In het kader van dit blogartikel (er volgt nog meer over de verschillende soorten fixatieven…), zullen we ons vooral richten op het gebruik van paraformaldehyde/formaldehyde, meestal aangeduid als PFA, het meest gebruikte fixatief in flowcytometrie. PFA verwijst specifiek naar de vaste polymeervorm van formaldehyde (en lost op in monomere formaldehyde in waterige oplossing), dus wat gewoonlijk canoniek “PFA-fixatie” wordt genoemd, is eigenlijk het gebruik van de monomere formaldehydeoplossing. In dit geval zijn PFA en formaldehyde synoniem en onderling verwisselbaar.
Een oplossing variërend van 1-4% PFA wordt gewoonlijk gebruikt voor het fixeren van monsters voor flowcytometrie. Bij het ontsmetten van infectieuze monsters kunnen concentraties van slechts 0,37% monsters van HIV-geïnfecteerde patiënten doeltreffend ontsmetten1. Incubatie gedurende maximaal 45-60 minuten met 1% PFA, en 15-20 minuten met 4% PFA (bijv. BioLegend’s buffer) is voldoende om de cellen volledig te fixeren, en de cellen kunnen ofwel worden gebruikt voor downstream processing (permeabilisatie voor intracellulaire targets) of worden opgeslagen voor toekomstige analyse in dit stadium.
Tijdens een routinekleuringsprocedure voor flowcytometrie waarbij oppervlaktemarkers worden gekleurd, zijn er verschillende stappen waarin u kunt besluiten uw monsters te fixeren – fixeer na de kleuring van oppervlaktemarkers, of fixeer ervoor.
In sommige gevallen is de beslissing voor wanneer u kunt fixeren… vast. Bijvoorbeeld, als je het analyseren van fosfo-doelen, binding van bepaalde oppervlakte-antigenen door antilichamen kunnen intracellulaire signaalwegen veranderen kort na contact, waardoor een artefact in uw fosforylering resultaten. In dat geval moet u de cellen fixeren vóór de toevoeging van de oppervlakteantilichamen (dat is de reden waarom ons aanbevolen protocol om te gebruiken voor onze True-Phos ™ Perm Buffer om intracellulaire fosforylatie targets te analyseren is zo ontworpen dat de fixatiestap voorafgaat aan andere procedures). Elk heeft zijn eigen voor- en nadelen, maar hier zijn een paar dingen om in elk geval op te letten.