Von Willebrand Factor, ADAMTS13, and Thrombotic Thrombocytopenic Purpura
VWF wordt gesynthetiseerd uit een groot gen op chromosoom 12p13.31 dat 178 kb beslaat en 52 exonen bevat.49 Het door dit gen geproduceerde boodschapper-RNA (mRNA) specificeert een polypeptide van 2813 aminozuren, dat een signaalpeptide van 22 aminozuren, een propeptide van 742 aminozuren en een sequentie van 2050 aminozuren omvat, die de monomere bouwsteen vormt van het VWF dat in plasma wordt aangetroffen. Na splitsing van het signaalpeptide in het endoplasmatisch reticulum worden de propeptide-bevattende monomeren tot dimeren gedesulfidebonden door disulfidebindingen tussen de ketens waarbij Cys-residuen dicht bij de C-terminus van het molecuul betrokken zijn. Deze dimeren worden vervolgens naar het Golgi-apparaat getransporteerd, waar het propeptide disulfidebindingen tussen de dimeren katalyseert tussen residuen in het D3-domein, waardoor lange multimeren ontstaan die bestaan uit kop-aan-kop gekoppelde dimeren met N-termini aan beide uiteinden. Het propeptide wordt vervolgens gesplitst door een furin-achtig enzym en het grootste deel van het resulterende ULVWF wordt verpakt in opslaggranules voor latere gereguleerde secretie.
Er zijn slechts twee celtypen bekend die VWF synthetiseren: endotheelcellen en megakaryocyten. In endotheelcellen wordt het VWF opgeslagen in korrels die Weibel-Palade lichaampjes worden genoemd; in bloedplaatjes wordt het opgeslagen in α-granules. Het meeste VWF in het bloed is van endotheliale oorsprong. Vele stimuli kunnen het vrijkomen van endotheliaal VWF induceren, waaronder epinefrine, desamino-vasopressine (DDAVP), histamine, trombine, Shiga toxines, en proinflammatoire cytokines waaronder tumor necrose factor (TNF)-α, interleukine (IL)-8, en IL-6 (in complex met de IL-6 receptor).50 Andere agentia kunnen ook endotheliaal vrijkomen van VWF induceren, hetgeen aanwijzingen geeft voor sommige van de aanzettende factoren in TTP. Deze middelen omvatten virussen zoals het adenovirus51 en oxidanten zoals superoxide.52 Oxidanten hebben niet alleen het vermogen om de uitscheiding van ULVWF te induceren; zij kunnen VWF ook oxideren zodat het niet meer door ADAMTS1353 kan worden gesplitst en meer adhesief wordt.54 Bovendien kunnen oxidanten, vooral die welke door neutrofielen en monocyten tijdens een ontsteking worden geproduceerd, een cruciaal methionine residu in het katalytische domein van ADAMTS13 oxideren en het enzym inactiveren.55
Zowel endotheelcellen als bloedplaatjes geven VWF multimeren af die groter zijn dan de multimeren in normaal plasma.56 Deze ULVWF multimeren zijn niet alleen veel groter dan die welke normaal in plasma worden aangetroffen; zij zijn ook veel kleveriger en in staat om de bloedplaatjes VWF receptor glycoproteïne Ib (GPIbα; grootste polypeptide van het GPIb-IX-V complex) spontaan en met een hogere bindingssterkte te binden dan die welke wordt bereikt met de binding van plasma VWF aan GPIbα in aanwezigheid van de modulatoren ristocetine of botrocetine.57 In vivo betekent dit dat ULVWF in staat is bloedplaatjes te binden bij geen of lage afschuifspanning, terwijl verwerkt plasma VWF door hoge afschuifspanning geïnduceerde ontvouwing nodig heeft om bloedplaatjes te binden.58
Een deel van de pas vrijgemaakte ULVWF komt direct in het circulerende bloed terecht, terwijl een ander deel aan het endotheel gehecht blijft, waar de ULVWF multimeren zich kunnen verenigen tot slierten van enkele honderden micrometers tot enkele millimeters lengte die aan het endotheeloppervlak verankerd blijven.59 Aan het oppervlak gebonden ULVWF slierten zijn hyperadhesief en binden spontaan bloedplaatjes om met bloedplaatjes gedecoreerde slierten te vormen met een “kralen-op-slierten” uiterlijk aan het endotheeloppervlak. Onder fysiologische afschuifspanning worden de met bloedplaatjes gedecoreerde ULVWF-strings door ADAMTS13 gesplitst en van het endotheeloppervlak verwijderd. Verdere verwerking, die nog niet volledig gekarakteriseerd is, maakt het VWF ongeschikt om spontaan bloedplaatjes te binden. De accumulatie van met bloedplaatjes gedecoreerde ULVWF-strings op het endotheliale oppervlak als gevolg van verlaagde niveaus of de afwezigheid van ADAMTS13 in de circulatie initieert microvasculaire trombose, die leidt tot de vorming en afzetting van bloedplaatjes-rijke hyaliene trombi in de microvasculatuur – een kenmerk van TTP.
ULVWF-strings bestaan uit bundels van VWF-multimeren, en elke string is gebonden aan het endotheliale oppervlak op verschillende ankerplaatsen. In afwezigheid (of lage concentraties) van Ca2+ en Mg2+ hechten ULVWF-strings zich aan het endotheliale oppervlak door binding aan P-selectine.60 In aanwezigheid van fysiologische concentraties van tweewaardige kationen, verankeren ULVWF strengen zich aan het endotheeloppervlak door hun interactie met integrine αvβ3.61 Andere moleculen zijn ongetwijfeld betrokken bij deze verankering van VWF strengen, maar zij zijn nog niet geïdentificeerd.
Het vermogen van VWF of ULVWF multimeren om zichzelf te associëren tot dikkere vezels en kabels wordt een belangrijk mechanisme voor het reguleren van de adhesieve eigenschappen van VWF. Savage et al. toonden aan dat onder schuifspanning en in aanwezigheid van bloedplaatjes, VWF multimeren in de vloeistoffase homotypisch en reversibel associëren met VWF multimeren die geïmmobiliseerd zijn op een collageenoppervlak; de zelf-geassocieerde VWF multimeren ondersteunen de aanhechting van bloedplaatjes onder schuifspanning.62 Vloeistof-fase VWF multimeren kunnen ook associëren met ULVWF draden die zijn vastgehecht aan het endotheliale oppervlak,63 en zelf-associatie wordt vergemakkelijkt door gedeeltelijke ontvouwing van de VWF moleculen geïnduceerd door schuifspanning64,65 of door de binding van ristocetine.66 De zelfgeassocieerde VWF-multimeren vormen een netwerk van vernette vezels op collageenoppervlakken64 of in oplossing.66 Onder schuifspanning kunnen VWF-multimeren in de vloeistoffase ook associëren met VWF-multimeren die aan bloedplaatjes zijn gebonden door interactie met GPIbα op bloedplaatjesoppervlakken.67 Zelf-associatie van VWF op het oppervlak van bloedplaatjes kan activering van bloedplaatjes teweegbrengen, aggregatie van bloedplaatjes bevorderen en trombusgroei versterken.
Het vermogen van VWF om zichzelf te associëren maakt het mogelijk om strengen te produceren die de lengte en dikte van die geproduceerd door fibrinepolymerisatie evenaren of overtreffen. In synthetische microvaten die door stimulatie met een agonist worden geïnduceerd om VWF af te scheiden, kan VWF dat van de vaatwand wordt afgescheiden zich tot strengen verenigen die het lumen van het vat kunnen omspannen, met name bij bifurcaties en bochten.68 Het vermogen van VWF om strengen en kabels van zulke enorme afmetingen te vormen en deze kabels over het stromingstraject te spannen, verhoogt niet alleen de kans dat de strengen bloedplaatjes vangen, maar vergroot ook hun vermogen om erytrocyten te versnipperen tot schistocyten.
VWF zelf-associatie wordt niet alleen gereguleerd door schuifspanning, maar ook door plasmafactoren, die waarschijnlijk het verloop en de ernst van TTP episodes kunnen veranderen. VWF zelf-associatie wordt verzwakt door hoge-dichtheid lipoproteïne (HDL) en door apoliproteïne (Apo) A-I, de belangrijkste eiwitcomponent in HDL. Beide verminderen aanzienlijk de lengte en dikte van de VWF vezels die geïmmobiliseerd zijn op het endotheeloppervlak. De adhesie van bloedplaatjes aan deze hyperadhesieve structuren wordt ook verminderd in verhouding tot de vermindering van zelf-geassocieerd VWF. In een model van TMA in ADAMTS13 knock-out muizen, verminderde HDL ook aanzienlijk de trombocytopenie die werd geïnduceerd door de infusie van hoge doses menselijk VWF.69 In overeenstemming met het vermogen van ApoA-I om de zelf-associatie van VWF te moduleren, correleert zijn plasmaconcentratie omgekeerd evenredig met het niveau van hyperadhesief VWF bij patiënten met TTP en sepsis. Deze bevindingen suggereren dat interferentie met VWF zelf-associatie een nieuwe benadering zou kunnen zijn voor de behandeling van trombotische aandoeningen geassocieerd met hyperadhesief VWF, waaronder TTP.
Het VWF-afsplitsende metalloprotease is het 13e lid van een familie van 18 verschillende ADAMTS-type enzymen die tot op heden zijn geïdentificeerd en structurele overeenkomsten vertonen.16,17 ADAMTS13 bestaat uit een N-terminaal reprolysine-type metalloprotease domein (M), gevolgd door een disintegrine domein (D), een trombospondine-1-achtig domein (T), een cysteïne-rijk domein (C) dat een arginine-glycine-aspartaat sequentie bevat, een spacer-domein (S), zeven extra trombospondine-1-achtige domeinen (T2-8), en twee niet-identieke CUB-type domeinen (CUB1-2) aan het C-terminale uiteinde van het molecuul (Fig. 24.2). De CUB-domeinen bevatten peptidesequenties die lijken op complement-subcomponenten C1r/C1s, embryonaal zee-egel-eiwit egf en botmorfogeen eiwit-1.70 ADAMTS13 is een Zn2+- en Ca2+-bevattend glycoproteïne van 190.000 dalton, waarvan het gen zich bevindt op chromosoom 9q34 en dat voornamelijk wordt geproduceerd in de stellaatcellen van de lever.71,72 ADAMTS13 wordt geremd door EDTA; daarom kunnen functionele tests van het enzym het best worden uitgevoerd op gecitreerd plasma.12,14-17,73-77 Plasma dat is geanticoaguleerd met heparine, chloormethylketonen (bv. fenylalanine-proline-aspartaat-chloormethylketon), hirudine en andere directe trombineremmers (DTI’s) kan ook bevredigend zijn voor tests. Serum dat op de juiste wijze is behandeld met proteaseremmers is ook geschikt voor testen.78
De splitsing van VWF door ADAMTS13 is afhankelijk van conformatieveranderingen in VWF die teweeggebracht worden door schuifspanning, een kracht die de conformatie van VWF-multimeren verandert van globulair naar open.79 Deze conformatieovergang wordt gevolgd door het openvouwen van één of meer A2-domeinen binnen het VWF-multimeer, waardoor de Tyr1605-Met1606-peptidebinding bloot komt te liggen voor splitsing door ADAMTS1379 of oxidatie van Met1606 door hypochloriet.54 Naast afschuifkracht wordt de overgang naar de toegankelijke conformatie ook vergemakkelijkt door veranderingen in de structuur van het A2-domein veroorzaakt door de aanhechting van koolhydraten,80 aminozuursubstituties in type 2A VWD die de vouwing van het A2-domein destabiliseren,81 en mutaties in type 2B VWD82 en de binding van ristocetine,83 die beide tegelijkertijd het A1-domein blootstellen voor binding van bloedplaatjes en de ADAMTS13 splitsingsplaats.
De herkenning en splitsing van VWF door ADAMTS13 is uitgebreid bestudeerd. Recent bewijs toont aan dat in het natieve ADAMTS13 molecuul, de C-terminale T8-CUB domeinen in contact staan met de N-terminale MDTCS domeinen, een intramoleculaire interactie die gedeeltelijk het vermogen van de MDTCS domeinen remt om het VWF-78 peptide substraat te binden en te klieven. In deze natieve conformatie wordt ADAMTS13 gedeeltelijk geremd door auto-inhibitie.84,85 Het vermogen van ADAMTS13 om zich in deze conformatie te vouwen wordt blijkbaar vergemakkelijkt door de flexibiliteit van vier vermeende linker-sequenties die zich bevinden tussen de T1 en T2, T2 en T3, T4 en T5, en T8 en CUB1 domeinen.86 De auto-inhibitie wordt opgeheven wanneer de C-terminale domeinen worden afgekapt of gebonden door antilichamen of multimeer VWF, waardoor binding van de MDTCS domeinen met het substraat mogelijk wordt.
Gebaseerd op mutatie-analyses, bindingsstudies, kinetische analyses, en het gebruik van synthetische peptide substraten, zijn meerdere interactieplaatsen tussen het conformationeel actieve ADAMTS13 en het ongevouwen VWF A2 domein geïdentificeerd en samengevat in een moleculair rits-model,87 zoals schematisch weergegeven in Fig. 24.3. Bij blootstelling van multimere VWF aan een kritisch niveau van afschuifspanning, wordt eerst een exosiet in het A2-domein blootgelegd. Dit exosiet omvat het spiraalvormige gebied van Glu1660-Arg1668 dat 65 aminozuren C-terminaal van de splitsingsplaats ligt en bindt aan het spacerdomein van ADAMTS13 met hoge affiniteit (KD ~ 10 nM).88-90 Door schuifspanning komt ook een tweede exosiet met lage affiniteit in het A2-domein bloot te liggen op of nabij Asp1614 (P9′ plaats), dat interageert met Arg349 in het desintegrine-domein van ADAMTS13.91 Interactie van deze twee exosieten met complementaire gebieden in ADAMTS13 positioneert de Tyr1605-Met1606 splitsingsplaats in VWF met het actieve centrum in het metalloprotease domein van ADAMTS13. Dit impliceert interactie van Leu1603 (P3 site) in VWF met complementair Leu198, Leu232, en L272 (S3 site) in ADAMTS13, Tyr1605 (P1 site) in VWF met Leu151, en Val195 (S1 site) in ADAMTS13, en Met1606 (P1′ site) in VWF met Asp252-Pro256 (S1′ site) in ADAMTS13.92 Phage display en willekeurige mutatie analyse bevestigen en tonen aan dat aminozuren in de P3-P2′ en P11′ (Ile1616) regio ook belangrijk zijn voor de splitsing.93 Aldus vergemakkelijkt de opeenvolgende interactie van deze complementaire regio’s in de twee multidomeine-eiwitten de specifieke splitsing van de scissile binding.
Er wordt al lang vermoed dat het falen in de afbraak van ULVWF multimeren familiaire en verworven idiopathische vormen van TTP veroorzaakt, of een individu predisponeert voor deze aandoeningen (Fig. 24.4).11,94 Kritische experimenten die werden uitgevoerd om dit concept te verifiëren werden gerapporteerd in 1997 en 1998. Vier patiënten met chronisch recidiverende TTP bleken een tekort te hebben aan plasma ADAMTS13 activiteit.12 Omdat er geen remmer van het enzym werd gedetecteerd, werd deze tekortkoming toegeschreven aan een afwijking in de productie, overleving, of functie van het protease. In de loop van het volgende jaar werd de pathogenese van de meer voorkomende verworven idiopathische vorm van TTP opgehelderd.13-15 Patiënten met verworven idiopathische TTP hadden weinig of geen plasma ADAMTS13 activiteit tijdens acute episodes, maar deze activiteit nam toe in de richting van normaal bij herstel. Hoewel de plasma-assays in deze studies niet fysiologisch waren, waren zij niettemin innovatief en informatief. Immunoglobuline (Ig) G autoantilichamen tegen het enzym verklaren waarschijnlijk het gebrek aan protease activiteit bij de meeste patiënten met verworven idiopathische TTP.13-15 Redenen voor deze voorbijgaande immuun dysregulatie, evenals voor de selectieve antigene targeting van het VWF-afbrekende protease, zijn nog niet bekend.
Patiënten met familiaire chronische relapsing TTP hebben vaak ULVWF multimeren in hun plasma.11,94 ULVWF multimeren worden gedetecteerd met behulp van een gevoelige agarose gel electroforese methode in sommige plasmamonsters van patiënten tijdens acute episodes van verworven idiopathische TTP, maar niet na herstel.94 Deze bevindingen werden verklaard door onderzoekers die een chronische afwezigheid van ADAMTS13 in plasma ontdekten bij familiaire chronische relapsing TTP, evenals voorbijgaande remming van het enzym tijdens acute episodes van verworven idiopathische TTP.12-15
De meeste patiënten met familiaire TTP hebben minder dan 5% van de normale ADAMTS13 activiteit in hun plasma, ongeacht of het plasma wordt verkregen tijdens of na acute episodes (op voorwaarde dat ze niet recentelijk plasma-infusies hebben gekregen). De meeste patiënten met verworven idiopathische TTP hebben alleen tijdens acute TTP-episoden minder dan 5% van de normale ADAMTS13-activiteit in hun plasma.12-15,24,95 Ernstig tekort aan ADAMTS13 activiteit in plasma van patiënten met TTP correleert met het onvermogen om ULVWF multimeren te klieven wanneer zij van de oppervlakken van endotheelcellen komen (zie Fig. 24.4).59 Als gevolg hiervan blijven ULVWF multimeren, afgescheiden door endotheelcellen, verankerd aan deze cellen en zelf-associëren tot lange strengen59 en zijn zij in staat om passerende bloedplaatjes te vangen door binding van bloedplaatjes GPIbα (Fig. 24.5). 24.5).68 (Bloedplaatjes binden zich niet spontaan aan de kleinere VWF-vormen die circuleren na splitsing van ULVWF-multimeren.)56 Extra bloedplaatjes voegen zich vervolgens bij het groeiende bloedplaatjesaggregaat (gerekruteerd tot het aggregaat via geactiveerde αIIbβ3), dat kan groeien tot het punt waarop het bloedvat wordt afgesloten (zie Fig. 24.4).59,96 Hoewel de meeste gevallen van idiopathische TTP ernstige ADAMTS13-deficiëntie vertonen, heeft een subgroep geen ernstig tekort aan enzymactiviteit zoals gemeten met de momenteel beschikbare tests.97 Het is nog niet duidelijk of dit te wijten is aan interferentie met de enzymactiviteit door antilichamen die niet worden gedetecteerd door de beschikbare tests, weerstand van het VWF tegen splitsing (bv. door oxidatieve modificatie),53 of aan andere oorzaken. Niettemin is het waarschijnlijk dat veel patiënten in deze categorie toch baat zullen hebben bij plasmavervangingstherapie.98 Ook moet worden benadrukt dat ADAMTS13-deficiëntie gevoelig noch specifiek is (ADAMTS13-activiteit is verminderd in veel andere aandoeningen)99 voor het stellen van de diagnose verworven TTP.
ULVWF-strings zijn in staat los te komen van endotheelcellen in afwezigheid van ADAMTS13-activiteit, en mechanisch te worden verbroken met de toenemende spanning die wordt opgewekt door de vloeistofschuifspanning wanneer bloedplaatjes zich hechten en aggregeren.59 De losgemaakte ULVWF-plateletstrings kunnen stroomafwaartse microvaten afsluiten, wat bijdraagt tot orgaanischemie.
Plasma ADAMTS13 activiteit is bijna altijd afwezig of sterk verminderd bij patiënten met familiaire TTP,12,100,101 als gevolg van homozygote of samengestelde heterozygote mutaties van het ADAMTS13 gen.18,24,95,102,103 Mutaties in familiaire TTP zijn gedetecteerd in het hele gen in regio’s die coderen voor verschillende domeinen (zie Fig. 24.2). Bij ernstige congenitale deficiëntie van ADAMTS13 activiteit, beginnen episoden van TTP gewoonlijk tijdens de zuigelingen- of kinderjaren. Bij sommige patiënten treden echter pas na jaren openlijke episoden van TTP op (b.v. tijdens een eerste zwangerschap),102 als ze zich al ooit voordoen. Deze laatste waarneming suggereert dat bij sommige patiënten residuele activiteit van ADAMTS13 blijft bestaan, en dat acute episoden van TTP worden uitgelokt wanneer het vrijkomen van ULVWF uit endotheelcellen de beperkte capaciteit van hun ADAMTS13 om deze te verwerken te boven gaat. Eén geval waarin dit met regelmaat zou kunnen gebeuren is tijdens de zwangerschap: Het is bekend dat de VWF-spiegels tijdens de zwangerschap stijgen.104-106 In overeenstemming met dit idee wordt de diagnose bij vrouwen met congenitale TTP vaak tijdens hun eerste zwangerschap gesteld.29 Bij zuigelingen met een neonataal begin van congenitale TTP en minder dan 5% ADAMTS13 activiteit, is voorbijgaand of progressief nierfalen vaak een prominent onderdeel van de aandoening.107 Deze patiënten lijken klinisch op twee patiënten die in 1960 zijn beschreven door Schulman en collega’s108 en in 1978 door Upshaw109 ; daarom wordt deze pediatrische subgroep soms aangeduid als hebbend “Upshaw-Schulman syndroom.”
Bij veel patiënten met verworven TTP is de plasma ADAMTS13 activiteit ofwel afwezig of sterk verminderd tijdens acute episoden, en neemt toe naarmate zij herstellen, hetzij van eenmalige of terugkerende episoden.13-15 IgG-autoantilichamen die de plasma ADAMTS13 activiteit remmen kunnen worden gedetecteerd bij 44% tot 94% van deze patiënten.13-15,102,110,111 Deze resultaten suggereren de aanwezigheid van een voorbijgaand of intermitterend recurrent defect in immuunregulatie bij veel patiënten met verworven idiopathische TTP geassocieerd met ADAMTS13-deficiëntie. Antilichamen die plasma ADAMTS13 remmen zijn ook geïdentificeerd bij enkele patiënten met ticlopidine- of clopidogrel-geassocieerde TTP.34,112 Het is nog niet bekend of een voorbijgaand ernstig defect in ADAMTS13 productie of overleving voorkomt bij patiënten met verworven TTP die geen detecteerbare autoantilichamen tegen het enzym hebben. Een andere mogelijkheid is dat het niet aantonen van remmende autoantilichamen bij sommige patiënten de beperkte gevoeligheid weerspiegelt van de testsystemen die momenteel in gebruik zijn. Niet-remmende auto-antilichamen die zich zouden kunnen binden en mogelijk de immuunklaring van ADAMTS13 zouden kunnen bemiddelen, worden met het huidige testsysteem niet gedetecteerd.
Eén studie evalueerde ADAMTS13 epitopen die herkend werden door polyklonale auto-antilichamen bij 25 patiënten met verworven TTP,113 waarbij werd vastgesteld dat de antilichaamdoelen onveranderlijk de cysteïnerijke/spacer domein (CS) sequentie omvatten; bij 3 patiënten was dit de enige regio die het doelwit was van de antilichamen. De andere 22 auto-antilichamen reageerden met de CS-domeinsequentie plus de CUB-domeinen (64%), de metalloprotease/disintegrine-achtige/eerste trombospondine-1-achtige domein (MDT)-sequentie (56%), of de regio die de tweede-tot-achtste trombospondine-1-achtige herhalingen (T2-8, 28%) bevat (zie Fig. 24.2). Het propeptidegedeelte werd ook door 20% van de auto-antilichamen geïdentificeerd,113 wat erop wijst dat verwijdering van het propeptide niet vereist is voor de secretie van het actieve enzym.114 Autoantilichamen remmen de activiteit van ADAMTS13 of verminderen de overleving ervan. In een andere studie met zeven patiënten identificeerden Luken et al.115 bij zes patiënten ADAMTS13-autoantilichamen die zich uitsluitend bonden aan het spacerdomein (S); bij de zevende patiënt bonden de antilichamen zich zowel aan het S-domein als aan de T2-8 herhalingen. Door mutagenese stelden deze onderzoekers vast dat de gebieden Thr572-Asn579 en Val657-Gly666 in het spacerdomein van ADAMTS13 de gemeenschappelijke epitopen waren voor de binding van auto-antilichamen.116 Wanneer Arg660, Tyr661, of Tyr665 werd gesubstitueerd door alanine, werd de binding van de auto-antilichamen van de zes TTP-patiënten geëlimineerd.117
Autoantilichamen tegen ADAMTS13 bij patiënten met verworven TTP behoren voornamelijk tot de IgG-klasse,118 hoewel IgM- en IgA-antilichamen ook zijn gedetecteerd.119 Uit klonering en sequencing van de monoklonale antilichamen van patiënten met verworven TTP blijkt dat er een preferentiële incorporatie is van het zware keten gensegment VH1-69 in de variabele regio van de immunoglobulinen.120,121 Deze voorkeur suggereert dat de CDR2 of CDR3 regio van VH1-69 kan bijdragen aan de specificiteit voor een epitoop op het spacer domein van ADAMTS13. In een analyse van de verdeling van antilichaam subtypes in 58 patiënten met acute verworven TTP, werden antilichamen gedetecteerd die behoren tot alle IgG subtypes.118 IgG4 was het meest prevalente subtype, en was aanwezig in 90% van de patiënten, alleen of in combinatie met andere IgG subtypes.
De productie van ADAMTS13 autoantilichamen is vrijwel zeker genetisch beïnvloed. Dit feit wordt benadrukt door de ontdekking bij tweelingzussen van verworven TTP veroorzaakt door ADAMTS13 auto-antilichamen.122 Herval treedt op bij 23% tot 44% van de patiënten met verworven TTP,102,110,123,124 vaak gedurende het eerste jaar na de eerste episode.102 Herval komt het meest voor bij patiënten met de laagste ADAMTS13 activiteitsniveaus (<10%).
Zwangerschap en de postpartum periode vormen een speciale uitdaging met betrekking tot TTP. Ten eerste hebben zwangerschapsvergiftiging en het HELLP syndroom (hemolyse, verhoogde leverenzymen, lage bloedplaatjes) veel klinische kenmerken die overlappen met TTP en kunnen bepaalde pathofysiologische kenmerken zoals systemische endotheeldisfunctie en proteïnurie gemeenschappelijk hebben (zie hoofdstuk 32).125 Het HELLP-syndroom kan bijzonder moeilijk te onderscheiden zijn van TTP omdat het ook microangiopathische hemolytische anemie, verhoogde LDH-spiegels en trombocytopenie vertoont (hoewel gewoonlijk niet zo ernstig als bij TTP).126 TTP tijdens de zwangerschap kan geassocieerd zijn met autoantilichamen tegen ADAMTS13, en de ziekte manifesteert zich gewoonlijk kort na de bevalling of postpartum.127 Schattingen van het risico van recidief tijdens volgende zwangerschappen lopen sterk uiteen, van 26% tot 73% per zwangerschap.102
Plasma ADAMTS13 activiteit bij gezonde volwassenen varieert van ongeveer 50% tot 178% van normaal gepoold plasma met behulp van momenteel beschikbare statische assays. Verminderde ADAMTS13 activiteit is ook gevonden bij leveraandoeningen, gedissemineerde maligniteiten,128 systemische inflammatoire syndromen zoals veroorzaakt door endotoxine,129 acute pancreatitis,130 ernstige sepsis en septische shock,131 door sepsis veroorzaakte DIC,132 en door sepsis veroorzaakte orgaan disfunctie.133-135 Daarnaast kunnen lage ADAMTS13 niveaus gevonden worden tijdens zwangerschap en bij pasgeborenen.136 Met uitzondering van die peripartum vrouwen die openlijke TTP ontwikkelen,102,110 is de ADAMTS13 activiteit die bij patiënten met deze aandoeningen wordt waargenomen niet gereduceerd tot de extreem lage waarden (<5% van normaal) die bij de meeste patiënten met familiaire of verworven TTP worden gevonden.
ADAMTS13 Assays
ADAMTS13 assays bepalen proteolytische activiteit, antigeenniveau, en het niveau van anti-ADAMTS13 autoantilichamen. Vroege ADAMTS13 activiteitstests waren gebaseerd op de afbraak van gezuiverde VWF multimeren in aanwezigheid van denaturerende stoffen en kwantificering van de splitsingsproducten door immunoblotting,74,75 residuele collageenbinding,137 of verminderde door ristocetine geïnduceerde trombocytenaggregatie.138 Hoewel deze tests gevoelig zijn, zijn ze omslachtig en tijdrovend om uit te voeren en vereisen ze het gebruik van denaturerende stoffen. Deze testen werden vervangen nadat studies van de recombinante VWF fragmenten minimale sequenties aan het licht brachten die noodzakelijk zijn voor activiteitsmetingen. Kokame en collega’s voerden gedeeltelijke deleties uit van het VWF A2 domein en identificeerden een minimaal peptide van 73 aminozuren (VWF73, Asp1596-Arg1668) dat efficiënt gekliefd werd door ADAMTS13 in afwezigheid van denaturerende stoffen onder statische omstandigheden.88 Vervolgens zijn verschillende tests ontwikkeld die gebaseerd zijn op de splitsing van peptiden die VWF73 omvatten, zoals fluorescentieresonantie-energieoverdracht (FRET)97 , een HRP-gekoppeld VWF78,139 ELISA,140 immunoblotting,141 en massaspectrometrie142.
In 2008 is een tweede internationaal ringonderzoek uitgevoerd om de prestaties van acht functionele en drie antigeentests voor ADAMTS13 te vergelijken.143 Vergelijking van deze methoden toonde aan dat splitsingstests op basis van gemodificeerde VWF-peptiden als substraten een hoge nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid boden en een lage variantie en variabiliteit tussen de methoden onderling. De FRET-VWF73 assay is sindsdien op grote schaal gebruikt om ADAMTS13 activiteit in patiëntenmonsters te kwantificeren. Hoewel gemakkelijk uit te voeren, de FRET-gebaseerde assay heeft een aantal beperkingen. Ten eerste FRET-VWF73 splitsing met behulp van citraat plasma als de bron van ADAMTS13 moet worden uitgevoerd onder 33 ° C als significante irreversibele inactivering van ADAMTS13 door citraat-gemedieerde calciumchelatie optreedt bij 37 ° C. Ten tweede, optimale fluorescentie signaaldetectie vereist het uitvoeren van de splitsing van de FRET-VWF73 substraat bij pH 6,1, die de snelheid van splitsing vermindert. Ten derde vormen sommige remmende auto-antilichamen bij deze suboptimale pH geen stabiele complexen met ADAMTS13 en blijven deze antilichamen in remmingsstudies onopgespoord. Ten vierde treedt er aanzienlijke interferentie op van het fluorescentiesignaal door hemoglobine en bilirubine ten gevolge van spectrale overlapping. Er is een verbeterd FRET-gebaseerd peptidesubstraat, FRETS-rVWF71, ontwikkeld. ADAMTS13 activiteit in serum en gecitreerd of gehepariniseerd plasma kan worden gemeten met dit verbeterde substraat bij fysiologische pH, ionensterkte en calciumconcentratie, zonder interferentie van de endogene VWF multimeren, of bilirubine of hemoglobine in plasma.78 Een andere beperking van deze op peptide gebaseerde activiteit assays is dat het vermogen van ADAMTS13 om multimeer VWF onder afschuifspanning te klieven niet wordt beoordeeld. Hoewel is aangetoond dat de schuifspanning die door constant vortexen wordt veroorzaakt de splitsing van multimeren VWF bevordert,144 blijft de kwantificering van de splitsingsproducten door immunoblotting tijdrovend. Er zijn ten minste vier commerciële kits beschikbaar voor ADAMTS13 activiteitsmetingen op basis van gerapporteerde methoden. Deze kits zijn echter niet geëvalueerd in directe vergelijkings- en standaardisatiestudies.
ADAMTS13 antigeenniveaus zijn gekwantificeerd door monoklonale en polyklonale antilichamen.145,146 De invloed van truncatie, mutaties en auto-antilichamen op de nauwkeurigheid en gevoeligheid van deze tests is niet duidelijk. Er zijn vijf commerciële testkits beschikbaar voor het meten van ADAMTS13 antigeenniveaus, maar er is geen validatie en vergelijking met andere assays uitgevoerd.
In 2015 werd de eerste internationale standaard voor ADAMTS13 vastgesteld en in 32 laboratoria uit 14 landen getest op ADAMTS13 activiteit en antigeenniveaus ten opzichte van lokale standaarden.147 Deze plasmastandaard, aangeduid als WHO IS (12/252), werd afgeleid van gepoold plasma van 38 normale gezonde donoren. Uit deze studie bleek een consensusgemiddelde van 0,91 eenheden/ml ADAMTS13-activiteit voor dit plasma met een interlaboratoriumvariabiliteit van 12,4%, en 0,92 eenheden/ml ADAMTS13-antigeen met een interlaboratoriumvariabiliteit van 16,3%. De grote interlaboratoriumvariabiliteit was niet in de eerste plaats te wijten aan het gebruik van verschillende lokale standaarden, maar aan methodologische verschillen tussen laboratoria.
Aanalyses van anti-ADAMTS13 autoantilichamen worden gewoonlijk uitgevoerd door hittegeïnactiveerd patiëntenplasma te mengen met een bekende hoeveelheid gepoold normaal plasma en de residuele ADAMTS13 activiteit te meten. Niet-neutraliserende antilichamen worden gedetecteerd door immunoblotting.148
Hoewel tot dusver geen niet-antilichaam ADAMTS13-specifieke remmer is geïdentificeerd, kunnen verscheidene eiwitten en peptiden ADAMTS13-splitsing van VWF onder speciale omstandigheden remmen. Hiertoe behoren hemoglobine, IL-6, trombospondine-1, en neutrofiele α-defensines. In alle gevallen binden de remmende middelen blijkbaar het substraat, VWF, en verhinderen dat het VWF door ADAMTS13 wordt gekliefd. Van hemoglobine werd aangetoond dat het op deze manier werkt, door VWF-strings op het endotheliale oppervlak onder stroming te binden en de splitsing door ADAMTS13 competitief te blokkeren.149 Dit mechanisme kan bijdragen tot de vaso-occlusieve complicaties bij sikkelcelziektepatiënten met aanzienlijke hemolyse en kan TTP verder compliceren wanneer de hemolytische percentages hoog zijn. Hoge concentraties IL-6 (50 en 100 ng/mL) remmen ook de ADAMTS13-gemedieerde splitsing van endotheliale ULVWF-strings onder flow in vitro,50 wat suggereert dat dit mechanisme kan bijdragen aan trombose tijdens cytokine storm150 of het cytokine release syndrome.151 Trombospondine-1, een eiwit dat overvloedig aanwezig is in de α-granules van bloedplaatjes en dat vrijkomt in de circulatie bij activering van bloedplaatjes, bindt de A2-A3 regio’s van VWF, waardoor het de splitsing door ADAMTS13 in vitro op competitieve wijze blokkeert en remt.152 Deze protrombotische eigenschap van trombospondine-1 komt overeen met een gebrekkige rekrutering van bloedplaatjes op geactiveerd of gewond endotheel en een verhoogde embolisatie van bloedplaatjestrombi die werd waargenomen bij trombospondine-1 knock-out muizen.153 Humane neutrofiele peptiden, bekend als α-defensines, die vrijkomen uit geactiveerde neutrofielen, kunnen binden aan het VWF A2-domein en ADAMTS13-gemedieerde splitsing competitief blokkeren.154 De concentraties van α-defensines nemen tot zevenvoudig toe in het plasma van patiënten met verworven TTP.