.5. 内臓インデックスの分析

ラットを犠牲にし、肝臓、脾臓、胸腺を完全に切除し、周囲の脂肪組織と筋膜を注意深く分離した。 肝臓、脾臓、胸腺の湿質量を電子天秤で測定し、内臓指数（肝臓指数、脾臓指数、胸腺指数を含む）を以下の式に従って算出した。 内臓指数＝臓器質量（mg）／体格（g）×100％＜5607＞＜9118＞2． 血清生化学的指標のELISA法＜5996＞＜7383＞実験ラットの血清を採取し、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、COX-2、PGE2の濃度を酵素結合免疫吸着法（ELISA）キット（中国・南京JianCheng）でメーカーの説明書にしたがって検出した。 IgA（ERC015）、IgG（ERC016）、IgM（ERC017）の発現量を検出するELISAキットは、NeoBioscience Co.、Ltd、Shenzhen、Chinaから購入した

2.7. 関節炎脾臓のフローサイトメトリー

フローサイトメトリーを用いてT細胞サブセット数を検出した。 ラット脾臓細胞からリンパ球を採取し、200メッシュのナイロン篩を通過させてホモジナイズした。 細胞は10%ウシ胎児血清を含むPBSバッファに濾過した。 細胞濃度を約2×106/mlに調整し、3mlの赤血球溶解バッファー（Solarbio、中国）を加えて5分以内に赤血球を溶解させた。 その後，1200rpmで5分間遠心分離し，10%ウシ胎児血清を含むFBS-PBSバッファで2回洗浄した後，1200rpmで5分間遠心分離した。 100μLごとの細胞懸濁液を遠心管に入れた。 リンパ球は、抗CD3-FITC（第557354号；BD、米国）、抗CD4-APC（第565432号；BD、米国）、抗CD8-PerCP（558824号；BD、米国）および抗CD25-PE（554866号；BD、米国）で染色して追跡した。 モノクローナル抗体を各チューブに加え、再混合し、氷上で30分放置した。 各サンプル管にFBS-PBSバッファー（1 ml）を加え、1200 rpmで5分間遠心分離し、上清を放棄した。 モノクローナル抗体と結合しない細胞が完全に溶出されるように、前のステップを2回繰り返した。 実験細胞を500μLのFBS-PBSバッファーと混合した。 CD25+/CD4+およびCD4+/CD8+T細胞の比率は、FACS Canto Flow-cytometer (BD, USA) .

2.8 を使用して決定した。 統計解析＜5996＞＜7383＞データはSPSS10.0を使用して統計解析した。 データは平均値±平均値の標準偏差（S.D.M）として表示した。 各群間の差の有意性は、一元配置分散分析に続いてTukey検定で分析した。 特に、関節炎スコアと病理組織学的スコアは、Wilcoxon順位和検定で分析した。 5607>

3.結果

3.1. WVはCIAラットの関節炎症状を緩和した

指示通りにII型コラーゲンをラットに注射して関節炎症状を誘発することに成功し、図1（a）のCIAラットの第二足と足首関節の激しい赤みと腫れの著しいマクロな兆候を、健常対照群と比較すると具体化することができた。 足関節の厚さと周囲は、14日目（図1（b））には、対照群のものと比較して、ビヒクルでは明らかに増加していたが、28日目には、モデル群のものと比較して、TwHFおよびすべてのWV処理群では著しく減少した（all ）（図1（b））。 炎症足、副足ともに足関節の厚みと周囲を測定したところ、データから明らかな腫脹の縮小が認められた（図1(b)）。 この腫脹度の結果から、WVはTwHF効果に相当する肉球の浮腫を抑制し、肉球や足関節の二次的な炎症を緩和することができることが示されました。

(a)

(b)

(c)

(a)・(b)・(c)
(a)
(b)
(c)

図1

各群の関節症状に対するWVの効果。 (a)全群の前肢の腫脹度。 (b）全群の炎症足、副足ともに足関節の厚みと周囲。 (c）全群の関節炎スコアの比較＜306＞＜306＞＜306＞＜7383＞さらに、図1（c）に示すように、WVの投与量によって関節炎スコアが様々な程度で減少していることが確認された。 ビヒクル群の関節炎スコアは、14日目に6.5±1.0（対0日目、）であった。 TwHF投与群では，28日目に2.8 ± 0.8 (vs. 14日目, ) を示し，有意に低下していた． 同様に、WVによるindexの減少は、有意かつ用量依存的であった（0.5 mg/kgで3.2 ± 0.6, 0.25 mg/kg で 4.3 ± 0.7, 0.125 mg/kgで 5.6 ± 0.7）（s severally vs 14 days, )。 このことから，WVの0.5 mg/kgでの効力は，TwHF投与群と同等であることがわかった． WVはCIAラットの関節の病理学的変化を緩和した

H&E 染色（図2（a））により、対照ラットの足関節の滑膜は、滑膜細胞の過形成、炎症細胞の侵入がなく、軟骨表面が滑らかで、細胞が規則的に配列されていた。 これに対し、ビークル群ラットの関節の組織構造は、免疫細胞の浸潤、滑膜細胞の過形成、血管の増加、軟骨や骨の浸食など、著しく異常であった。 TwHF群およびWV群の関節は、ビヒクル群から有意に減弱し、コントロール群の関節に移行した。 病理組織学的スコア（図2（b））は、関節炎の関節における滑膜の裏打ち細胞の異常と炎症細胞の浸潤を示す（車両群）。TwHFとWV治療は車両群に比べ、平均病理組織学的スコアを著しく下げ、軟骨を回復させた（）。

(a)

(b)

(a)
(b)

Figure 2

CIAラットの関節炎進行と関節組織に対するWVの効果。 (a）異なる用量のWVおよびTwHFを投与したCIAラットおよび正常ラットの関節組織切片のH&E染色による病理組織学的所見。 a、骨破壊、b、免疫細胞の浸潤、c、肥大化した滑膜。 (b）全群における滑膜細胞の過形成と炎症性細胞の浸潤の病理組織学的スコア。 対照群と比較した場合； , 車両群と比較した場合。

3.3. CIAラットの内臓指数及び免疫血清グロブリンレベルに対するWVの効果

対照群と比較して、ビヒクル群の肝臓指数は著しく低下し()、WV(0.25及び0.5mg/kg)は著しく上昇した()。 対照群と比較して、車両群の脾臓指数および胸腺指数は顕著に増加した()。TwHFおよびWVはこれらに対して抑制作用を示し、特に胸腺指数に対するWVの0.5 mg/kg投与の効果に反映された(図3(a))。

(a)

(b)

(a)
(b)

Figure 3

CIAラットの内臓指数と免疫血清グロブリンレベルに対するWVの効果。 (a)全群における脾臓、胸腺、肝臓の指数の変化。 (b)全群の血清中の発現IgG、IgA、IgMレベル。 対照群と比較した場合； , 車両群と比較した場合。

CIAラットでは対照群と比較して発現IgG、IgA、IgMレベルが劇的に改善したが（）、TwHF処理後には低くなった（）。 そして、血清IgGのレベルは、WV（0.5mg/kg）群では、ビヒクル群に比べ低下した（）。 この抑制はWV群（0.25、0.5mg/kg）のIgA、IgMにも及んだ（図3（b））

3.4. CIAラットの脾臓におけるT細胞サブセットに対するWVの効果

CD4+T細胞数は、対照群（）と比較してビヒクル群では有意に増加し、TwHF群およびWV（0.5mg/kg）群はビヒクル群より有意に減少した（図4（a））。 対照群と比較して、ビヒクル群のCD4+CD25+ T細胞数は有意に減少した（）が、TwHFおよびWV（0.5 mg/kg）群では有意に増加した（）が、他の群では明らかではなかった（図4(a)）。 対照群と比較して、CD8+ T細胞数のvehicle群での減少は顕著であったが、WV（0.125及び0.25 mg/kg）のみで数が上昇した（、）（図4(b) ）。

(a)

(b)

(a)
(b)である。

3． WV Regulated Serum Cytokines and Mediators in CIA Rats

ELISA kits（図5）より、コントロール群と比較して、IL-1β、TNF-α、IL-6、PGE2、COX-2、IL-8の血清レベルは、ビークル群で著しく上昇し、TwHF（9mg／kg）およびWV（0.5mg／kg）によって著しく回復した（）。 一方、IL-6 と PGE2 の発現は、WV の 0.125 および 0.25 mg/kg 投与により抑制された ()。 また、WV（0.125および0.25 mg/kg）でも同様に、COX-2およびIL-8の発現がビヒクルと比較して抑制された（、）。 このことから、CCIIによる炎症が関節炎ラットに見られる病理学的変化を媒介する可能性が高く、WVは炎症反応を緩和することができることが示された。