Spectroscopic Methods
Absorbance Spectroscopy. Voor sommige enzymtests is het mogelijk het reactant of product direct te meten op basis van zijn extinctie-eigenschappen Fersht (1999). Bij de reactie die door glucose-6-fosfaatdehydrogenase (EC 1.1.1.49) wordt gekatalyseerd, absorbeert een product (NADH) licht bij 340 nm, waardoor het mogelijk is de reactie te volgen door de toename van de extinctie bij deze golflengte te volgen.
Glucose 6-fosfaat + NAD+ → 6-fosfogluconaat + NADH + H+
In andere gevallen wordt een reactant of product indirect gemeten. Bij acetylcholinesterase (EC 3.1.1.7), bijvoorbeeld, wordt acetylthiocholine gebruikt als substraat dat thiocholine vrijmaakt bij blootstelling aan het enzym. De thiocholine reageert met Ellman’s reagens tot een gekleurd product, waardoor de reactie kan worden gevolgd door de toename van de extinctie te volgen.
Acetylthiocholine + H2O → acetaat + H+ + thiocholine
Thiocholine + Ellman’s reagens → gekleurd derivaat
Gekoppelde assays worden soms gebruikt om de enzymactiviteit te volgen. In dit geval wordt de enzymatische reactie van belang gekoppeld aan een tweede reactie die is gekoppeld voor een gemakkelijke meting. Een voorbeeld hiervan is de bepaling van hexokinase (EC 2.7.1.1). In dit geval wordt een overmaat glucose-6-fosfaatdehydrogenase en NAD+ in het analysemengsel opgenomen en wordt de extinctie bij 340 nm gemeten.
Reactie I: Glucose + ATP → glucose-6-fosfaat + ADP
Reactie II: Glucose 6-fosfaat + NAD+ → 6-fosfogluconaat + NADH + H+
In dit voorbeeld zou reactie I snelheidsbeperkend moeten zijn en zou de concentratie van glucose 6-fosfaat na een vertragingsperiode een stabiele toestand moeten bereiken. Cleland Cleland (1979) heeft een procedure geformuleerd om ervoor te zorgen dat de gekoppelde bepaling een nauwkeurige meting van de reactiesnelheid van het enzym oplevert. Indien mogelijk verdient het de voorkeur de reactie continu te volgen. Met de hierboven beschreven assays kan de spectrofotometer worden geprogrammeerd om een continue uitlezing als functie van de tijd te geven. Bij scheidingstechnieken, waarbij gebruik kan worden gemaakt van radioactiviteit, elektroforese of chromatografie, worden discontinue of eindpuntanalyses gebruikt. Nadat een lineaire tijdsperiode voor een bepaling is vastgesteld, wordt een parameter gemeten op één tijdstip binnen de lineaire tijdsperiode (bij voorkeur op een tijdstip in het midden van de lineaire fase). De snelheid wordt dan bepaald uit het verschil in signaal op dat tijdstip en bij het begin van de reactie. Met eindpunttests moet voorzichtig worden omgesprongen en het tijdsverloop moet worden gecontroleerd om de lineariteit te bevestigen. Veranderingen in de incubatieomstandigheden, zoals temperatuur, pH of substraatconcentratie, kunnen de lineariteit van een assay veranderen. Voor routinematige enzymtests bevat het reactievat alle componenten behalve één, en wordt de reactie op gang gebracht door de ontbrekende component (het enzym of een van de substraten) toe te voegen. De andere componenten moeten wat pH, temperatuur en ionensterkte betreft in evenwicht zijn. De reactie wordt meestal op gang gebracht door toevoeging van een klein volume van een geconcentreerde stamoplossing van het ontbrekende bestanddeel. Een klein volume zorgt ervoor dat deze toevoeging de reeds bereikte evenwichtsomstandigheden niet verstoort. Wanneer het niet mogelijk is een kleine component toe te voegen, moeten de gescheiden componenten dezelfde temperatuur, ionensterkte en p H hebben. Hoewel de twee componenten volledig moeten worden gemengd, moet krachtig schudden worden vermeden omdat dit het enzymproteïne kan denatureren. Het mengen kan worden bereikt door het omkeren van een buisje met een stop, of een cuvet met een parafilmafdichting. Verdunde eiwitten zijn vaak minder stabiel dan meer geconcentreerde, en analyses worden vaak uitgevoerd in aanwezigheid van een inert eiwit, zoals runderserumalbumine (0,25 mg/ml), om het gezuiverde enzym te stabiliseren. Experimenten moeten worden uitgevoerd om te garanderen dat het eiwit inert is. Omdat albumine bijvoorbeeld kan binden aan hydrofobe substraten, is het niet altijd geschikt voor dit doel. Voor discontinue assays kan de timer worden ingesteld en kunnen de monsters na het mengen op specifieke tijdsintervallen worden opgezogen. Bij de meeste spectrofotometers wordt de detectie handmatig gestart met behulp van een instrumentenpaneel of een computertoetsenbord. Om een component aan een cuvet toe te voegen is ongeveer 20 seconden nodig om het cuvet in een spectrofotometer te plaatsen en de detectie te starten door op een computertoets te drukken. Deze tijd is gewoonlijk niet van groot belang, omdat voor de meeste reacties de assay 10 tot 30 minuten wordt uitgevoerd. Tot de controlemetingen behoren een blanco die geen enzym bevat en een blanco die geen substraat bevat. Dergelijke controles zorgen ervoor dat er geen onvoorziene reacties optreden. De controlesnelheid (niet-enzymblanco) wordt afgetrokken van de door het experiment gegenereerde datum om de werkelijke snelheid van de enzymreactie te verkrijgen. Voor veel analyses is het nodig de reactie op een bepaald tijdstip te onderdrukken of te stoppen om verdere productie van product te voorkomen. Zo kunnen gedurende een vooraf bepaalde tijd met tussenpozen van 5 minuten monsters worden genomen en kan het product met behulp van HPLC worden gemeten
Elke chromatografische analyse kan 30 minuten in beslag nemen. Methoden om de reactie te beëindigen omvatten gewoonlijk denaturering van het enzym door toevoeging van zuur, of onderdompeling in een kokend waterbad. De activiteit van sommige metalloenzymen kan worden gedoofd met EDTA of een andere metaalionchelator. De meeste enzymtests zijn gebaseerd op spectroscopische technieken, waarvan absorptie en fluorescentie de twee meest gebruikte zijn Fersht (1999). Voor het volgen van de reactiesnelheid moet de golflengte worden gebruikt die het grootste verschil in absorptie oplevert tussen het substraat en het product. Absorptiemetingen worden uitgevoerd met een standaard spectrofotometer met de monsters in gespecialiseerde cellen, of cuvetten. In de handel zijn plastic wegwerpcuvetten verkrijgbaar die monsters van 1 of 3 ml kunnen bevatten. Het gebruik ervan is beperkt tot het zichtbare golflengtegebied (350-800 nm). Voor metingen bij golflengten van minder dan 350 nm moeten kwarts cuvetten worden gebruikt (glas en kunststof absorberen licht in het UV-bereik). De weglengte voor cuvetten wordt door de fabrikant opgegeven. Populaire weglengtes zijn 1,00 cm, 0,40 cm en 0,20 cm. Een toenemend aantal bepalingen wordt uitgevoerd met microtiterplaten met 96 putjes en een plastic of kwartsbodem. De concentratie van een stof die licht absorbeert bij specifieke golflengten kan worden bepaald met de wet van Beer:
A = εcl,
waarbij A de extinctie is van het monster bij een bepaalde golflengte, c de concentratie van het monster, l de weglengte, en ε de extinctiecoëfficiënt, of molaire extinctiecoëfficiënt. ε heeft de eenheden M-1 cm-1 of mM-1 cm-1. Indien de waarde van ε voor een bepaalde stof bekend is, is het mogelijk de concentratie van die stof in een oplossing te berekenen door de absorptie van die stof in die oplossing te meten. Met behulp van de wet van Beer kan de snelheid worden berekend waarmee de concentratie tijdens een reactie verandert. Een potentiële fout bij het gebruik van absorptiemetingen vloeit voort uit een afwijking van de wet van Beer, omdat deze slechts voor een eindig bereik van absorptiewaarden geldt. Omdat de wet wellicht niet kan worden toegepast bij absorptiewaarden van meer dan 1, moeten de bepalingen zodanig worden opgezet dat de experimentele waarden lager zijn dan 1. Het kan mogelijk zijn sommige van deze problemen te omzeilen door cuvetten met kortere weglengte te gebruiken. Een monster met een extinctie van 1,00 in een cel met een weglengte van 1,00 cm zal een extinctie hebben van 0,20 in een cel met een weglengte van 0,20 cm. In het algemeen is het werken met een extinctie van ongeveer 0,5 een compromis tussen het minimaliseren van de optische ruis die inherent is aan een spectrofotometer en het hebben van een redelijk signaal om te meten. De troebelheid in een oplossing kan licht verstrooien en schijnbare extinctie veroorzaken. Filtratie of centrifugering kunnen worden gebruikt om deze deeltjes te verwijderen. Hoewel door veranderingen in de weglengte sommige afwijkingen van de lineariteit kunnen worden omzeild (d.w.z. wanneer de extinctie zo hoog is dat de spectrofotometer geen nauwkeurige meting kan verrichten), zijn de afwijkingen vaak te wijten aan intermoleculaire interacties tussen de absorberende stoffen. Dimerisatie (of vorming van eximeren van hogere orde) treedt op bij hogere concentraties van de absorberende stoffen. In deze gevallen zal de wet van Beer worden gehoorzaamd als de concentratie van het product wordt verlaagd. Dit kan worden bereikt door de reactie te vertragen (door de enzymconcentratie te verlagen) of door metingen gedurende een kortere periode uit te voeren (voordat afwijkingen van de wet van Beer worden geconstateerd).