Alai

A brief history of T. reesei

De oudste biotechnologische praktijken waarbij schimmels worden gebruikt voor de productie van bier, wijn en kaas dateren wellicht van enkele millennia geleden, d.w.z. van het prille begin van de geletterde beschaving zelf. De ontdekking van de filamenteuze mesofiele ascomycete Trichoderma reesei (destijds Trichoderma viride) voor zijn verbazingwekkende vermogen om extracellulaire cellulases te produceren, vond daarentegen iets meer dan 70 jaar geleden plaats. Aanvankelijk werd het destructieve potentieel van de oorspronkelijke Trichoderma sp., geïsoleerd uit rottend materieel van het Amerikaanse leger op de Solomon-eilanden tijdens de Tweede Wereldoorlog, als nogal problematisch beschouwd. Niettemin duurde het niet lang voordat onderzoekers van de Natick Army Research Laboratories onder leiding van Mary Mandels en Elwyn T. Reese, de naamgevende onderzoeker, probeerden dit problematische potentieel om te zetten in doelgerichte producten . Bij een screening van 14.000 schimmels van de Quartermaster Collection bleek Trichoderma sp. QM6a een uitstekend vermogen om natieve kristallijne cellulose af te breken. De aanduiding “QM6a” voor het laatst overgebleven originele Trichoderma-isolaat, waarmee het werd geïdentificeerd als de zesde van zes culturen van de schimmel die in de Quartermaster Collection in Natick waren opgeslagen, bleef bestaan. Deze specifieke stam wordt niet alleen beschouwd als de referentiestam van T. reesei, maar is ook de stam waarvan alle mutanten die vandaag in de industrie worden gebruikt, zijn afgeleid.

Toen en nu werd het onderzoek naar T. reesei aangedreven door het idee dat zijn afgescheiden cellulases een spelveranderende invloed zouden kunnen hebben op de 200 jaar oude strijd om op economische wijze brandstoffen te produceren uit hernieuwbare, lignocellulosehoudende biomassa. Het onderzoek van T. reesei heeft sindsdien baanbrekend werk verricht met het concept van enzymatische versuikering van cellulose door een synergetische combinatie van verschillende cellulase-activiteiten en heeft de basis gelegd voor ons huidig begrip van de regulering van de betrokken enzymen. Het belangrijkste cellobiohydrolase CBH1 (CEL7a) was ook het eerste eukaryote cellulase dat werd gekloond en het eerste cellulase waarvan de structuur werd opgelost. Een belangrijke stap naar de industriële toepassing van T. reesei-cellulasen was de ontwikkeling van efficiënte stammutagenese- en screeningprocedures in de jaren zeventig. In de daaropvolgende twee decennia kon de titer van het extracellulaire eiwit dat door de oorspronkelijke stam QM6a werd geproduceerd tot het 20-voudige worden verhoogd door mutageneseprogramma’s aan Natick en Rutgers University. Dit laatste culmineerde in de isolatie van stam RUT-C30 (waarbij “RUT” staat voor Rutgers). Hoewel de gouden standaard voor cellulaseproductie in de industrie naar verluidt hoger is dan 100 g/L, is deze stam nog steeds het prototype van de cellulase-hyperproducent die beschikbaar is voor het publieke domein, met titers van extracellulaire proteïnen die 30 g/L bereiken op het cellulase-inducerende substraat lactose.

Naarmate duidelijk werd dat voor een efficiënte en volledige versuikering van lignocellulosehoudende biomassa tot vergistbare suikers veel meer enzymatische activiteiten vereist zijn dan aanvankelijk werd verwacht, werden aanvankelijk echter andere commerciële toepassingen voor cellulasen ontwikkeld. Onderzoek waarbij T. reesei betrokken was, bleef nieuwe wegen inslaan in de enzymologie van de afbraak van zowel cellulose als hemicellulose, en doet dat ook nu nog. Door middel van atoomkrachtmicroscopie met hoge snelheid is nu ook de afbraak van cellulose zichtbaar gemaakt, waarbij is aangetoond hoe het belangrijkste cellobiohydrolase CBH1/CEL7A in één richting langs het cellulose-oppervlak glijdt. In het begin van de jaren negentig waren transformatietechnieken beschikbaar gekomen die genetische manipulatie van T. reesei mogelijk maken. In de loop van het volgende decennium hebben deze technieken een belangrijke rol gespeeld bij het verwerven van nieuwe inzichten in de regulering van zijn enzymen en bij het wijzigen van het enzymprofiel dat door de schimmel wordt uitgescheiden. In die tijd was T. reesei ook een van de eerste gastheren voor de expressie van zoogdiereiwitten, zoals blijkt uit de expressie van kalfs-chymosine onder cbh1 (cel7a) expressiesignalen. Tegen het einde van de jaren 1990 ontdekten Kuhls et al. dat Hypocrea jecorina in feite de seksuele vorm van T. reesei is, wat de reden is waarom in een aantal latere publicaties H. jecorina als soortnaam werd gebruikt in plaats van T. reesei. Een meer gedetailleerde studie van de seksuele ontwikkeling leidde tot de hypothese dat stam QM6a in feite vrouwelijk steriel is, wat vervolgens in verband kon worden gebracht met een mutatie in het MAP-kinase scaffold coderend gen ham5.

Tijdens de millenniumwisseling, die voor de genetica kan worden gezien als een ommekeer van de studie van geïsoleerde genen en pathways naar de studie van volledige genomen, kwam T. reesei in het zogenaamde Genomic Era terecht. De eerste globale benadering om de genexpressie van T. reesei te bestuderen in 2003 was een transcriptomische studie door Foreman et al. , die DNA-microarrays construeerden op basis van cDNA’s die overeenkwamen met meer dan 5000 verschillende transcripten van het T. reesei-genoom. Vijf jaar later legden de sequentiebepaling en analyse van het genoom van het oorspronkelijke T. reesei-isolaat QM6a de basis voor de grootschalige toepassing van genoombrede studies. In de daaropvolgende jaren leidde de vergelijkende genomische analyse van een aantal cellulasehyper- en -niet-producerende stammen tot de ontdekking van potentiële nieuwe factoren die betrokken zijn bij de cellulasehyperproductie, zoals nucleocytoplasmatisch transport, vacuolaire eiwittransporten en mRNA-verloop. Deze vergelijkende analyses profiteerden van het feit dat alle T. reesei-stammen die in de academische wereld en de industrie worden gebruikt, zijn afgeleid van stam QM6a. Vijfenzestig jaar na de eerste studies van Elwyn Reese over de cellulose-afbraak door T. reesei, bedraagt de wereldwijd geïnstalleerde capaciteit voor de productie van cellulose-biobrandstoffen nu 480,5 miljoen liter ethanol per jaar (MMLY), waarvan 380,5 MMLY (of ruwweg 80%) wordt geproduceerd met behulp van T. reesei-enzymformuleringen zoals Accellerase en Cellic (Fig. 1a). Ongetwijfeld vereiste deze inspanning een rijping van de onderliggende technologie op verschillende niveaus, waaronder procestechniek en substraatvoorbehandeling. Toch was en blijft de productie en optimalisering van enzymformules voor de saccharificatiestap van biomassa een van de sleutelfactoren die de kostprijs van cellulose-ethanolprocessen bepalen. Bovendien is de enzymproductie met T. reesei geenszins beperkt tot de productie van bioraffinage-enzymen. Ongeveer 11 % van alle door de Vereniging van fabrikanten en formuleerders van enzymproducten geregistreerde technische enzymformuleringen wordt geproduceerd met T. reesei als expressiegastheer (Fig. 1b, c). Last but not least blijft T. reesei van belang voor het onderzoek, getuige de meer dan 100 onderzoeksartikelen die jaarlijks over de schimmel of zijn enzymen worden gepubliceerd (fig. 1d).

The T. reesei biomass enzyme mix: new insights and limitations

In de natuur wordt de afbraak van lignocellulose zelden door één enkel organisme bewerkstelligd. Het wordt eerder bereikt door de opeenvolgende volgorde en collectieve inspanning van verschillende organismen die meerdere koolhydraat-actieve enzymen (CAZymes) produceren om de verschillende polymeren af te breken. Het is dan ook niet verwonderlijk dat de afgescheiden cellulasemix van T. reesei aanzienlijk moest worden aangepast om een kostencompetitieve enzymformulering te leveren voor de volledige versuikering van lignocellulose. Al vroeg realiseerden onderzoekers zich dat T. reesei-formuleringen onvoldoende β-glucosidase-activiteit hadden omdat het grootste deel van de activiteit gebonden is aan de schimmelcelwand. Een verhoogde β-glucosidase-activiteit verbetert bijgevolg de cellulose-afbraak omdat ze de remming van het product tegengaat door cellobiose, dat op zijn beurt vrijkomt door de coöperatieve werking van endoglucanases en cellobiohydrolases . Dit terugkoppelingsmechanisme zou anders de versuikering van cellulose ernstig vertragen. Evenzo remmen van hemicellulose afgeleide xylo- en mannooligosachariden de cellobiohydrolases van T. reesei, hetgeen er sterk op wijst dat voldoende β-xylosidase- en β-mannosidase-activiteiten vereist zijn om lignocellulose efficiënt af te breken. In 2003 beschreven Foreman et al. twee eiwitten die samen met de voornaamste cellulasen worden geïnduceerd en noemden ze cellulose geïnduceerd eiwit 1 en 2 (CIP1 en CIP2). Sindsdien werd aangetoond dat zij belangrijk zijn voor de efficiënte afbraak van lignocellulose. Recente resultaten tonen aan dat CIP1 structurele overeenkomsten vertoont met lyases, hoewel de lyase-activiteit niet kon worden aangetoond, en dat CIP2 een glucuronoylesterase is van de CE15-familie. Een ander belangrijk gesecreteerd eiwit is de swollenine SWO1, die een koolhydraatbindende module (CBM) bevat, gekoppeld aan een expansine-achtig domein. Ondanks de celluloseverstorende activiteit, versterkt SWO1 synergetisch de endoxylanase activiteit eerder dan endoglucanase of cellobiohydrolase activiteit tijdens enzymatische hydrolyse van voorbehandeld maïssteng. Een van de voorgestelde werkingsmechanismen is dat het het xylongedeelte van lignocellulose toegankelijker maakt voor afbraak door xylanases en zo indirect de werking van cellulases bevordert. De grootste revolutie van de laatste jaren in de afbraak van cellulose was ongetwijfeld de ontdekking van de lytische polysaccharide mono-oxygenasen (LPMO). Deze enzymen introduceerden een nieuw, oxidatief mechanisme voor de afbraak van polysacchariden. Bij de afbraak van cellulose wordt aangenomen dat LPMO’s inwerken op het oppervlak van kristallijne cellulosefibrillen, waardoor deze toegankelijker worden voor cellulasen. Intrigerend is dat deze enzymen de voor dit proces benodigde elektronen via elektronentransfer over lange afstand kunnen onttrekken aan lignine in de plantencelwand, waardoor de afweermechanismen van de plant worden tegengewerkt. Als alternatief kunnen GMC oxidoreductases of cellobiose dehydrogenases werken als elektronendonoren . Deze bevinding zou goed kunnen verklaren hoe T. reesei zijn LPMO’s van brandstof voorziet, aangezien eerder werd aangetoond dat verscheidene van dergelijke GMC-oxidoreductases inderdaad worden geïnduceerd door tarwestro. Dit oxidatieve mechanisme is echter geenszins beperkt tot cellulose-depolymerisatie. Oorspronkelijk aangetoond voor chitine , spelen LPMOs ook een rol in xyloglucan en amylose degradatie . In de CAZy-database zijn enzymen die tot deze groep behoren geherclassificeerd tot “hulpactiviteiten” (AA), in tegenstelling tot hun eerdere classificatie als glycosidehydrolasen (b.v. GH61), en worden zij aangetroffen in de AA-families 9-11 en 13 . Zoals eerder uiteengezet, zijn hemicellulolytische activiteiten belangrijk voor de volledige versuikering van lignocellulose (besproken door Harris et al. ). Verschillende hoeveelheden van individuele activiteiten zijn vereist afhankelijk van de hemicellulose types aanwezig in het substraat. Het is daarom opmerkelijk dat het enzymatische repertoire van T. reesei enkele duidelijke beperkingen vertoont voor bepaalde types hemicellulose-specifieke verbindingen. Een van die ontbrekende activiteiten is α-xylosidase. Toevoeging van α-xylosidase aan een commerciële enzymformulering van T. reesei verbeterde het vrijkomen van xylose en glucose uit voorbehandeld maïssteng. Ook de toevoeging van een GH familie 5 cellulase met activiteit tegen glucomannan en xylan verbeterde een synthetisch T. reesei enzympreparaat aanzienlijk. Andere activiteiten die ontbreken of zeer beperkt zijn in de T. reesei cellulase mix zijn endo-arabinase en verschillende pectinase activiteiten. Aanvulling van commerciële cellulase-mixen met deze enzymactiviteiten verbeterde bijgevolg de versuikering van verschillende substraten. Een andere nog te beantwoorden vraag is de in vivo functie van gesecreteerde laccase-achtige multicopper oxidases gecodeerd in het T. reesei genoom.

Verbetering van T. reesei als gastheer voor eiwitproductie

Gezien het feit dat de cellulases en de meerderheid van de andere lignocellulose afbrekende enzymen gecoördineerd en conditioneel tot expressie komen , vormt hun transcriptionele regulatie een logisch engineering doel om de cellulase productie door de schimmel te verbeteren. Een van de belangrijkste regulatoren is de koolstofkatabolietrepressie mediërende C2H2-type transcriptiefactor CRE1. CRE1 schakelt de transcriptie van zijn doelgenen uit wanneer gunstigere koolstofbronnen zoals glucose aanwezig zijn. De afknotting ervan is een van de belangrijkste oorzaken van de verbeterde cellulaseproductie die bereikt werd door willekeurige mutagenese van T. reesei QM6a, wat leidde tot stam RUT-C30, die zowel een hoger basaal niveau als een hoger geïnduceerd niveau van cellulaseproductie vertoont. Ook het vervangen van CRE1-bindende motieven in de promotorregio van het belangrijke cellobiohydrolase cel7a door die van een bekende cellulase-activator vermindert de repressie van koolstofkatabolieten en verhoogt de cel7a-transcriptie onder activerende en onderdrukkende omstandigheden. Bovendien is de transcriptie van cellulase, xylanase en een aantal andere genen die coderen voor enzymen die betrokken zijn bij de afbraak van lignocellulose strikt afhankelijk van de Zn(II)2Cys6-type transcriptionele activator XYR1 . Dit staat in contrast met andere schimmels, waaronder de Sordariomyceten Neurospora crassa en Fusarium fujikuroi, waar de ortholoog van XYR1 uitsluitend de expressie van xylanase-genen moduleert. Een mutatie die leidt tot een afgeknotte vorm van XYR1 bleek het cellulase-negatieve fenotype te veroorzaken van stam QM9136, die afkomstig is uit het mutageneseprogramma in Natick. Dienovereenkomstig hebben cellulase-over- en -hyperproducerende mutanten verhoogde niveaus van mRNA voor de transcriptionele activatoren xyr1 . Het is ook bewezen dat overexpressie van XYR1 leidt tot een hogere expressie van cellulases en de katabolietrepressie ervan opheft in de aanwezigheid van glucose . Bovendien leidt een puntmutatie binnen een vermoedelijke regulerende regio van XYR1 tot een vergelijkbaar ontregeld expressiepatroon . Naast XYR1 en CRE1 reguleren drie transcriptiefactoren ACE1, ACE2 en ACE3 de expressie van cellulase en xylanase in T. reesei . Net zoals CRE1, is ACE1 een C2H2 zinkvinger repressor en zijn deletie verbetert dan ook de productie van zowel cellulases als xylanases . ACE2 en ACE3 zijn, net als XYR1, Zn(II)2Cys6 type transcriptie activatoren . Wanneer ace2 afwezig is, vermindert de transcriptie van cellulases en xylanases dienovereenkomstig, hoewel cellulase-inductie door sophorose blijkbaar onaangetast blijft. Deletie van ace3 heft cellulase transcriptie volledig op, maar vermindert slechts die van xylanases. Terwijl overexpressie van ACE2 nog niet is geprobeerd, leidt overexpressie van ACE3 tot verhoogde activiteiten van beide typen enzymen, evenals de overexpressie van zes andere tot nu toe ongekarakteriseerde regulatoren. Hiertoe behoren nog twee Zn(II)2Cys6-type transcriptiefactoren, alsmede twee WD40-eiwitten, een bromodomein-eiwit en een gcn5-verwant acetyltransferase. Alle drie de Zn(II)2Cys6 transcriptionele activatoren (XYR1, ACE2 en ACE3) lijken op het goed gekarakteriseerde Gal4 eiwit van S. cerevisiae. Het is bekend dat Gal4 het Gcn5-bevattende SAGA-complex rekruteert en daardoor de transcriptie van zijn doelgenen bevordert door histonacetylering en euchromatinevorming. De Gcn5 ortholoog van T. reesei is onontbeerlijk voor cellulase expressie en betrokken bij de acetylering van histonen in de cbh1 promoter. De laatste jaren is een beeld ontstaan waaruit blijkt dat de transcriptie van cellulases en verwante CAZymes in fungi wordt beheerst door een combinatie van vele transcriptiefactoren die een complex transcriptioneel-regulatoir netwerk vormen dat wordt beïnvloed door tegenwerkende activatoren en repressoren. In Penicillium oxalicum bijvoorbeeld moduleren twintig transcriptiefactoren de activering of repressie van cellulasegenen. Van deze factoren werd ClrB geïdentificeerd als de belangrijkste integrator van alle andere regulatoren met hun doelgenen. Homologen van deze regulatoren worden aangetroffen in T. reesei, maar gezien de diversiteit van de aanpassingen in de regulering van de plantencelwand wordt verwacht dat andere en andere regulatoren ook een belangrijke rol zullen spelen. Een andere belangrijke speler in de cellulase regulatie is het T. reesei ortholoog van het raadselachtige Aspergillus LaeA, dat betrokken is bij de regulatie van secundaire metaboliet genclusters in verschillende schimmels. Terwijl de deletie van dit methyltransferase leidt tot een sterke downregulatie van verschillende cellulase en andere CAZyme genen, kan de overexpressie ervan hun expressie sterk bevorderen. Vergelijkbare effecten werden gevonden voor het met LAE1 interagerende VEL1 eiwit van het VELVET complex .

De meeste van de hierboven genoemde studies geven fundamentele inzichten in de regulatie van cellulase vorming. Aangezien de meeste van deze studies werden uitgevoerd in het oorspronkelijke T. reesei isolaat QM6a of de matig overproducerende stam QM9414, blijft het onduidelijk of en in welke mate deze effecten kunnen worden doorgevoerd in hyperproducerende stammen. In deze stammen zouden processen zoals translatie, secretie en omzet van gesecreteerde enzymen, en niet zozeer transcriptie, een verdere toename van de cellulaseproductie kunnen beperken. Het zal interessant zijn om te zien of verschillende van de gerapporteerde manieren om de cellulase-genexpressie te verbeteren al dan niet kunnen worden gestapeld en hoe dergelijke stammen zouden presteren in vergelijking met de door willekeurige mutagenese verkregen hyperproducenten.

Het opdrijven van de transcriptie van het betrokken gen leidt niet altijd tot een betere productvorming, vooral niet in het geval van niet-schimmeleiwitten. Een succesvolle strategie om lage productvorming te omzeilen is de fusiegen-benadering waarbij naast de promotor en terminator-regio van een sterk tot expressie komend gen ook het gecodeerde eiwit als expressieversterker wordt gebruikt. Voor T. reesei is dit het cellobiohydrolase dat codeert voor cel7A, het eiwit dat het sterkst tot expressie komt onder cellulase-inducerende omstandigheden. Aangenomen wordt dat deze genfusies in het algemeen de mRNA-stabiliteit, de import in het ER en de passage door de secretorische route verhogen. Daartoe wordt vaak gebruik gemaakt van de modulaire structuur van CEL7A, die bestaat uit een katalytische module, een linker en een CBM, waarbij het C-terminale CBM wordt vervangen door het gen van interesse. Er zijn nu varianten van deze genfusie-benadering beschikbaar die het eiwit naar de ER brengen voor correcte vouwing, disulfidebrugvorming en glycosylering, maar vervolgens streven naar intracellulaire eiwitaccumulatie om degradatie van het gewenste product door extracellulaire proteasen te voorkomen. Een van deze strategieën maakt gebruik van hydrofobines met een aangehecht ER retentiesignaal als drager. Deze fusie-eiwitten assembleren zichzelf tot micella-achtige structuren en kunnen worden gezuiverd met behulp van een op oppervlakteactieve stoffen gebaseerd waterig tweefasensysteem. Een andere strategie om eiwitten op de ER te richten maakt gebruik van het γ-zeïnepeptide (ZERA) dat is afgeleid van het opslageiwit van maïs. Op analoge wijze vormen deze zelfassemblerende fusie-eiwitten eiwitlichamen die omgeven zijn door een ER-membraan dat hen beschermt tegen proteolyse. Om schimmels te ontwikkelen als efficiënte gastheren voor de productie van zoogdiereiwitten is ook de inactivering nodig van de vaak voorkomende proteasen in de fermentatiebouillon. In een systematische studie werden verschillende gesecreteerde proteasen die verband houden met de afbraak van biofarmaceutica, waaronder antilichamen, interferon α 2b, en insulineachtige groeifactor, geïdentificeerd en verschillende geïnactiveerd. Dit leidde niet alleen tot een drastische vermindering van de protease-activiteit, maar ook tot een sterke toename van de stabiliteit van alle drie recombinante proteïnen, waarbij het antilichaam het meest uitgesproken effect vertoonde. Hoewel reeds eerder pogingen werden ondernomen om het N-glycosylatiepatroon te verbeteren met het oog op de productie van hoogwaardige therapeutische eiwitten, lijkt het momenteel niet mogelijk om een authentiek humaan glycosylatiepatroon te creëren in een schimmelexpressiegastheer. Het is daarom de vraag of dergelijke biofarmaceutica in de toekomst door schimmelcelfabrieken zullen worden geproduceerd, vooral gezien de snelle ontwikkeling van CHO-cellen.

De hierboven genoemde hydrofobines zijn een andere groep eiwitten die veel aandacht hebben gekregen vanwege hun oppervlakte-actieve eigenschappen. Deze kleine, extracellulaire eiwitten assembleren zichzelf tot eiwitlagen op hydrofobe/hydrofiele interfaces door hun amfifiele eigenschappen en maken hydrofobe oppervlakken bevochtigbaar of hydrofiele oppervlakken hydrofoob. Zij hebben een groot potentieel in voedsel- en medische toepassingen om hydrofobe materialen te dispergeren, schuim te stabiliseren of verschillende moleculen op oppervlakken te richten. Cerato-platanines zijn een andere groep van kleine, afgescheiden eiwitten met vier geconserveerde cysteïnen. Zij binden aan chitine en N-acetylglucosamine oligosacchariden en bezitten zelfassemblerende eigenschappen aan hydrofobe/hydrofiele interfaces. In tegenstelling tot hydrofobines versterken cerato-platanines veeleer de polariteit/apolariteitseigenschappen van oppervlakken. Een targeting functie wordt ook toegeschreven aan CBM’s aanwezig in verschillende CAZymes. Ze kunnen de hydrolytische activiteit van het katalytische domein waaraan ze gehecht zijn verbeteren en leiden tot een gunstiger pH- en temperatuur optimum. Hun koolhydraatbindende eigenschappen kunnen verder worden benut voor affiniteitszuivering van fusie-eiwitten met behulp van bijvoorbeeld cellulosekolommen. De brede waaier van andere toepassingen van recombinante CBM’s is onlangs elders besproken.

Trichoderma reesei voor geconsolideerde bioprocessing en whole cell catalysis

Geconsolideerde bioprocessing (CBP) wordt klassiek opgevat als de integratie van de cellulolytische enzymproductie, enzymatische hydrolyse en fermentatiestappen van een cellulosehoudend ethanolproductieproces in één enkele eenheidsverrichting. Daarom zou één enkel organisme met goede cellulolytische eigenschappen en een efficiënt fermentatietraject voor ethanol wenselijk zijn. Toch heeft ook het gebruik van microbiële consortia enige aandacht gekregen. Helaas is er momenteel geen enkel organisme beschikbaar dat aan beide eisen voldoet (Fig. 2). Bijgevolg zijn pogingen ondernomen om ethanologenen om te vormen tot cellulolytische organismen of cellulolytische organismen om te vormen tot ethanologe organismen. In de context van het eerste scenario heeft T. reesei vaak gediend als CAZyme genendonor, vooral voor cel5a en cel7b die coderen voor twee van zijn endoglucanases en voor zijn twee cellobiohydrolases cel6a en cel7a (Tabel 1). In alle gepubliceerde studies beperkte de relatief lage secretiecapaciteit van S. cerevisiae de substraatconversie door de gesecreteerde of membraanverankerde heterologe CAZymen. Vandaar dat voor hoge ethanolopbrengsten met realistische cellulosehoudende substraten aanvulling met commerciële T. reesei enzymcocktails nodig was. Niettemin, terwijl de inspanningen voor het verbeteren van de secretie en oppervlakte display capaciteit van gemanipuleerde S. cerevisiae stammen nu aan de gang zijn, hebben de momenteel beschikbare cellulase-display stammen reeds het potentieel om te leiden tot aanzienlijke verminderingen van de vereiste enzymbelasting voor biomassa saccharificatie . In de context van het tweede scenario is T. reesei zelf een veelbelovend doelorganisme. Maar hoewel deze schimmel van nature het vermogen bezit om alle biomassa-gerelateerde suikers te metaboliseren en om te zetten in ethanol, zijn de opbrengsten laag en wordt azijnzuur gevormd als een ongewenst bijproduct. Anderzijds zijn grootschalige fermentatieregimes voor T. reesei goed ingeburgerd wegens zijn brede toepassing in commerciële enzymproductie, en de moleculaire instrumenten voor zijn genetische manipulatie zijn ook zeer goed ontwikkeld. Een van de resterende grote uitdagingen voor het gebruik van T. reesei als CBP-organisme is dat verschillende van zijn cellulase- en glycolytische genen worden onderdrukt door hypoxie, wat noodzakelijk is voor de productie van ethanol. Bovendien vormt de transcriptionele repressie van cellulases in aanwezigheid van ethanol een verdere uitdaging die moet worden overwonnen. De cellulase hyperproducerende stam RUT-C30 heeft echter een hogere tolerantie voor ethanol in vergelijking met stam QM9414 van de Natick-lijn en vormt daarom een perfect platform om T. reesei te ontwikkelen als een CBP-organisme, vooral omdat het ook koolstofkatabool onderdrukt is. Bovendien vertoont RUT-C30 in aanwezigheid van lignocellulosepulp een pelletachtige morfologie tijdens de eerste fasen van de fermentatie, die op een groeionafhankelijke manier kan worden bereikt door toevoeging van de oppervlakteactieve stof Triton X-100 en vervolgens ook tot een hogere enzymproductie leidt. Dit is belangrijk omdat een slechte mengbaarheid en lage maximale celdichtheden als gevolg van filamenteuze groei tot dusver het gebruik van T. reesei als CBP-organisme belemmerden. Meer in het algemeen zou geconsolideerde bioprocessing ook kunnen worden gebruikt om andere geïntegreerde processen te beschrijven waarbij het substraat niet noodzakelijk lignocellulosehoudende biomassa is, maar een ander biopolymeer zoals chitine of zetmeel, en het product niet ethanol is, maar een andere metaboliet . Met het oog hierop waren een aantal recente studies gericht op de overproductie van verschillende metabolieten via engineering van T. reesei (tabel 2). De opbrengsten die konden worden bereikt, waren in de meeste gevallen echter ver verwijderd van commercialisering, zodat verdere optimalisering nodig was.

Tools for cell design and engineering

Tot voor kort zijn er twee uitgebreide overzichtsartikelen over de moleculaire gereedschapskist van T. reesei en andere Trichoderma-soorten verschenen, maar deze willen we nu actualiseren met de meest recente vorderingen op dit terrein. Gerichte stam engineering voor verbeterde cellulase productie of voor metabole engineering vereist efficiënte methoden om gerichte genetische veranderingen in het organisme aan te brengen. De over het algemeen lage efficiëntie van gene targeting is lange tijd een grote uitdaging geweest om een redelijk aantal transformanten te verkrijgen door homologe integratie van een deletie- of expressiecassette. Dit probleem is voornamelijk opgelost door componenten van de niet-homologe eindverbinding (NHEJ) in het DNA-herstelproces zoals tku70 of tmus53 te inactiveren. Stammen die van tku70 zijn verwijderd, vertonen een verbeterde gen-doelgerichtheid, hoewel de efficiëntie van de homologe integratie in deze stammen nog steeds kan variëren naar gelang van de doel-locus en zo tot 30% kan dalen. Op basis van deze verbetering werden een aantal nieuwe benaderingen ontwikkeld om expressiecassettes in een gedefinieerde genomische regio in te brengen en daarbij pleiotrope effecten als gevolg van hun willekeurige integratie te vermijden. Met een tku70 achtergrond ontwikkelden Jorgensen et al. een expressieplatform dat gebruik maakt van de gemakkelijk te screenen ade2 locus als de voorkeurslocatie voor integratie. Na integratie van de expressiecassette in deze locus wordt ade2 vernietigd en de resulterende transformanten ontwikkelen een duidelijke rode pigmentatie. In een andere studie werden de pyr4 en asl1 loci gekozen om een stam met uridine en l-arginine auxotrofie te ontwikkelen die plaatsgerichte integratie op deze plaatsen mogelijk maakt. Ouaedraogo et al. volgden een andere strategie en brachten het S. cerevisiae I-SceI meganuclease tot expressie in T. reesei. I-SceI genereert kunstmatige dubbelstrengsbreuken op een I-SceI-herkenningsplaats die vooraf op een vooraf gedefinieerde locus was aangebracht en verbeterde zowel de transformatie- als de homologe-integratieefficiëntie. In een vervolgstudie werden door I-SceI gemedieerde dubbelstrengsbreuken gecombineerd met een tku70 deletie. Het onvermogen om dubbelstrengbreuken via NHEJ te herstellen bevordert de integratie van de cassette, wat leidt tot homologe recombinatie-efficiënties tot 100 %. Een revolutie voor genetische manipulatie of genoom-editing werd geïntroduceerd met het CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 systeem . Dit systeem, dat zowel de noodzaak van een dergelijke technologie als het toenemende belang als enzymproducent onderstreept, werd voor het eerst getest op filamenteuze schimmels in T. reesei . Het introduceert specifieke DNA-dubbelstrengbreuken om het richten van genen te stimuleren en is uitsluitend afhankelijk van een Cas9 (CRISPR-geassocieerd) nuclease dat een enkel chimeer geleider-RNA gebruikt voor het richten. Nauwkeurige targeting van dit RNA-geleide Cas9 op een specifieke DNA-sequentie wordt bereikt door de protospacer-sequentie van het gids-RNA via eenvoudige basenparing. Door gebruik te maken van 200 bp up- en downstream flanking regions voor de gendeletieconstructie konden HR-frequenties van meer dan 90 % worden bereikt. Dubbele en drievoudige deleties kwamen voor met een frequentie van respectievelijk 45 en 4 % na één enkele transformatie-ronde. Terwijl in deze studie in vitro getranscribeerde gids-RNA’s met de deletiecassette werden getransformeerd in een Cas9-exponderende T. reesei, gebruikten Nødvig et al. twee flankerende ribozymsequenties om gids-RNA’s vrij te maken uit een groter transcript dat ook codeert voor het Cas9-enzym in verschillende Aspergilli. Een ander essentieel instrument dat nodig is bij zowel recombinante eiwitexpressie als stam-engineering zijn promotors die genexpressie op een controleerbare manier mogelijk maken. Hoewel er een aantal induceerbare en repressibele promotors beschikbaar zijn met de verschillende cellulase-promoterregio’s, hebben deze meestal nadelen omdat hun expressie gekoppeld is aan het gastmetabolisme en activatoren beperkend kunnen zijn als gevolg van promotortitratie-effecten. Nuttige alternatieven zijn onder meer een reeks l-methionine-onderdrukbare T. reesei-genen met verschillende basale expressiesterkten. Aangetoond werd dat één van deze promotors repressieve expressie van verschillende reportergenen kan bewerkstelligen op verschillende koolstofbronnen, waaronder tarwestro. In een soortgelijke studie werd de promoter van een koperpermeasegen van T. reesei gebruikt om de expressie van de belangrijke cellulase- en hemicellulase-regulator xyr1 te controleren in afwezigheid van koper . Gezien het feit dat koperhoudende enzymen van AA-familie 9 belangrijke componenten zijn van de cellulasemix van T. reesei , is het echter twijfelachtig of dit systeem kan worden toegepast in een scenario voor cellulaseproductie.

Naast deze opwindende moleculaire hulpmiddelen zijn er nu ook enkele oudere trucs uit de klassieke genetica beschikbaar. De stamontwikkeling van T. reesei werd lange tijd gehinderd door het feit dat men dacht dat de schimmel aseksueel was, waardoor stamkruising onmogelijk was. Een mijlpaal in dit verband was de ontdekking dat QM6a een MAT1-2 paringstype locus heeft en gemakkelijk kan worden gekruist met bepaalde MAT1-1 T. reesei wild-type isolaten. Maar wanneer de MAT1-2 locus van QM6a werd vervangen door zijn MAT1-1 tegenhanger, werden geen stromata gevormd bij confrontatie met de oorspronkelijke MAT1-2 QM6a stam. Bijgevolg was het onmogelijk om paring te gebruiken voor stam engineering in de verschillende academische en industriële T. reesei stammen afgeleid van QM6a. Met behulp van een systeembiologische benadering werd het ontbrekende gen dat verantwoordelijk is voor vrouwelijke steriliteit geïdentificeerd als ham5 . In N. crassa codeert ham-5 voor een eiwit dat dient als een MAP kinase scaffold tijdens celfusie. Herintroductie van een functioneel ham5 herstelt de stromata vorming in stam QM6a en maakt het herstel van de vrouwelijke fertiliteit mogelijk in andere stammen afkomstig van QM6a achtergronden. Deze bevinding is vooral belangrijk omdat kruising met de eerder genoemde H. jecorina isolaten kan leiden tot segmentaal aneuploide nakomelingen. Met dit instrument in de hand is de basis gelegd voor het identificeren van relevante mutaties die leiden tot bv. cellulase hyperproductie. Dit is belangrijk omdat traditionele complementatiebenaderingen om gen(en) te identificeren die mutante fenotypes veroorzaken, grotendeels niet succesvol waren bij soorten zoals T. reesei. En hoewel sequencing met hoge doorvoer en vergelijkende genoomanalyse gemakkelijk mutaties kunnen identificeren in de QM6a-stamlijn van cellulasehyper- en -nulproducenten, heeft dit slechts in een paar gevallen al geleid tot de koppeling van een mutatie aan een bepaald fenotype . Maar in gevallen waarin een groot aantal mutaties werd gevonden of de mutaties genen met onbekende functie aantastten, heeft vergelijkende sequentieanalyse de aard van de gewenste doelgenen niet aan het licht gebracht . Verscheidene onderzoekers hebben daarom met succes bulk segregant analyse toegepast in combinatie met next-generation sequencing om relevante mutaties te identificeren. Bij deze aanpak wordt de mutant gekruist met een referentiestam en worden de genomische DNA’s van de segreganten die het gewenste fenotype vertonen samengevoegd en gesequeneerd. Genoomvergelijking van deze pool van gesequenteerd DNA met de genomen van de ouderstammen kan dan geconserveerde mutaties aan het licht brengen die relevant zijn voor het fenotype. Mutaties die geen verband houden met het fenotype zullen ondervertegenwoordigd zijn. Hoewel niet kan worden verwacht dat deze aanpak zal leiden tot de identificatie van één enkele mutatie, omdat mutaties in de nabijheid van de relevante mutatie gewoonlijk samen voorkomen, wordt het aantal doelwitten voor verder onderzoek aanzienlijk beperkt.