Virale stammen
HCoV-229E (VR-740) en HCoV-OC43 (VR-1558) werden gekweekt in menselijke diploïde long MRC-5 fibroblasten (CCL-171) en WI-38 (CCL-75), respectievelijk (alle van ATCC, Manassas, VA). Beide menselijke cellijnen werden gekweekt in MEM aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mM L-alanyl-L-glutamine, 100 U/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine (Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA). Het virusinfectiemedium bestond uit MEM of RPMI-1640 plus 2% door warmte geïnactiveerde FBS voor HCoV-229E en HCoV-OC43, respectievelijk. De virale stammen werden vermeerderd door inoculatie van kolven met 24 uur oude gastheercellen, die voor 80-90% confluent waren. Na één uur incubatie werd de celmonolayer gewassen en geïncubeerd in vers infectiemedium gedurende drie of vier dagen bij 35 °C voor HCoV-229E en bij 33 °C voor HCoV-OC43. Het supernatant dat de werkvirusvoorraad bevatte, werd vervolgens verzameld door centrifugering (300 g gedurende 15 minuten). De virustiter werd bepaald door 50% weefselkweek infectieuze dosis TCID50 door het beoordelen van cytopathische effecten (CPE), die werden gescoord op een helderveld microscoop (10×) als vacuolisatie van cytoplasma, celafronding en sloughing.
Benchtop aerosol bestralingskamer
Een one-pass, dynamische aerosol/virus bestralingskamer werd gebruikt voor het genereren, blootstellen, en het verzamelen van aerosol monsters zoals eerder beschreven23. Virale aërosolen werden gegenereerd door het toevoegen van een virus oplossing in een high-output uitgebreide aërosol respiratoire therapie vernevelaar (Westmed, Tucson, AZ) en het werken met behulp van een luchtpomp met een input debiet van 11 L / min. Virus stroomde in de kamer en werd gemengd met droge en bevochtigde lucht om de vochtigheid tussen ongeveer 50-70% te houden. De relatieve vochtigheid, de temperatuur en de grootteverdeling van de aërosoldeeltjes werden tijdens de werking gecontroleerd. Aerosol werd blootgesteld aan ver-UVC-licht en uiteindelijk verzameld met behulp van een BioSampler (SKC Inc., Eighty Four, PA).
De ver-UVC-lamp werd op ongeveer 22 cm afstand van de UV-blootstellingskamer geplaatst en gericht op het 26 cm × 25,6 cm × 254 urn UV-transmitterende kunststof venster (TOPAS 8007 × 10, TOPAS Advanced Polymers Inc., Florence, KY). In overeenstemming met onze eerdere experimenten met deze kamer23 bedroeg de stroomsnelheid door het systeem 12,5 L/min. Het volume van het UV-blootstellingsgebied bedroeg 4,2 L, zodat elke aërosol gedurende ongeveer 20 seconden werd belicht terwijl hij het venster passeerde. De hele bestralingskamer bevond zich in een bioveiligheidsniveau 2 kast en alle luchtinlaten en -uitgangen waren voorzien van HEPA-filters (GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA) om te voorkomen dat ongewenste besmetting het systeem zou binnenkomen of verlaten.
Bestralingskamerprestaties
De aangepaste bestralingskamer simuleerde de overdracht van aërosolvirussen die via hoesten en ademhaling door de mens werden geproduceerd. De kamer werkte bij een gemiddelde relatieve vochtigheid van 66% en een gemiddelde temperatuur van 24 °C over alle runs. De gemiddelde deeltjesgrootteverdeling was 83% tussen 0,3 micrometer en 0,5 micrometer, 12% tussen 0,5 micrometer en 0,7 micrometer, en 5% >0,7 micrometer (tabel 3). In de aërosol verspreide virussen werden efficiënt door het systeem overgebracht, zoals blijkt uit de controle (nulblootstelling) die een duidelijke virusintegratie vertoonde (Fig. 2 en 3, linkerbovenpanelen).
Far-UVC-lamp en dosimetrie
De in deze studie gebruikte far-UVC-bron was een 12 W 222-nm KrCl-excimerlampmodule gemaakt door USHIO America (Item #9101711, Cypress, CA). De lamp is uitgerust met een eigen optisch filtervenster om de lampemissies buiten de 222 nm KrCl-emissiepiek te verminderen. De lamp werd op 22 cm afstand van het venster van de belichtingskamer geplaatst en gericht op het midden van het venster. Optische vermogensmetingen werden uitgevoerd met een 818-UV/DB low-power UV enhanced silicium fotodetector met een 843-R optische vermogensmeter (Newport, Irvine, CA). Dosimetrie werd uitgevoerd vóór het begin van een experiment om de fluentie binnen de kamer op de positie van de aërosol te meten.
De afstand tussen de lamp en de bestralingskamer liet een enkele lamp toe om gelijkmatig het gehele gebied van het belichtingsvenster te bestralen. Metingen met de siliciumfotodetector wezen op een bestralingssterkte van ongeveer 90 μW/cm2 over het hele bestralingsgebied. De kamer is uitgerust met een reflecterend aluminium oppervlak tegenover het belichtingsvenster. Net als in ons eerdere werk met deze kamer23 was het reflectievermogen van dit oppervlak ongeveer 15%. We hebben daarom de intensiteit over het gehele belichtingsgebied conservatief geschat op 100 μW/cm2. Met de lamp op 22 cm van het venster en gezien de 20 seconden die een aërosoldeeltje nodig heeft om het belichtingsvenster te doorkruisen, hebben wij de totale blootstellingsdosis voor een deeltje berekend op 2 mJ/cm2. We gebruikten extra vellen UV-transmitterende plastic vensters om de intensiteit gelijkmatig te verminderen over het hele belichtingsgebied om verschillende belichtingscondities te creëren. Terwijl we in ons vorig werk met deze vellen een transmissie van dichter bij 65%23 hebben gemeten, hebben we voor deze tests de 222-nm transmissie van elk vel gemeten op ongeveer 50%. Deze daling van de transmissie is waarschijnlijk te wijten aan de fotodegradatie van het plastic in de loop van de tijd4. De toevoeging van een of twee vellen van de kunststof die het belichtingsvenster bedekken, vermindert de belichtingsdosis tot respectievelijk 1 en 0,5 mJ/cm2.
Experimenteel protocol
Zoals eerder beschreven23, de virusoplossing in de vernevelaar bestond uit 1 ml Modified Eagle’s Medium (MEM, Life Technologies, Grand Island, NY) met 107-108 TCID50 van coronavirus, 20 ml gedeïoniseerd water, en 0,05 ml evenwichtige zoutoplossing van Hank’s met calcium en magnesium (HBSS ++). De bestralingskamer werd gebruikt met geïnjecteerde virusdeeltjes die door de kamer en het bypass-kanaal stroomden gedurende 5 minuten voorafgaand aan elke bemonstering, om de gewenste RH-waarde vast te stellen. De monstername werd gestart door de luchtstroom van het bypass-kanaal naar de BioSampler te veranderen met behulp van de driewegkleppen. De BioSampler werd aanvankelijk gevuld met 20 ml HBSS++ om de aërosolen op te vangen. Gedurende elke bemonsteringstijd, die 30 minuten duurde, werd de binnenkant van de bestralingskamer blootgesteld aan 222-nm far-UVC licht dat door het plastic venster binnenkwam. Variatie van de aan aërosoldeeltjes afgegeven ver-UVC-dosis werd bereikt door extra UV-transparante kunststoffolies aan te brengen zoals hierboven beschreven, waardoor de drie testdoses van 0,5, 1,0 en 2,0 mJ/cm2 werden afgegeven. De nul-dosis controlestudies werden uitgevoerd met uitgeschakelde excimer-lamp. Nadat de bemonsteringsperiode was voltooid, werd de oplossing van de BioSampler gebruikt voor de virusinfectiviteitstests.
Virusinfectiviteitstests
TCID50
Wij gebruikten de 50%-weefselkweekinfectieuze-dosisbepaling om de virusinfectiviteit te bepalen28. Kort gezegd werden 105 gastheercellen uitgezet in elk putje van 96-wells platen de dag vóór het experiment. De cellen werden tweemaal gewassen in HBSS++ en seriële 1:10 verdunningen in infectiemedium van het blootgestelde virus uit de BioSampler werden gedurende twee uur over de cellen gelegd. De cellen werden vervolgens tweemaal gewassen in HBSS++, bedekt met vers infectiemedium, en gedurende drie of vier dagen geïncubeerd bij 34 °C. Cytopathische effecten (CPE) werden onder een helderveldmicroscoop (10×) gescoord als vacuolisatie van het cytoplasma, celafronding en afschilfering. De TCID50 werd berekend met de methode van Reed en Muench28,38. Om de CPE-scores te bevestigen, werden de monsters gedurende vijf minuten gefixeerd in 100% methanol en gekleurd met 0,1% kristalviolet. De resultaten worden gerapporteerd als de schatting van plaquevormende eenheden (PFU)/ml met gebruikmaking van de omrekening PFU/ml = 0,7 TCID50 door toepassing van de Poisson-verdeling29.
Immunofluorescentie
Om te beoordelen of toenemende doses 222-nm licht het aantal geïnfecteerde cellen verminderden, voerden we een standaard fluorescent immunokleuring protocol uit om een viraal antigeen in de menselijke cellen van de gastheer te detecteren23. In het kort werden 2 × 105 gastheercellen (MRC-5 cellen voor HCoV-229E en WI-38 voor HCoV-OC43) uitgezet in elk putje van 48-wells platen de dag voor het experiment. Na 30 minuten door de bestralingskamer te zijn gelopen, werd 150 μl virussuspensie, verzameld uit de BioSampler, op de monolaag van gastcellen aangebracht. De cellen werden geïncubeerd met het virus gedurende een uur, vervolgens driemaal gewassen met HBSS ++, en vervolgens ’s nachts geïncubeerd in vers infectiemedium. Geïnfecteerde cellen werden vervolgens gefixeerd in 100% ijskoude methanol bij 4 °C gedurende 5 minuten en gelabeld met anti-humaan coronavirus spike glycoproteïne (40021-MM07, Sino Biologicals US Inc., Chesterbrook, PA) 1:200 in HBSS++ met 1% boviene serum albumine (BSA; Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA) bij kamertemperatuur gedurende een uur onder zachtjes schudden. De cellen werden driemaal gewassen in HBSS++ en gelabeld met geiten-antimuis Alexa Fluor-488 (Life Technologies, Grand Island, NY) 1:800 in HBSS++ met 1% BSA, bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten in het donker onder zachtjes schudden. Na drie wasbeurten in HBSS++ werden de cellen gekleurd met Vectashield met DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindool) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) en geobserveerd met het 10× objectief van een Olympus IX70 fluorescentiemicroscoop uitgerust met een Photometrics PVCAM digitale camera met hoge resolutie en Image-Pro Plus 6.0 software (Media Cybernetics, Bethesda, MD). Voor elke 222-nm dosis en elk virusgenus werden de representatieve resultaten tweemaal herhaald. Voor elk monster werden maximaal tien beeldvelden van samengevoegde DAPI en Alexa Fluor-488 beelden verkregen.
Gegevensanalyse
De overlevende fractie (S) van het virus werd berekend door de fractie PFU/ml bij elke UV-dosis (PFUUV) te delen door de fractie bij nul dosis (PFUcontrols): S = PFUUV/PFUcontrols. Overlevingswaarden werden berekend voor elke herhalingsexperiment en natuurlijke log (ln) getransformeerd om de foutverdeling dichter bij normaal te brengen39. Robuuste lineaire regressie met behulp van iterated re-weighted least squares (IWLS)40,41 werd uitgevoerd in R 3.6.2 software met behulp van deze genormaliseerde ln waarden als de afhankelijke variabele en UV dosis (D, mJ/cm2) als de onafhankelijke variabele. De regressie werd uitgevoerd met de interceptieterm op nul, wat de definitie is van 100% relatieve overleving bij nul UV-dosis, afzonderlijk voor elke bestudeerde virusstam. De gegevens bij nuldosis, die per definitie ln = 0 vertegenwoordigen, werden niet in de regressie opgenomen. De onzekerheden (95% betrouwbaarheidsintervallen, CI) voor de k-parameter voor elke virusstam werden geschat door bootstrapping voor elke regressiemethode, omdat bootstrapping kan resulteren in meer realistische onzekerheidsschattingen, vergeleken met de standaard analytische benadering op basis van asymptotische normaliteit, in kleine gegevensreeksen zoals die welke hier werden gebruikt (n = 3 HCoV-229E en n = 4 voor HCoV-OC43). De geschiktheid werd beoordeeld aan de hand van de determinatiecoëfficiënt (R2). De analyse van residuen op autocorrelatie en heteroskedasticiteit werd uitgevoerd met respectievelijk de Durbin-Watson test42 en de Breusch-Pagan test (geïmplementeerd door het lmtest R-pakket)43. De parameterschattingen (k) voor elke virusstam werden met elkaar vergeleken op basis van de 95% CI’s en rechtstreeks door middel van een t-toets, met gebruikmaking van de steekproefgroottes, k-waarden en hun standaardfouten. De inactiveringsdoorsnede van het virus, D90, de UV-dosis die 90% van het blootgestelde virus inactiveert, werd berekend als D90 = – ln/k. Andere D-waarden werden op dezelfde wijze berekend.