Genome Organization and Expression
Genomic RNAs van luteoviriden bevatten vijf tot zeven geconserveerde ORFs (Fig. 3). ORFs 1, 2, 3, en 5 worden gedeeld door alle leden van de Luteoviridae. Bij Luteovirussen ontbreekt ORF0. Bij enamovirussen ontbreekt ORF4. Luteo- en polerovirus-genomen bevatten een kleine ORF (ORF3a) stroomopwaarts van ORF3. Luteovirus-genomen bevatten een kleine ORF (ORF6) stroomafwaarts van ORF5. Het PLRV-genoom bevat ORF’s 6 en 7, binnen ORF5 en ORF8 binnen ORF1. In de enamo- en polerovirussen overlapt ORF0 ORF1 met meer dan 600 nt, die ook ORF2 met meer dan 600 nt overlapt. In de luteovirussen overlapt ORF1 ORF2 met minder dan 50 nt. In de meeste luteo- en polerovirus-genoomsequenties ligt ORF4 volledig binnen ORF3. Een enkel, in-frame amber (UAG) termination codon scheidt ORF5 van ORF3.
Fig. 3. Kaarten van de virus genomen van genera in de familie Luteoviridae. Individuele ORF’s worden getoond met open vakjes. De ORFs zijn verticaal verspringend om de verschillende leesramen bezet door elke ORF te tonen. De gele vakken geven eiwitproducten aan met de voorspelde grootte rechts van elk. De polyproteïnen die door ORF1 van enamo- en polerovirussen worden gecodeerd, bevatten het protease en het genoom-gekoppelde eiwit (VPg). De voorspelde aminozuursequenties van de door ORF2 gecodeerde eiwitten zijn vergelijkbaar met RNA-afhankelijke RNA-polymerasen. ORF3, dat codeert voor het voornaamste manteleiwit, wordt van ORF5 gescheiden door een amberkleurig afsluitcodon. ORF4, indien aanwezig, bevindt zich meestal in ORF3 en codeert voor een eiwit dat nodig is voor de verplaatsing van het virus van cel naar cel. Luteo- en polerovirussen bevatten een ORF3a waarvoor de translatie wordt gestart bij een niet-AUG-codon. De 3′ niet-coderende regio’s van luteovirussen bevatten translatie-enhancer-elementen (BTE). In PLRV is ORF7 in-frame met de C-terminus van ORF5, en de translatie van ORF8 wordt gemedieerd door een interne initiatie ribosoom entry site (IRES). Luteo- en polerovirussen produceren drie sub-genomische RNA’s (sgRNA’s), maar enamovirussen produceren één sgRNA.
Luteoviriden hebben relatief korte 5′- en intergenische niet-coderende sequenties. De eerste ORF wordt voorafgegaan door 21 nt in CABYV RNA en 142 nt in Sojabondwergvirus (SbDV) RNA. ORF’s 2 en 3 worden gescheiden door 112-200 nt niet-coderend RNA. Er is aanzienlijke variatie in de lengte van de sequentie stroomafwaarts van ORF5, die varieert van 167 nt voor CYDV-RPV tot 650 nt voor SbDV.
Luteoviriden maken gebruik van een breed scala van strategieën om hun compacte genomen tot expressie te brengen. De ORF’s 0, 1, 2 en 8 komen rechtstreeks tot expressie vanuit genomische RNA’s. Stroomafwaartse ORF’s komen tot expressie via sub-genomische RNA’s (sgRNA’s) die vanaf interne initiatieplaatsen door virusgecodeerde RNA-afhankelijke RNA-polymerasen (RdRps) worden getranscribeerd vanaf negatieve-strengs RNA’s en 3′ co-terminaal zijn met het genomische RNA. Aangezien het initiatiecodon voor ORF0 van polero- en enamovirussen stroomopwaarts van dat van ORF1 ligt, wordt de translatie van ORF1 gestart door “leaky scanning”, waarbij ribosomen de AUG van ORF0 omzeilen en het genomische RNA blijven scannen totdat zij de AUG van ORF1 bereiken. De eiwitproducten van ORF2 worden tot expressie gebracht als een translerende fusie met het product van ORF1. Met een lage maar significante frequentie tijdens de expressie van ORF1, gaat de translatie verder in ORF2 door middel van een -1 frameshift die een groot eiwit produceert dat sequenties bevat die worden gecodeerd door zowel ORF 1 als ORF 2 in één enkel polypeptide. De frameshift wordt bewerkstelligd door een “glibberige hepta-nucleotide sequentie” (in de vorm X XXY YYZ) en een RNA secundaire structuur stroomafwaarts, een pseudoknot genaamd, die ervoor zorgt dat ribosomen pauzeren en vervolgens één nt terugschuiven alvorens de vertaling in het nieuwe leesraam voort te zetten. ORF8, die alleen in PLRV is geïdentificeerd, bevindt zich volledig binnen ORF1 in een ander leesframe en codeert voor een 5 kDa replicatie-geassocieerd eiwit. Om ORF8 tot expressie te brengen, vouwen sequenties binnen de ORF zich op tot een structuur die een interne ribosoom entry site (IRES) wordt genoemd, die ribosomen rekruteert om de translatie ongeveer 1600 nt stroomafwaarts van de 5′ terminus van PLRV RNA te starten.
ORFs 3a, 3, 4, en 5 komen tot expressie via een leaky scanning mechanisme vanaf de 5′ terminus van sgRNA1, die zich ongeveer 200 nt stroomopwaarts van ORF3 aan het einde van ORF2 bevindt en zich uitstrekt tot de 3′ terminus van het genoom. De translatie van ORF3a wordt geïnitieerd op een niet-AUG codon. ORF4 van de meeste luteo- en polerovirussen is vervat in ORF3. In alle luteoviriden komt ORF5 alleen tot expressie als translatiefusie met de producten van ORF3 door readthrough van het UAG-stopcodon aan het einde van ORF3, waardoor een eiwit wordt geproduceerd met het product van ORF3 aan de N-terminus en het product van ORF5 aan de C-terminus. Readthrough wordt gereguleerd door lokale en lange-afstands-RNA-RNA-interacties en vereist in het geval van luteovirussen en sommige polerovirussen de aanwezigheid van CCXXXX-repeats (waarbij X een willekeurige base is) stroomafwaarts van het ORF3-stopcodon. Luteo- en polerovirussen produceren tweede kleinere sgRNA’s die de ORF’s 6 en 7 tot expressie kunnen brengen. Derde sgRNA’s, die niet lijken te coderen voor eiwitten, worden geproduceerd in zeer hoge niveaus in luteovirussen, maar slechts in lage niveaus in PLRV.
Terwijl enamo- en polerovirus RNA’s 5′ VPgs bevatten die interageren met translatie-initiatiefactoren, bevatten luteovirus RNA’s alleen een 5′ fosfaat. Ongewijzigde 5′ termini worden slecht herkend voor translatie-initiatie. Om dit probleem te omzeilen, bevat het BYDV-PAV-genoom een korte sequentie (BYDV translation element; BTE) die zich bevindt in de 3′ niet-coderende regio stroomafwaarts van ORF5 en die interageert met sequenties nabij de 5′-termini van genomisch RNA en sgRNA1 om cap-onafhankelijke translatie-initiatie te bevorderen.
Post-transcriptionele gene silencing (PTGS) is een aangeboren en zeer adaptieve antivirale verdediging die bij alle eukaryoten wordt aangetroffen en wordt geactiveerd door dubbelstrengs RNA’s (dsRNA’s), die tijdens virusreplicatie worden geproduceerd. Onderzoek naar de functies van de door luteoviriden gecodeerde eiwitten heeft aangetoond dat de door ORF0 gecodeerde 28-34 kDa-eiwitten sterke onderdrukkers zijn van lokale en systemische PTGS voor polero- en enamovirussen. In de genomen van luteovirussen ontbreekt ORF0, maar het product van ORF4 in luteovirussen functioneert om systemische PTGS te onderdrukken.
De door ORF1 gecodeerde eiwitten van enamo- en polerovirussen bevatten het VPg en een chymotrypsine-achtig serine protease dat verantwoordelijk is voor de proteolytische verwerking van ORF1-gecodeerde polyproteïnen. Het protease klieft het ORF1-eiwit intern om het VPg vrij te maken, dat covalent aan genomisch RNA is gehecht. Het door ORF8 van PLRV tot expressie gebrachte eiwit is noodzakelijk voor de replicatie van het virus. Luteoviride ORF2’s hebben een coderingscapaciteit van 59-67 kDa voor eiwitten die sterk lijken op bekende RdRps en vertegenwoordigen dus waarschijnlijk het katalytische gedeelte van het virale replicase.
Voor luteo- en polerovirussen produceert ORF3a sterk geconserveerde 4,8-5,3 kDa-eiwitten die essentieel zijn voor langeafstandsverplaatsing. ORF3 codeert voor het belangrijkste CP van de luteoviriden, dat in grootte varieert van 21 tot 23 kDa. ORF5 heeft een coderingscapaciteit van 29-56 kDa. ORF5 komt echter alleen tot expressie als een translationele fusie met het product van ORF3 wanneer, ongeveer 10% van de tijd, de translatie niet stopt aan het eind van ORF3 en doorgaat tot het eind van ORF5. Het ORF5-gedeelte van dit doorleeseiwit is betrokken bij de overdracht door bladluizen en de stabiliteit van het virus. Experimenten met PLRV en BYDV-PAV hebben aangetoond dat de N-terminale regio van het ORF5-doorleeseiwit bepalend is voor het vermogen van virusdeeltjes om zich te binden aan eiwitten die worden geproduceerd door endosymbiotische bacteriën van bladluisvectoren. Interacties van virusdeeltjes met deze eiwitten lijken essentieel te zijn voor de persistentie van de virussen in bladluizen. Wijzigingen in de nucleotidevolgorde binnen ORF5 van PEMV-1 doen de overdraagbaarheid bij bladluizen teniet. De N-terminale delen van ORF5-eiwitten zijn sterk geconserveerd onder luteoviriden, terwijl de C-termini veel variabeler zijn.
De genomen van luteo- en polerovirussen bezitten een ORF4 dat is vervat in ORF3 en codeert voor eiwitten van 17-21 kDa. Virussen die mutaties bevatten in ORF4 zijn in staat zich te vermenigvuldigen in geïsoleerde plantenprotoplasten, maar zijn gebrekkig of vertraagd in systemische verplaatsing in hele planten. Het product van ORF4 lijkt dus noodzakelijk te zijn voor de verplaatsing van het virus binnen geïnfecteerde planten. Deze hypothese wordt ondersteund door de waarneming dat enamovirussen ORF4 missen. Terwijl luteo- en polerovirussen beperkt blijven tot het floëem en aanverwante weefsels, kan het enamovirus PEMV-1 zich systemisch door andere plantenweefsels verplaatsen in aanwezigheid van PEMV-2, dat onder natuurlijke omstandigheden steevast samen met PEMV-1 voorkomt.
Sommige luteo- en polerovirusgenen bevatten kleine ORF’s binnen en/of stroomafwaarts van ORF5. In luteovirussen zijn geen eiwitproducten van deze ORF’s gedetecteerd in geïnfecteerde cellen. BYDV-PAV-genomen die geen ORF6 tot expressie brengen, zijn nog steeds in staat zich in protoplasten te vermenigvuldigen. De voorspelde grootte van de eiwitten die door ORF’s 6 en 7 van PLRV tot expressie worden gebracht, is respectievelijk 7,1 en 14 kDa. Op basis van mutatiestudies is voorgesteld dat deze genoomgebieden de transcriptie laat in de infectie kunnen reguleren.