Alai

Coronavirussen hebben in de afgelopen twee decennia twee grootschalige pandemieën veroorzaakt, SARS en Middle East respiratory syndrome (MERS)8,9. Algemeen wordt aangenomen dat SARSr-CoV, dat hoofdzakelijk bij vleermuizen wordt aangetroffen, in de toekomst een ziekte-uitbraak zou kunnen veroorzaken10,11. Hier rapporteren wij over een reeks gevallen veroorzaakt door een niet-geïdentificeerde uitbraak van een longontsteking in Wuhan, provincie Hubei, centraal China. Deze ziekte-uitbraak – die begon op een lokale markt voor zeevruchten – is aanzienlijk gegroeid en besmet nu 2.761 mensen in China, gaat gepaard met 80 sterfgevallen en heeft geleid tot de besmetting van 33 mensen in 10 andere landen vanaf 26 januari 20012. Typische klinische symptomen van deze patiënten zijn koorts, droge hoest, ademhalingsmoeilijkheden (dyspneu), hoofdpijn en longontsteking. Het begin van de ziekte kan leiden tot progressieve ademhalingsinsufficiëntie als gevolg van alveolaire beschadiging (zoals waargenomen op transversale thoraxcomputertomografiebeelden) en zelfs tot de dood. De ziekte werd door clinici vastgesteld als veroorzaakt door een virusgeïnduceerde longontsteking op grond van klinische symptomen en andere criteria, waaronder een stijging van de lichaamstemperatuur, daling van het aantal lymfocyten en witte bloedcellen (hoewel de niveaus van deze laatste soms normaal waren), nieuwe longinfiltraten op röntgenfoto’s van de borstkas en geen duidelijke verbetering na behandeling met antibiotica gedurende drie dagen. Het lijkt erop dat de meeste van de vroege gevallen een contactgeschiedenis hadden met de oorspronkelijke vismarkt; de ziekte is nu echter gevorderd om te worden overgedragen door contact van mens op mens.

Stalen van zeven patiënten met ernstige longontsteking (van wie zes verkopers of bezorgers van de vismarkt), die aan het begin van de uitbraak waren opgenomen op de intensive care-afdeling van het Wuhan Jin Yin-Tan-ziekenhuis, werden naar het laboratorium van het Wuhan Institute of Virology (WIV) gestuurd voor de diagnose van de oorzakelijke ziekteverwekker (uitgebreide gegevenstabel 1). Als laboratorium dat CoV onderzoekt, gebruikten we eerst pan-CoV PCR primers om deze monsters te testen13, aangezien de uitbraak plaatsvond in de winter en op een markt – dezelfde omgeving als SARS-infecties. We vonden vijf monsters die PCR-positief waren voor CoV’s. Eén monster (WIV04), verzameld uit de bronchoalveolaire lavagevloeistof (BALF), werd geanalyseerd door middel van metagenomics-analyse met behulp van next-generation sequencing om potentiële etiologische agentia te identificeren. Van de 10.038.758 totale gelezen waarvan 1.582 totale gelezen werden behouden na filtering van gelezen van het menselijk genoom-1.378 (87,1%) sequenties kwamen overeen met de sequentie van SARSr-CoV (Fig. 1a). Door de novo assemblage en gerichte PCR verkregen we een 29.891-base-paar CoV-genoom dat 79,6% sequentie-identiteit deelde met SARS-CoV BJ01 (GenBank-toetredingsnummer AY278488.2). Een hoge genoomdekking werd verkregen door de totale gelezen data opnieuw toe te wijzen aan dit genoom (Extended Data Fig. 1). Deze sequentie is ingediend bij GISAID (https://www.gisaid.org/) (toetredingsnummer EPI_ISL_402124). Volgens de naam van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) noemen we het voorlopig het nieuwe coronavirus 2019 (2019-nCoV). Vier andere volledige genoomsequenties van 2019-nCoV (WIV02, WIV05, WIV06 en WIV07) (GISAID-toetredingsnummers EPI_ISL_402127-402130) die meer dan 99,9% identiek aan elkaar waren, werden vervolgens verkregen van vier extra patiënten met behulp van next-generation sequencing en PCR (uitgebreide gegevenstabel 2).

Het virusgenoom bestaat uit zes belangrijke open-reading frames (ORF’s) die gemeenschappelijk zijn voor coronavirussen en een aantal andere accessoire genen (Fig. 1b). Verdere analyse geeft aan dat sommige van de 2019-nCoV-genen minder dan 80% nucleotide-sequentie-identiteit deelden met SARS-CoV. De aminozuursequenties van de zeven geconserveerde replicasedomeinen in ORF1ab die werden gebruikt voor CoV-soortclassificatie waren echter 94,4% identiek tussen 2019-nCoV en SARS-CoV, wat suggereert dat de twee virussen tot dezelfde soort behoren, SARSr-CoV.

We ontdekten vervolgens dat een korte regio van RNA-afhankelijke RNA-polymerase (RdRp) van een vleermuis-coronavirus (BatCoV RaTG13)-dat eerder werd gedetecteerd in Rhinolophus affinis uit de provincie Yunnan – een hoge sequentie-identiteit vertoonde met 2019-nCoV. We voerden full-length sequencing uit op dit RNA-monster (GISAID-toetredingsnummer EPI_ISL_402131). Simplotanalyse toonde aan dat 2019-nCoV in het hele genoom sterk leek op RaTG13 (Fig. 1c), met een totale genoomsequentie-identiteit van 96,2%. Met behulp van de uitgelijnde genoomsequenties van 2019-nCoV, RaTG13, SARS-CoV en eerder gerapporteerde vleermuis SARSr-CoV’s, werden geen aanwijzingen voor recombinatiegebeurtenissen gedetecteerd in het genoom van 2019-nCoV. Fylogenetische analyse van het volledige genoom en de gensequenties van RdRp en spike (S) toonde aan dat – voor alle sequenties – RaTG13 de meest nabije verwant is van 2019-nCoV en dat zij een afzonderlijke afstamming vormen van andere SARSr-CoVs (Fig. 1d en Extended Data Fig. 2). Het receptor-bindende spike-eiwit gecodeerd door het S-gen was sterk afwijkend van andere CoVs (Extended Data Fig. 2), met minder dan 75% nucleotide sequentie-identiteit met alle eerder beschreven SARSr-CoVs, met uitzondering van een 93,1% nucleotide identiteit met RaTG13 (Extended Data Tabel 3). De S-genen van 2019-nCoV en RaTG13 zijn langer dan die van andere SARSr-CoV’s. De belangrijkste verschillen in de sequentie van het S-gen van 2019-nCoV zijn de drie korte inserties in het N-terminale domein alsook veranderingen in vier van de vijf sleutelresiduen in het receptor-bindende motief in vergelijking met de sequentie van SARS-CoV (Extended Data Fig. 3). Of de inserties in het N-terminale domein van het S-eiwit van 2019-nCoV sialinezuurbindende activiteit verlenen, zoals bij MERS-CoV, moet verder worden bestudeerd. De nauwe fylogenetische verwantschap met RaTG13 levert bewijs dat 2019-nCoV mogelijk afkomstig is van vleermuizen.

We ontwikkelden snel een qPCR-gebaseerde detectiemethode op basis van de sequentie van het receptor-bindende domein van het S-gen, dat de meest variabele regio van het genoom was (Fig. 1c). Onze gegevens tonen aan dat de primers 2019-nCoV konden onderscheiden van alle andere menselijke coronavirussen, waaronder vleermuis SARSr-CoV WIV1, dat 95% identiteit deelt met SARS-CoV (Extended Data Fig. 4a, b). Van de monsters verkregen van de zeven patiënten, vonden we dat zes BALF- en vijf orale swabmonsters positief waren voor 2019-nCoV tijdens de eerste bemonstering, zoals beoordeeld door qPCR en conventionele PCR. We konden echter geen virus-positieve monsters meer detecteren in orale swabs, anale swabs en bloedmonsters van deze patiënten tijdens de tweede bemonstering (Fig. 2a). Wij bevelen echter aan om andere qPCR-doelwitten, waaronder de RdRp- of envelope (E)-genen, te gebruiken voor de routinedetectie van 2019-nCoV. Op basis van deze bevindingen stellen we voor dat de ziekte zou kunnen worden overgedragen door transmissie via de lucht, hoewel we andere mogelijke transmissieroutes niet kunnen uitsluiten, aangezien verder onderzoek, met inbegrip van meer patiënten, vereist is.

Voor serologische detectie van 2019-nCoV gebruikten we een eerder ontwikkeld nucleocapsid (N)-eiwit van vleermuis SARSr-CoV Rp3 als antigeen voor IgG- en IgM-enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA’s), aangezien dit eiwit 92% aminozuuridentiteit had met het N-eiwit van 2019-nCoV (Extended Data Fig. 5) en geen kruisreactiviteit vertoonde tegen andere humane coronavirussen behalve SARSr-CoV7. We waren slechts in staat om vijf serummonsters te verkrijgen van de zeven patiënten met virale infecties. We controleerden de virale antilichaamniveaus bij één patiënt (ICU-06) 7, 8, 9 en 18 dagen na het begin van de ziekte (uitgebreide gegevenstabel 2). Er werd een duidelijke trend waargenomen in de IgG- en IgM-titers, die in de loop van de tijd toenamen, behalve dat de IgM-titer in het laatste monster afnam (Fig. 2b). Als tweede analyse testten wij monsters van 5 van de 7 virus-positieve patiënten rond 20 dagen na het begin van de ziekte op de aanwezigheid van virale antilichamen (uitgebreide gegevenstabellen 1, 2). Alle patiëntenmonsters – maar niet de monsters van gezonde personen – waren sterk positief voor viraal IgG (Fig. 2b). Er waren ook drie IgM-positieve monsters, wat wijst op een acute infectie.

Wij isoleerden vervolgens met succes het virus (genaamd 2019-nCoV BetaCoV/Wuhan/WIV04/2019) uit zowel Vero E6- als Huh7-cellen met behulp van het BALF-monster van patiënt ICU-06. Duidelijke cytopathogene effecten werden waargenomen in de cellen na incubatie gedurende drie dagen (Extended Data Fig. 6a, b). De identiteit van de stam WIV04 werd geverifieerd in Vero E6-cellen door immunofluorescentiemicroscopie met behulp van het kruisreactieve virale N-antilichaam (Extended Data Fig. 6c, d) en door metagenomics-sequencing, waarvan de meeste lezingen zich koppelden aan 2019-nCoV, en qPCR-analyse toonde aan dat de virale belasting toenam van dag 1 tot dag 3 (Extended Data Fig. 6e, f). Virale deeltjes in ultradunne secties van geïnfecteerde cellen vertoonden een typische coronavirus morfologie, zoals gevisualiseerd met elektronenmicroscopie (Extended Data Fig. 6g). Om de neutralisatie activiteit van de virale IgG-positieve monsters verder te bevestigen, voerden we serum-neutralisatie testen uit in Vero E6 cellen met behulp van de vijf patiëntensera die IgG-positief waren. Wij tonen aan dat alle monsters in staat waren om 100 TCID50 (50% weefselkweek-infectieuze dosis) van 2019-nCoV te neutraliseren bij een verdunning van 1:40-1:80. We tonen ook aan dat dit virus kon worden gekruist geneutraliseerd door paard anti-SARS-CoV serum (gift van L.-F. Wang) bij verdunningen van 1:40; het potentieel voor kruisreactiviteit met SARS-CoV antilichamen moet echter worden bevestigd met anti-SARS-CoV serum van mensen (Extended Data Table 4).

ACE2 is bekend als een celreceptor voor SARS-CoV14. Om te bepalen of 2019-nCoV ook ACE2 gebruikt als cellulaire ingangsreceptor, hebben we virusinfectiviteitsstudies uitgevoerd met HeLa-cellen die ACE2-eiwitten van mensen, Chinese hoefijzervleermuizen, civetkatten, varkens en muizen tot expressie brachten of niet. We laten zien dat 2019-nCoV in staat is om alle ACE2-eiwitten, behalve muis ACE2, te gebruiken als ingangsreceptor om ACE2-expresserende cellen binnen te dringen, maar niet cellen die ACE2 niet tot expressie brachten, wat aangeeft dat ACE2 waarschijnlijk de celreceptor is via welke 2019-nCoV cellen binnenkomt (Fig. 3). We tonen ook aan dat 2019-nCoV geen gebruik maakt van andere coronavirusreceptoren, zoals aminopeptidase N (APN) en dipeptidyl peptidase 4 (DPP4) (Extended Data Fig. 7).

De studie geeft een gedetailleerd verslag over 2019-nCoV, het waarschijnlijke etiologische agens dat verantwoordelijk is voor de aanhoudende epidemie van acuut respiratoir syndroom in China en andere landen. Virus-specifieke nucleotide-positieve en virale-eiwit seroconversie werd waargenomen bij alle geteste patiënten en levert bewijs voor een associatie tussen de ziekte en de aanwezigheid van dit virus. Er zijn echter nog veel dringende vragen die moeten worden beantwoord. Het verband tussen 2019-nCoV en de ziekte is niet geverifieerd door dierproeven om te voldoen aan de postulaten van Koch om een oorzakelijk verband tussen een micro-organisme en een ziekte vast te stellen. We weten nog niet hoe de overdracht van dit virus tussen gastheren verloopt. Het lijkt erop dat het virus steeds meer overdraagbaar wordt tussen mensen. We moeten nauwlettend in de gaten houden of het virus blijft evolueren om virulenter te worden. Door een tekort aan specifieke behandelingen en gezien de verwantschap van 2019-nCoV met SARS-CoV, kunnen sommige geneesmiddelen en preklinische vaccins tegen SARS-CoV waarschijnlijk worden gebruikt om dit virus te behandelen. Ten slotte moet, gezien de ruime verspreiding van SARSr-CoV in hun natuurlijke reservoirs, toekomstig onderzoek worden toegespitst op actieve surveillance van deze virussen voor bredere geografische regio’s. Op lange termijn moeten er breed-spectrum antivirale geneesmiddelen en vaccins worden voorbereid voor opkomende infectieziekten die in de toekomst door deze cluster van virussen worden veroorzaakt. Het allerbelangrijkste is dat er strikte regels komen tegen het domesticeren en consumeren van wilde dieren.

Noot toegevoegd in drukproef: Sinds de aanvaarding van dit artikel heeft het ICTV het virus aangeduid als SARS-CoV-215; bovendien heeft de WHO de officiële naam vrijgegeven van de ziekte die door dit virus wordt veroorzaakt, namelijk COVID-1916.