Alai

Establishing the temperature range

Commonsly used laboratory conditions for Macrostomum lignano cultures are as follows: temperature of 20 °C, humidity 60%, and light/dark cycle of 14 h/10 h. Deze omstandigheden werden vooral gekozen omdat ze optimaal zijn voor de groei van het kiezelwier Nitzschia curvilineata, dat de voornaamste voedselbron voor de wormen is. Om de temperatuursomstandigheden te bepalen die in het experiment kunnen worden gebruikt, hebben wij eerst het temperatuurbereik vastgesteld waarin de wormen overleven. Hoewel het invriezen van de wormen dodelijk bleek te zijn, konden ze overleven wanneer ze gedurende ten minste twee weken bij 4 °C werden gehouden. Omdat het kiezelwier in deze omstandigheden echter niet groeit, besloten we 4 °C van verdere experimenten uit te sluiten. Andere temperaturen beneden 20 °C werden eveneens van het experiment uitgesloten, aangezien het hoofddoel van de studie erin bestond omstandigheden te vinden die de groei en ontwikkeling versnellen. Aan de andere kant van het temperatuurspectrum lossen de wormen op wanneer ze gedurende twee uur bij 42 °C worden gehouden, en sterven ze na een week cultuur bij 37 °C. Daarom hebben wij besloten 20 °C, 25 °C, 30 °C en 35 °C als onze experimentele omstandigheden te gebruiken om de langetermijneffecten van de temperatuur op M. lignano te bestuderen (fig. 1).

Hitteschokrespons

Om te onderzoeken welke temperaturen de stressrespons in de wormen induceren, controleerden we de activiteit van de hitteschokpromotor 20 (Mlig-hsp20). Eerst voerden we een kwantitatieve RT-PCR uit om het expressieniveau van Mlig-hsp20 te meten bij 20 °C, 25 °C, 30 °C, 33 °C, 34 °C en 35 °C. Er was geen significant verschil in het expressieniveau van Hsp20 tussen 20 °C en 25 °C (Fig. 2a). Er werd echter een kleine (2-voudige), maar significante (P = 0,027, t-test), toename van de expressie waargenomen bij 30 °C in vergelijking met 20 °C (Fig. 2a). Meer dan een tienvoudige stijging van het expressieniveau werd waargenomen bij 33 °C, die steeg tot meer dan 100-voudig bij de hoogste geteste temperatuur van 35 °C (Fig. 2a). In de tweede test creëerden we een transgene lijn die mScarlet-I eiwit tot expressie brengt onder controle van de Mlig-hsp20 promoter (Fig. 2b) en maten we het fluorescentieniveau 24 uur na een incubatie van 2 uur bij verschillende temperaturen variërend van 20 °C tot 37 °C (Fig. 2c, d). Een meer dan twee- en tienvoudige toename van de fluorescentie werd waargenomen bij respectievelijk 34 °C en 37 °C (Fig. 2c).

Snelheid van embryonale ontwikkeling

Volgens Morris et al. duurt het ongeveer 120 uur (vijf dagen) voor Macrostomum eieren volledig te ontwikkelen wanneer eieren worden bewaard bij 20 ° C. Om te onderzoeken hoe de temperatuur de snelheid van de embryonale ontwikkeling en het uitkomen beïnvloedt, hebben we vers gelegde embryo’s geplukt en hun ontwikkeling tot het uitkomen gevolgd bij verschillende temperaturen. Om mogelijke verschillen ten gevolge van genetische achtergrond te onderzoeken, gebruikten we twee M. lignano lijnen die momenteel gebruikt worden in de meeste studies over M. lignano, de DV1 en NL10 lijnen. Deze lijnen zijn onafhankelijk van elkaar afgeleid van wild-type populaties uit dezelfde geografische locatie en verschillen door een gehele chromosoomduplicatie, maar gedragen zich verder zeer gelijkaardig onder laboratoriumomstandigheden. We bestudeerden eerst het effect van lage temperatuur. Bij 4 °C wordt de ontwikkeling van de eitjes stopgezet en kunnen ze minstens een maand worden bewaard, waarna ze hun ontwikkeling hervatten zodra ze weer bij hogere temperaturen worden bewaard. Vervolgens hebben we onderzocht hoe snel de eieren zich ontwikkelen bij temperaturen tussen 20 en 35 °C. Zoals blijkt uit Fig. 3, begonnen de eieren bij standaardomstandigheden (20 °C) na zes dagen uit te komen. Verhoging van de temperatuur leidde tot een verhoudingsgewijs snellere embryonale ontwikkeling en een vroeger uitkomen van de eieren, dat bij 35 °C twee keer zo snel verliep als bij 20 °C en slechts drie dagen duurde. Opmerkelijk is dat ongeveer 10% van de eieren niet is uitgekomen na acht dagen incubatie bij 20 °C, vergeleken met minder dan 5% bij hogere temperaturen, wat suggereert dat zelfs de hoogste geteste temperatuur van 35 °C geen nadelig effect heeft op de overleving van de embryo’s.

Reproductie

De reproductiesnelheid is een zeer belangrijke factor voor een modelorganisme, aangezien dieren met een kortere generatietijd het mogelijk maken sneller gegevens te genereren in genetische experimenten. Bovendien, als dieren grote aantallen nakomelingen produceren, zullen de gegenereerde gegevens, in de meeste gevallen, een hogere statistische kracht hebben.

Om de invloed van de temperatuur op de voortplantingssnelheid van M. lignano te beoordelen, hebben we het aantal nakomelingen vergeleken dat in de loop van vijf weken werd gegenereerd door wormen die bij verschillende temperatuursomstandigheden werden gehouden. Het experiment werd gestart met uitgekomen wormen om de post-embryonale ontwikkeling in de studie te betrekken, en zowel de DV1 als de NL10 lijn werden gebruikt. Bij 20 °C hadden de uitgekomen wormen van beide lijnen drie weken nodig om te groeien en de eerste nakomelingen te produceren, terwijl bij 25 °C de uitgekomen wormen bij de NL10-lijn na twee weken werden waargenomen, maar niet bij de DV1-lijn. Bij 30 °C en 35 °C produceerden beide lijnen al na twee weken nakomelingen (Fig. 4). Vanaf drie weken nam het aantal uitgekomen jongen per week toe van minder dan 200 bij 20 °C tot meer dan 300 bij temperaturen boven 20 °C; het aantal uitgekomen jongen was het hoogst bij wormen die bij 30 °C werden gehouden. Dit gold voor beide genetische achtergronden, en we hebben geen significante verschillen waargenomen tussen DV1- en NL10-lijnen (fig. 4).

Hoewel temperaturen van 30°C en hoger resulteerden in meer broedsels, activeert dit ook een hitteschokreactie (Fig. 2). Om het langetermijneffect van de verhoogde temperatuur en de mogelijke stress op de wormen te onderzoeken, hielden we de wormen bij de geselecteerde temperaturen en controleerden we op morfologische afwijkingen na drie en zes maanden kweek. Wormen die bij 25 °C werden gehouden, vertoonden op beide controlepunten geen morfologische veranderingen ten opzichte van de wormen die bij 20 °C werden gehouden (Fig. 5). Bij zowel 30 °C als 35 °C werden echter verschillende afwijkingen in de algemene morfologie waargenomen. Na drie maanden waren een toegenomen aantal cysten, beschadigd weefsel en vergrote testikels algemeen aanwezig in zowel de DV1- als de NL10-lijn (Fig. 5). Geen van de wormen die bij 35 °C werden gehouden, overleefde tot het controlepunt van zes maanden, en alle wormen die bij 30 °C overleefden, vertoonden morfologische afwijkingen (Fig. 5). Langdurige blootstelling aan temperaturen boven 30 °C is dus schadelijk voor M. lignano.

Regeneratietijd

Omdat de belangrijkste aantrekkingskracht van M. lignano als modelorganisme zijn regeneratieve vermogen is, hebben we vervolgens bestudeerd hoe de temperatuur de regeneratie beïnvloedt. Het is algemeen aanvaard dat een hogere temperatuur leidt tot een toename van de totale metabolische activiteit. Om de invloed van de temperatuur op de tijd die een worm nodig heeft om zijn lichaam volledig te regenereren na amputatie boven het testesgebied te evalueren, volgden we de regeneratie van testes en het verschijnen van sperma in de vesicularis seminalis met behulp van een eerder vastgestelde transgene lijn NL22, die GFP tot expressie brengt onder de controle van de testes- en spermaspecifieke ELAV promoter . Het gebruik van een dergelijke transgene merker biedt een grotere nauwkeurigheid, consistentie en efficiëntie bij het bepalen van de mate van regeneratie. We hebben inderdaad geen significante variatie waargenomen bij de beoordeling van het tijdstip van verschijnen van het GFP-signaal na amputatie bij alle geteste temperaturen (tabel 1).

Zoals verwacht nam de snelheid van regeneratie toe met de temperatuur (tabel 1). Als we de regeneratietijd bij 20 °C als de standaardsnelheid nemen, dan zijn voor de regeneratie van testikels de berekende temperatuurcoëfficiënten Q10 = 4 bij 25 °C en Q10 = 3 bij 30 °C en 35 °C. Hieruit blijkt dat het grootste effect wordt verkregen bij verhoging van de temperatuur tot 25 °C, en dat de snelste regeneratie plaatsvindt bij 30 °C, zonder verder voordeel van een hogere temperatuur op de regeneratietijd. Bij regeneratie-experimenten met M. lignano moet dus rekening worden gehouden met temperaturen van 25 °C en 30 °C, aangezien dit de duur van een experiment twee- tot driemaal verkort (tabel 1).

RNA-interferentie

Knockdown van genexpressie door RNA-interferentie (RNAi) is momenteel de voornaamste benadering voor loss-of-function studies bij M. lignano . Bij deze benadering worden dieren doordrenkt met dubbelstrengs RNA tegen het doelgen, en vaak zijn langdurige behandelingen van verscheidene weken nodig om een fenotype waar te nemen. Wij hebben getest hoe de temperatuur de snelheid beïnvloedt waarmee het fenotype zich ontwikkelt na behandeling met RNAi. Daartoe hebben wij Mlig-ddx39, een gen dat bekend staat om zijn functie bij de celproliferatie in M. lignano en een robuust dodelijk knockdown fenotype, uitgeschakeld. Net als bij de voortplantingstest gebruikten we voor dit experiment de DV1- en de NL10-lijn (tabel 2). Bij 20°C duurde het ongeveer 20 dagen voor alle dieren stierven na Mlig-ddx39 knockdown. Wanneer de wormen bij hogere temperaturen werden gehouden, trad de dood sneller in: na 11 en 8 dagen voor wormen die respectievelijk bij 25 °C en 30 °C werden gehouden. Er was geen zichtbaar verschil tussen de twee stammen die voor het experiment werden gebruikt (Tabel 2). Vervolgens hebben wij onderzocht of de waargenomen toename van de snelheid waarmee het ddx39 RNAi fenotype zich bij hogere temperaturen manifesteert, toe te schrijven is aan een hogere efficiëntie van genafbraak door RNAi, of aan andere factoren. Hiertoe hebben we met qRT-PCR de abundantie van Mlig-ddx39 transcripten gemeten op verschillende tijdstippen na de start van het RNAi experiment bij verschillende temperaturen (Fig. 6). Dieren behandeld met dsRNA tegen gfp werden gebruikt als referentie controles. Bij alle geteste temperaturen werden geen significante variaties waargenomen in de expressieniveaus van Mlig-ddx39 tussen de controlemonsters in de loop van het experiment (Fig. 6). Tegelijkertijd werd voor de met Mlig-ddx39 dsRNA behandelde dieren reeds na één dag behandeling bij 20 °C of 25 °C een daling van ~ 80% in het niveau van ddx39-transcripten waargenomen, en zelfs een grotere daling van ~ 90% bij 30 °C. In de daaropvolgende dagen stabiliseerde het niveau van de knockdown zich echter op ongeveer 95% bij alle temperaturen. Zo concluderen wij dat de kinetiek van RNAi zelf niet significant wordt beïnvloed door de temperatuur. In plaats daarvan kan de waargenomen verkorting van de tijd voor de manifestatie van het Mlig-ddx39 RNAi-fenotype bij hogere temperaturen worden verklaard door de verhoogde snelheid van celverloop.

Om te testen of de versnelling van de ontwikkeling van RNAi-fenotypes bij verhoogde temperaturen kan worden gegeneraliseerd naar andere genen, onderzochten we Mlig-sperm1-gen, knockdown van die leidt tot abnormale spermamorfologie en vergrote testes . Dit is een traag RNAi-fenotype dat er 2-3 weken over doet om zich bij 20 °C te ontwikkelen. Om de omvang van het fenotype bij verschillende temperaturen te kwantificeren, telden we op dag 4 van de RNAi-behandeling de fractie van de dieren waarbij de testes zodanig vergroot waren dat ze elkaar raakten. (Fig. 7). Vergelijkbaar met de resultaten met Mlig-ddx39 RNAi, hogere temperaturen resulteerde in een snellere ontwikkeling van het fenotype, en terwijl er geen voldoende testes te vergroten werden waargenomen na vier dagen van dsRNA behandeling bij 20 ° C, had 25 en 85% van de dieren ontwikkelde vergrote testes bij 25 ° C en 30 ° C respectievelijk (tabel 2). Net als bij regeneratie kunnen RNAi-fenotypes bij M. lignano dus worden versneld met de temperatuur en kunnen hogere temperaturen worden gebruikt om de duur van de experimenten te verkorten.