Alai

Abstract

In deze studie werd nagegaan of de verkorte folliculaire fase bij ovulatoire oudere vrouwen het gevolg is van een gevorderde (d.w.z. vroegere) of een versnelde (d.w.z. snellere) folliculogenese. Normale ovulatoire vrouwen, in de leeftijd van 40-45 jaar (n = 15) en 20-25 jaar (n = 13), ondergingen dagelijks venapunctie en transvaginale ultrasonografie gedurende de folliculaire fase van een spontane menstruatiecyclus (controle cyclus) en na hypofyse down-regulatie met een GnRH agonist (studie cyclus). Zoals verwacht vertoonden de oudere proefpersonen in de controle cycli een verhoogd d 3 FSH en een verkorte folliculaire fase in vergelijking met de jongere proefpersonen. Na het opheffen van de onderdrukking van de hypothalamus-hypofyse-ovariumas trad de piek in de vroege folliculaire fase van FSH eerder op (6,8 vs. 9,8 d; P < 0,01) en was groter (12,1 vs. 6,5 mIU/ml; P < 0,01) bij de oudere proefpersonen. De tijd vanaf het vrijkomen van de onderdrukking tot de daaropvolgende LH-opstoot was ook korter (17,5 vs. 20,8 d; P < 0,01) in de oudere groep. Echter, de tijd van FSH piek tot LH piek was vergelijkbaar in de oudere en jongere groepen (10,7 vs. 11,0 d; P = 0,74). Vergeleken met jongere vrouwen hadden oudere proefpersonen normale folliculaire fase niveaus van oestradiol en inhibine A en lagere niveaus van inhibine B in zowel de controle- als de studiecycli. Wij concluderen dat de verkorte folliculaire fase die bij oudere ovulatoire vrouwen wordt waargenomen, te wijten is aan vroegere selectie van dominante follikels, onafhankelijk van hormonale invloeden van de voorafgaande luteale fase.

REPRODUCTIEVE VEROUDERING IS een continuüm dat vele jaren begint voordat absolute disfunctie optreedt. Een belangrijke manifestatie van het verouderingsproces is een progressieve daling van de vruchtbaarheid bij de vrouw, die begint in het laatste deel van het derde decennium en exponentieel toeneemt na de leeftijd van 35 jaar (1, 2). Deze verminderde vruchtbaarheid gaat vooraf aan openlijke tekenen van hypothalamus-hypofyse-ovarium (HPO) as disfunctie zoals menstruele onregelmatigheid, waarbij de meerderheid van de vrouwen regelmatige, ovulatoire menstruatiecycli blijven hebben tot ver in de 40 (3, 4). In de jaren voorafgaand aan de menopauze blijft de regelmatige ovulatie gehandhaafd, terwijl de menstruatiecycli geleidelijk korter worden (4-6). Dit fenomeen is te wijten aan een verkorting van de folliculaire fase zonder een daarmee gepaard gaande verandering in de lengte van de luteale fase (5, 7). Een ander kenmerk van de voortplantingsleeftijd is de stijging van FSH die niet gepaard gaat met een stijging van LH (monotrope FSH-stijging) (6-9). Het begin van de monotrope stijging van FSH en een vroegere ovulatie lijken in de tijd geassocieerd te zijn met een versnelling van de snelheid van de follikelatresie die uiteindelijk leidt tot uitputting van de folliculaire reserve (10). De monotrope stijging van FSH en de verkorte folliculaire fase dienen dus als klinische indicatoren voor de voortschrijdende reproductieve leeftijd en snel afnemende vruchtbaarheid (11).

Tijdens de normale menstruele cyclus stijgt FSH in de late luteale of vroege folliculaire fase en bereikt het gewoonlijk een piek in de vroege folliculaire fase (12, 13). Met selectie en daaropvolgende ontwikkeling van de dominante follikel, daalt FSH naar een relatief laag niveau tot de gonadotropine piek halverwege de cyclus. De dominante follikel in eumenorroïsche vrouwen van gevorderde reproductieve leeftijd is relatief gezond, groeit tot een normale grootte, produceert normale of verhoogde niveaus van oestradiol (E2), en scheidt normale niveaus van progesteron af na luteïnisatie (7, 8, 14). Deze normale kenmerken van de oudere dominante follikel suggereren dat de vroegere ovulatie bij oudere vrouwen niet te wijten is aan een intrinsiek defect in de follikel, maar aan het extrafolliculaire hormonale milieu. De endocrinologische veranderingen die het meest consistent worden beschreven in studies van reproductieve veroudering zijn een verhoogd absoluut niveau van FSH (6-9), een vroegere stijging van de vroege folliculaire fase FSH (7), en een daling van de vroege folliculaire fase niveaus van inhibine B (15-18).

De huidige studie werd uitgevoerd om te bepalen of de verkorte folliculaire fase in ovulatoire oudere vrouwen secundair is aan gevorderde (d.w.z. vroegere) of versnelde (d.w.z. snellere) folliculogenese. We veronderstelden dat de vroegere dominante follikelontwikkeling bij oudere vrouwen secundair is aan de vroegere stijging van folliculair FSH in vergelijking met die bij jongere controles, en dat de absolute snelheid van folliculaire groei vergelijkbaar zou zijn in beide leeftijden. Met andere woorden, we hebben de hypothese dat de follikelontwikkeling bij vrouwen van gevorderde reproductieve leeftijd eerder gevorderd dan versneld is. Hormonale en intra-ovarium effecten van de voorafgaande menstruatiecyclus kunnen studies van de rekrutering en rijping van dominante follikels verstoren. Om een dergelijke invloed van de voorgaande cyclus uit te sluiten, onderdrukten we de HPO-as van elke proefpersoon door standaard GnRH-agonisten te onderdrukken. Nadat de onderdrukking van de HPO-as was gedocumenteerd, vergeleken we het herstel van de hormonale, folliculaire en menstruele functie in oudere, ovulatoire proefpersonen in vergelijking met een jongere controlegroep.

Onderwerpen en Methoden

Experimentele proefpersonen

Als onderdeel van een serie studies naar normale reproductieve veroudering, wierven we gezonde ovulatoire vrouwen aan, in de leeftijd van 40-45 jaar (n = 16) en 20-25 jaar (n = 15), voor deelname. Alle proefpersonen moesten regelmatige menstruatiecycli hebben (cyclus intervallen van 21-35 d), een normale body mass index (18-24 kg/m2), en geen medische of reproductieve aandoeningen hebben (inclusief een geschiedenis van onvruchtbaarheid) en midluteale serumspiegels van PRL onder 20 ng/ml, progesteron groter dan 10 nmol/liter, en testosteron minder dan 3 nmol/liter in een pre-studie cyclus aantonen. Tijdens de duur van het onderzoek waren alle proefpersonen seksueel abstinent of gebruikten zij niet-hormonale anticonceptiemethoden (bijv. barrièremethode of intra-uterien apparaat). Schriftelijke toestemming werd verkregen van elke deelnemer, en geldelijke vergoeding werd verstrekt voor alle vrijwilligers. Het protocol werd beoordeeld en goedgekeurd door de Human subjects Review Board van de Universiteit van Washington.

Materialen en methoden

Studieprotocol.

Als controlecyclus ondergingen alle proefpersonen dagelijks een venapunctie en seriële transvaginale ultrasonografie om de dominante follikelontwikkeling in de folliculaire fase van een spontane, natuurlijke cyclus te beoordelen. Voor de studiecyclus werd nafareline acetaat (400 μg, intranasaal, dagelijks) gestart 7 d nadat urinaire LH kits de gonadotropine piek halverwege de cyclus in de voorgaande cyclus hadden gedetecteerd. Wanneer onderdrukking van de HPO-as werd bevestigd door een serum E2-niveau onder de detectiegrens van de test (73 pmol / liter), werd nafareline voortgezet voor een extra 5 d om een uniforme down-regulatie van de HPO-as te verzekeren. Vanaf de dag na het stopzetten van nafareline, werd dagelijks een venapunctie voor E2 analyse uitgevoerd. Zodra de serum E2 concentratie 367 pmol/liter bereikte of overschreed, werden dagelijks transvaginale echo-onderzoeken uitgevoerd totdat dominante follikelcollaps werd waargenomen. De studiecyclus werd gestart binnen 6 maanden na de controlecyclus.

Assays.

Alle serummonsters van een bepaalde proefpersoon werden in duplo geanalyseerd in dezelfde assay om de effecten van intra-assay variabiliteit te minimaliseren. Serum FSH niveaus werden bepaald met behulp van een vaste fase twee-site monoklonale ELISA (DELFIA, Wallac Inc., Gaithersburg, MD). De inter- en intraassay variatiecoëfficiënten (CV) bedroegen respectievelijk 4,6% en 2,3%. De RIA voor serum E2 werd uitgevoerd met reagentia geleverd door ICN Biomedicals, Inc. (Costa Mesa, CA). De inter- en intraassay CV bedroegen respectievelijk 18% en 9%. Een sandwich-ELISA in vaste fase (Serotec, Oxford, UK) werd gebruikt om inhibine B te meten, gebaseerd op het gebruik van platen die gecoat zijn met een monoklonaal antilichaam dat specifiek is voor de inhibine β-subeenheid. Inhibine B wordt gedetecteerd met een tweede monoklonaal antilichaam dat specifiek is voor de α-subeenheid van inhibine, en de testprocedure omvat volgens de fabrikant voorbehandeling van het monster met reagentia die in de kits zijn opgenomen (natriumdodecylsulfaat en peroxide). De analytische gevoeligheid (b.v. minimum voor de βA-subeenheid van inhibine) is bepaald met een voor detectie gebruikt, met mierikswortelperoxidase gelabeld monoklonaal antilichaam dat specifiek is voor de α-subeenheid. De door de fabrikant geleverde teststandaard werd gekalibreerd met behulp van de eerste internationale standaard voor inhibine van de WHO (recombinant humaan inhibine; lot 91/624), en de resultaten worden gerapporteerd als internationale eenheden per milliliter van dit referentiemateriaal. De test werd in duplo gecontroleerd met behulp van aliquots van monsters die respectievelijk 2,00 of 9,56 IE/ml bevatten. Gebaseerd op deze kwaliteitscontroles bedroeg de inter assay CV respectievelijk 8,7% en 3,3% over de 57 assays die zijn gebruikt om de hierin gerapporteerde gegevens te verkrijgen.

Statistische analyse.

Voor uitkomsten met een enkele gegevenswaarde van elk individu (bijv. folliculaire faselengte) werden de gemiddelden van de twee cohorten vergeleken met behulp van een tweezijdige t-toets. Een α = 0,05 werd gekozen om een significant verschil aan te geven. Voor uitkomsten met meerdere gegevenswaarden van elk individu (bv. seriële E2-niveaus) werden de steekproefgemiddelden vergeleken door ANOVA met herhaalde maatregelen. Op basis van de resultaten van eerdere studies verwachtten we dat de variabiliteit in de tijd tot het begin van de LH-opstoot ongeveer 20% zou bedragen. Daarom schatten we, uitgaande van een variatiecoëfficiënt van 20%, dat we een kans van 80% zouden hebben om een verschil zo klein als 20% te vinden met 15 proefpersonen in elke groep.

Resultaten

Twee jongere en een oudere vrouw werden uit de studie verwijderd omdat het niet lukte om HPO-asonderdrukking te bereiken. De basiskenmerken van de controlecyclus voor de overblijvende proefpersonen zijn weergegeven in tabel 1. Zoals verwacht vertoonden de oudere proefpersonen een verkorte folliculaire fase evenals een verhoogd FSH en verlaagd inhibine B op cyclus d 3 van de controlecyclus in vergelijking met de jongere proefpersonen. In zowel de controle- als de studiecycli ontwikkelden alle proefpersonen in elke leeftijdsgroep een dominante follikel met echografisch bewijs van daaropvolgende follikelcollaps na de LH-piek halverwege de cyclus, wat een schijnbaar normale dominante follikelontwikkeling en ovulatie aantoont in zowel natuurlijke cycli als na het staken van de GnRH-onderdrukking. De duur van Synarel (Searle, Skokie, IL) die nodig was om onderdrukking te bereiken zoals gedefinieerd door het onderzoeksprotocol was iets langer voor jongere controles (bereik, 9-20 d; gemiddeld, 12,8 ± 0,8 d; totale dosis, 5,1 ± 0,3 mg) vergeleken met oudere proefpersonen (bereik, 9-13 d; gemiddeld, 11.0 ± 0,3 d; totale dosis, 4,4 ± 0,1 mg; P = 0,05 voor zowel duur als dosis).

Folliculaire faselengte

Voor de doeleinden van deze studie hebben we de folliculaire fase in twee intervallen verdeeld: vroege folliculaire fase (gedefinieerd als de tijd vanaf het begin van de menstruatie of het staken van de onderdrukking door een GnRH-agonist tot de FSH-piek in de vroege folliculaire fase) en late folliculaire fase (gedefinieerd als de tijd vanaf de vroege FSH-piek tot de gonadotropinestoot halverwege de cyclus). Folliculaire fase intervallen (totaal, vroeg, en laat) worden getoond in Fig. 1. Na ontkoppeling van HPO-asonderdrukking bereikte het oudere cohort eerder een vroege folliculaire FSH-piek (6,8 ± 0,7 vs. 9,8 ± 0,6 d, respectievelijk; P < 0,01), wat resulteerde in een kortere vroege folliculaire fase. Bovendien had het oudere cohort een kortere tijd vanaf het vrijkomen van de onderdrukking tot de daaropvolgende LH-opstoot (17,5 ± 0,9 vs. 20,8 ± 0,7 d, respectievelijk; P < 0,01), voor een al met al kortere totale folliculaire fase. Echter, de tijd vanaf de FSH piek in de vroege folliculaire fase tot de LH piek halverwege de cyclus (late folliculaire fase) was vergelijkbaar in de oudere en jongere groepen (10,7 ± 0,7 vs. 11,0 ± 0,8 d, respectievelijk; P = 0,74). Bij zowel oudere als jongere proefpersonen was de tijd tussen het staken van nafareline en de daaropvolgende LH-opstoot langer dan de folliculaire fase van de controlecyclus (ouder, 17,5 vs. 12,9 d; jonger, 20,8 vs. 14,8 d).

FSH

FSH-profielen rond de FSH-piek in de vroege folliculaire fase voor zowel de controle- als de studiecyclus worden in fig. 2 afgebeeld. Het piekniveau van FSH in de vroege folliculaire fase was hoger bij oudere proefpersonen in zowel de controle- (12,0 ± 1,4 vs. 6,8 ± 0,3 mIU/ml, respectievelijk; P < 0,01) als de studiecyclus (12,1 ± 1,9 vs. 6,5 ± 0,4 mIU/ml, respectievelijk; P < 0,01) cycli. Er werden geen verschillen in de grootte van de FSH-piek waargenomen tussen de controle- en studiecycli binnen elke leeftijdsgroep (Fig. 2). Daarom lijkt de grootte van de FSH-piek onafhankelijk te zijn van de invloed van de voorafgaande luteale fase in beide leeftijdsgroepen.

Ovariële hormoonsecretie

De belangrijkste secretieproducten van de dominante follikel zijn E2 en inhibine A. Figuur 3 toont de folliculaire fase concentraties van E2, genormaliseerd naar de LH-piek, voor beide leeftijdsgroepen in controle- en studiecycli. Het patroon en de hoeveelheid E2 die door de dominante follikel wordt uitgescheiden zijn vergelijkbaar tussen studie- en controlecycli in beide leeftijdsgroepen. Hoewel de helling van de E2-stijging en de grootte van de dominante follikel niet verschilden tussen de groepen, was de E2-piek halverwege de cyclus groter bij oudere vrouwen in zowel de controle- (1175 ± 73 vs. 973 ± 76 pmol/liter, respectievelijk; P = 0,05) als de studiecycli (1351 ± 91 vs. 1061 ± 94 pmol/liter, respectievelijk; P < 0,05). In beide cycli vertoonden oudere proefpersonen ook normale inhibine A concentraties in de folliculaire fase, waarbij geen verschillen werden waargenomen tussen controle- en studiecycli (Fig. 4). Oudere proefpersonen hadden hogere middencyclusconcentraties van inhibine A in zowel de controle- (3,44 ± 0,45 vs. 2,50 ± 0,25 IE/ml, respectievelijk; P = 0,08) als de studiecyclus (3,32 ± 0,37 vs. 2,54 ± 0,26 IE/ml, respectievelijk; P = 0,10) cycli, maar deze toename bereikte geen statistische significantie. De dominante follikel van een oudere ovulatoire vrouw scheidt dus normale of verhoogde concentraties van zowel E2 als inhibine A af. De secretie van deze follikelhormonen wordt niet beïnvloed door eerdere onderdrukking van de HPO-as.

In tegenstelling tot inhibine A was inhibine B, dat voornamelijk wordt geproduceerd door de kleine (<10 mm) antrale follikels (19, 20), significant lager in de vroege folliculaire fase bij de oudere vrouwen in zowel de controle- als de studiecycli (Fig. 5). Merk op dat niet alle proefpersonen voldoende hoeveelheden serum hadden om inhibine A- en/of B-bepalingen uit te voeren; daarom wordt het aantal geanalyseerde proefpersonen in de legenda van elk figuur vermeld.

Discussie

Eerdere studies hebben een progressieve verkorting van de folliculaire fase aangetoond naarmate de leeftijd vordert, ondanks een ogenschijnlijk normale dominante follikelgrootte, secretiecapaciteit en ovulatie (5, 7, 14). Mogelijke verklaringen zijn ofwel vroegere (gevorderde) selectie ofwel snellere (versnelde) ontwikkeling van de dominante follikel. In beide gevallen kunnen factoren die de lengte van de folliculaire fase bepalen, veranderingen in de fysiologie van de luteale fase (die paracriene en/of endocriene signaalmechanismen beïnvloeden) of veranderingen in HPO-interacties in de vroege folliculaire fase omvatten. De huidige studie was ontworpen om de effecten van de voorafgaande luteale fase te elimineren door de HPO-as in een vergelijkbare mate te onderdrukken. Op deze manier kon de folliculaire fase worden onderzocht vanuit een vergelijkbaar startpunt.

Folliculaire fase studies bij normale vrouwen hebben aangetoond dat FSH begint te stijgen in de late luteale fase, een piek bereikt in de vroege folliculaire fase, en vervolgens afneemt met het ontstaan van een dominante follikel (21, 22). Het sonografisch verschijnen van de dominante follikel wordt geassocieerd met een stijging van serum E2, dat op zijn beurt gecorreleerd is met een daling van FSH niveaus (23). We hebben ons daarom gericht op de FSH-piek in de vroege folliculaire fase als indicator voor dominante follikel selectie. Zowel in controlecycli als in cycli na onderdrukking van de HPO-as is de folliculaire fase bij oudere vrouwen met ongeveer 2-3 d verkort; met name de vroege folliculaire fase FSH-piek treedt eerder op. De resultaten van het huidige onderzoek suggereren dat deze verkorte folliculaire fase bij oudere vrouwen het gevolg is van een vervroegde rekrutering (d.w.z. vroegere selectie van de dominante follikel) en niet van een versnelde (d.w.z. snellere) groei van de dominante follikel. Als oudere vrouwen een versnelde groei van de dominante follikel hadden, zouden we verwacht hebben een verschil te vinden tussen de groepen in de tijd tussen de vroege folliculaire FSH piek en de LH piek.

Een vermoedelijk mechanisme voor de verkorte folliculaire fase bij oudere vrouwen is de vroegere en hogere FSH stijging bij deze proefpersonen vergeleken met jongere proefpersonen. Dit fenomeen deed zich voor zonder invloed van de voorafgaande luteale fase, wat suggereert dat het begin en de omvang van de vroege folliculaire FSH-stijging te wijten kan zijn aan subtiele verschillen in eierstokhormonen in de vroege folliculaire fase, geassocieerd met afnemende ovariële reserve. Anderzijds stelden we vast dat de folliculaire fase langer was in beide leeftijdsgroepen na nafareline onderdrukking in vergelijking met die in de controle cyclus. Hoewel deze bevinding waarschijnlijk deels te wijten is aan de tijd die de hypofyse nodig heeft om de GnRH-responsiviteit te herstellen (24), ondersteunt het ook het concept dat dominante follikelrekrutering begint in de luteale fase van de voorafgaande menstruatiecyclus (25).

Een kandidaat-hormoon dat waarschijnlijk verantwoordelijk is voor de waargenomen verschillen in vroege folliculaire fase FSH-secretie is inhibine B, een 32-kDa heterodimeer glycoproteïne dat wordt afgescheiden door ovariële follikels en dat selectief de FSH-secretie remt. Inhibine B niveaus zijn gecorreleerd met de cohortgrootte van zich ontwikkelende vroege antrale follikels (26). De afname van de inhibine B-spiegel bij oudere ovulatoire vrouwen kan het gevolg zijn van progressieve folliculaire atresie en de daarmee samenhangende afname van het aantal antrale follikels (10, 27). Oudere vrouwen met FSH verhogingen hebben lagere vroege folliculaire fase niveaus van inhibine B, vermoedelijk een weerspiegeling van de afnemende pool van ovariële follikels (19, 20, 28). Dit hormonale patroon hield aan nadat de hypofyse was gedereguleerd, wat suggereert dat de lage niveaus van inhibine B bij oudere vrouwen onafhankelijk zijn van luteale fase inhibine of steroïde secretie.

Normale dominante follikelgrootte en normale folliculaire fase secretie van E2 en inhibine A geven aan dat de dominante follikel bij oudere vrouwen, eenmaal gerekruteerd, gezond is en reageert op FSH stimulatie. Het lijkt er echter op dat hogere FSH-niveaus nodig zijn om de dominante follikel te rekruteren en een normale functie te laten behouden. De hogere E2-spiegels halverwege de cyclus bij oudere ovulatoire vrouwen (14, 29) kunnen het gevolg zijn van een robuustere afscheiding door de dominante follikel en/of kunnen het resultaat zijn van bijdragen van secundaire follikels. Ons eerdere onderzoek naar de steroïdeninhoud van folliculaire vloeistof suggereert dat de dominante follikel primair verantwoordelijk is voor de hogere circulerende E2 niveaus die worden waargenomen bij oudere premenopauzale vrouwen (14). De resultaten van het huidige onderzoek ondersteunen een relatie tussen de monotrope FSH stijging en vroege ontwikkeling en ovulatie van de dominante follikel. Verdere studies zijn nodig om te bepalen of er ook een relatie is tussen een toename van FSH, hogere preovulatoire E2 niveaus, en/of de versnelde snelheid van follikelatresie waargenomen tegen het einde van het vierde decennium.

Concluderend, deze studie levert bewijs dat de verkorte folliculaire fase waargenomen bij oudere, ovulatoire vrouwen te wijten is aan verkorting van het vroege deel van de folliculaire fase. De late folliculaire fase blijft onveranderd in lengte en hormoonprofiel. Dit suggereert dat de groei van de dominante follikel niet wordt versneld, maar dat de selectie ervan wordt vervroegd. Deze studie toont ook aan dat de verkorte folliculaire fase van de oudere, ovulatoire vrouw niet afhankelijk is van hormonale invloeden van de voorafgaande luteale fase.

Wij danken Mw. Gretchen Davis en Mw. Laurie Guidry voor hun hulp bij het werven van proefpersonen en projectmanagement, de heer Patrick Clarke voor zijn hulp bij de illustraties, en mevrouw Dorothy McGuinness, de heer Arlen Sarkissian, de heer Joseph Moy, en mevrouw Sheila Mallette voor hun deskundige technische hulp bij de tests.

Dit werk werd ondersteund door NIA Grant RO1-AG-14579 en NICHHD Grant U54-HD29164.

Afkortingen:

• CV,

  variatiecoëfficiënt(en);

• E2,

  estradiol;

• HPO,

  hypothalamus-hypofyse-ovarium.