8.3 Chemische proeven
Visualisering van PHGs-bestanddelen op TLC-platen is mogelijk door gebruik te maken van algemene reagentia voor fenolen; ijzerchloride, vanilline en zoutzuur (geven een reeks roze kleuren met resorcinol- of phloroglucinolderivaten), of door gebruik te maken van meer specifieke proeven met 2,4-dinitrofenylhydrazine (detecteert aldehyden). Folin-Ciocalteu’s reagens is ook nuttig voor het opsporen van fenolen met catechol- of hyrochinonkernen (blauwe vlekken verschijnen onmiddellijk na het besproeien van de TLC-plaat) of voor andere fenolen, die blauwe tot grijze vlekken vertonen wanneer de plaat met ammoniakdamp wordt begast. Gibbs-reagens (2% 2,6-dichloorchinon-chloroimide in chloroform) gevolgd door begassing van de plaat met 2M NH4OH geeft verschillende kleuren (het is bijvoorbeeld mogelijk vanillezuur-roze kleur-en isovanillezuur-blauw van elkaar te onderscheiden). Cinnamzuurderivaten geven een karakteristieke lichtblauwe fluorescentie bij onderzoek onder UV (366 nm). Cis- en trans-isomeren van kaneelzuren worden gepresenteerd op TLC-platen wanneer het extract in waterige oplosmiddelen in twee richtingen wordt gechromatografeerd (2D-TLC). Spectrofotometrische methoden voor de schatting van het fenolgehalte worden vaak gebruikt, b.v. de methode met Arnow’s reagens of het eerder genoemde Folin-Ciocalteu’s reagens .
Enkele kwalitatieve tests wijzen op coumarines in plantenextracten, b.v., Lactonenringtest (coumarines gehydrolyseerd door verdund alkali vormen een gele oplossing van O-coumarinezuurzouten, die kan worden omgekeerd na aanzuren of verzadiging door CO2); of Azokoppelingstest (rode kleur ontstaat door de reactie met diazoteringssulfanilzuur in een alkalische oplossing). Cumarines kunnen gemakkelijk worden gedetecteerd onder UV-licht (365 nm), aangezien zij een karakteristieke kleurfluorescentie geven (behalve eenvoudige niet-gesubstitueerde cumarine, die geen fluorescentie heeft). Zij worden gedetecteerd door hun blauwe, violette, bruine, groene of gele kleur. Een 10% oplossing van KOH in methanol of een 20% oplossing van antimoonchloride in chloroform kan de kleur intensiveren. Hydroxycumarines vertonen geen bathochrome spectrale verschuivingen in alkalische oplossing. Bij HPLC-analyse met diode-arraydetectie maken verschillende UV-spectra van coumarines een snelle identificatie van verbindingen mogelijk.
Chromonen reageren in alkalioplossingen tot O-hydroxy-β-diketonen zonder regeneratie van de γ-pyronring en ook gekleurde verbindingen met geconcentreerd zuur en geconcentreerd alkali. Chromonen zijn ook zichtbaar in UV-licht (blauwe, gele, groenachtig gele, bruine fluorescentie bij 365 nm).
De aanwezigheid van de actieve fenylring (chromofoor) in flavonoïden maakt ze gemakkelijk detecteerbaar onder UV-licht. Hun UV-spectra zijn bijzonder informatief en verschaffen structurele informatie die het type fenol en het oxidatiepatroon kan onderscheiden. Verschillende chemische reacties door het besproeien van TLC-chromatogrammen zijn mogelijk; b.v. visualisatie in aanwezigheid van ammoniakdamp (chalconen en auronen worden respectievelijk oranje en rood) of bespuiting met Naturstoff Reagenz A (1% oplossing van de ester van 2-aminoethanol en difenylborinezuur) en overbespuiting met 5% methanoloplossing van polyethyleenglycol 4000 (PEG 4000), waardoor de gevoeligheid van deze reactie wordt verhoogd. Na de derivatisering konden de verbindingen worden waargenomen in UV-licht (fluorescentie van lichtgeel naar groen). Andere proeven omvatten verstuiving met ijzer(III)chloride, gediazoteerd sulfanilzuur (beide zijn reacties voor fenolen), en de specifieke reactie; cyanidine met magnesiumpoeder in aanwezigheid van zoutzuur (wijst op de aanwezigheid van flavanonen en dihydroflavanolen) . Voor de kwantitatieve colorimetrische bepaling van flavonoïden wordt de reactie met aluminiumchloride (AlCl3) gebruikt (absorptie gemeten bij 425 nm). Flavonoïden opgelost in alkalioplossingen geven een intens gele kleur, die afneemt na toevoeging van zuur. UV-spectra van flavonoïdverbindingen vertonen twee hoofdbanden (maxima van absorptie): band I bij hogere golflengte (toegeschreven aan het cinnamoylgedeelte van de flavonoïdstructuur) en band II bij lagere golflengte (toe te schrijven aan het benzoylgedeelte). De band I ligt normaal bij 304-350 nm voor flavonen (H op C-3 in de C-ring), bij 352-385 nm voor flavonolen (OH-groep op C-3), en bij 328-357 nm voor 3 gesubstitueerde flavonolen (O-substitutie op C-3). Band II ligt voor de meeste structuren bij ca. 250-280 nm. Een extra fenolgroep (-OH) in ring A veroorzaakt de badochromische verschuiving (verschuiving naar langere golflengten) in band II, en een extra -OH groep in ring B genereert een soortgelijk effect in band I.
De meeste antrachinonen of hun glycosiden vormen gele of oranjerode kristallen en kunnen fluorescentie vertonen die afhankelijk is van de pH . De belangrijkste kleurreactie is de test van Bornträger, die tot stand komt door de chinon op te lossen in een alkalisch waterig medium. De kleurreactie varieert van oranjerood tot paarsviolet (afhankelijk van de structuur en de substituenten van het chinon). Anthrachinonen geven bij deze reactie een rode kleur. Voor 1,8-dihydrochinonen wordt ook reactie met magnesiumacetaat gebruikt. Antrachinonen kunnen op TLC-platen worden gedetecteerd na verstuiving met 10% methanolische KOH-oplossing. De oorspronkelijke gele of geelbruine kleuren veranderen in rood, violet, groen of paars. Rabarber in poedervorm kan onder UV-licht worden onderzocht om de aanwezigheid van raponthicine (stilbenoïde glycoside, die giftig is) op te sporen. In originele rabarber (Rheum palmatum) verschijnt een roodbruine fluorescentie, maar er worden geen glanzende blauwviolette vlekken gezien (zoals bij rabarber-Rheum rhaponticum).
Zoals eerder vermeld zijn saponinen oppervlakteactieve verbindingen (die de oppervlaktespanning wijzigen) en hebben ze emulgerende eigenschappen. Voor een snelle kwalitatieve controle of een plant SPG’s bevat, wordt gewoonlijk een schuimtest uitgevoerd door het plantenmateriaal met water te schudden. Saponinen hebben membraanpermeabiliserende eigenschappen. Lage concentraties saponinen zijn in staat de membranen van erytrocyten te vernietigen (waardoor het cholesterol dat zich in de membranen van de rode bloedcellen bevindt kan neerslaan), waardoor in vitro hemolyse van bloed wordt veroorzaakt. Dit vermogen heeft geleid tot het wijdverbreide gebruik van hemolyse (hemolytische index-IH) als methode om de biologische activiteit te bepalen. IH wordt gedefinieerd als de hoeveelheid 2% isotone suspensie van runderbloed (in ml), die hemolyse ondergaat bij behandeling met 1 g getest plantmateriaal (of getest extract). Als referentie werd Gypsophila paniculata saponinemengsel (IH=30.000) of Saponin Album (Merck) (IH=15.000) gebruikt. Zoals beschreven door Hostettmann en Marston , varieert de hemolytische activiteit van saponosiden aanzienlijk met de structuur van het glycosidegedeelte. Monodesmoside saponinen (behalve acylglycosiden en glycyrrhizine) zijn sterk hemolytisch. Geen enkele kleurreactie is bijzonder specifiek voor SPG’s. Wel is er de Lieberman-reactie (met azijnzuuranhydride in aanwezigheid van zwavelzuur), waarbij de kleuren verschillen afhankelijk van het type aglycon (triterpeen-roze tot rood -of steroïde-blauw-groen) .
Chemische reacties om CRG’s in plantenmateriaal te identificeren kunnen te wijten zijn aan de aglyconen of aan de suikers. De test van Liebermann en Salkoviski wijst op een steroïdaal deel en is dus niet specifiek voor CRG’s. De test van Keller Kiliani en Xanthidrole wijzen beide op deoxy-suikers (digitoxose of cymarose). De Kedde- of Baljet-reactie is specifieker, omdat zij gekoppeld is aan de aanwezigheid van een α,β-onverzadigde lactonring. Een fluorescerende reactie van CRG’s is ook mogelijk; zo elimineert de hydroxylgroep van digoxine op C-14 en C-16 water met H2SO4 met vorming van twee extra dubbele bindingen. Dit resulteert in een geconjugeerd systeem (met een dubbele binding in de lactonring) dat digoxine fluorescerend maakt in UV-licht. Jensen reactie (na verstuiving met trichloorazijnzuur in ethanol) wordt gebruikt om CRG’s op TLC chromatogrammen te visualiseren .
Directe meting van totaal HCN door zure hydrolyse van cyanogene glycosiden die in levensmiddelen aanwezig zijn, alsmede afbraak van de tussenliggende cyanohydrinen tot HCN heeft het voordeel dat het op alle soorten monsters kan worden toegepast, hoewel waarschijnlijk niet alle potentiële HCN van cyanogene glycosiden in vivo beschikbaar zal zijn. Visualisatie van de aanwezigheid van deze verbindingen in planten is mogelijk op filtreerpapier dat geïmpregneerd is met reagentia, zoals picrinezuur/natriumcarbonaat of benzidine/cuprineacetaat. Deze reagentia zijn in staat kleurreacties te geven met HCN dat vrijkomt uit vermalen plantenweefsel. Een geïmpregneerd papier wordt in een buisje over het geplette plantenmateriaal gelegd en men laat het gedurende 2 uur incuberen bij 40°C. Een kleurverandering van geel naar roodbruin wijst op het enzymatisch vrijkomen van HCN. Picraatpapier is niet geheel specifiek voor cyanogen (vluchtige isothiocyanaten uit Brassica-soorten reageren ook op deze reactie). Daarom wordt ook een andere test gebruikt met een mengsel (1:1) van vers bereide oplossingen van 1% 4,4-tetramethyldiamine difenylamine in chloroform (m/V) en 1% koper-ethylacetoacetaat in chloroform (m/V). De kleurreactie verandert van zwak blauwgroen in heldergroen. Een andere mogelijke methode vereist destillatie van het plantenweefsel in zuur water en titratie van het vrijgekomen HCN met zilvernitraat. Chromatografische methoden zoals HPLC/MS of GC/MS van trimethylsilylderivaten zijn doeltreffend voor de analyse van afzonderlijke cyanogene glycosiden of cyanohydrinen, en leveren zowel een chemische karakterisering als een kwantificering van de verbindingen op .
Omwille van de verscheidenheid aan producten die in planten uit glucosinolaten worden gevormd (afhankelijk van de aglyconstructuur) kan de schatting van isothiocyanaten met de spectrofotometrische methode (waarbij de kleurproducten 1,3-benzodithiol-2-tiones worden gevormd door isothiocyanaatcondensatie met 1,2-benzeendithiol) onvoldoende zijn om het glucosinolaatgehalte in planten te bepalen .