Alai

Laboratoriumgeneeskunde heeft de afgelopen twee decennia aanzienlijke vooruitgang geboekt. Viral load assays zijn geëvolueerd van geneste PCR-assays naar transcriptie-gemedieerde amplificatie naar real-time PCR en blijven evolueren met methoden zoals digitale PCR. Deze vooruitgang heeft geresulteerd in gevoeligere viral load assays met een breder dynamisch bereik, waardoor artsen een beter inzicht krijgen in de respons van een patiënt op therapie en ziekteprogressie.

Een voorbeeld van beter patiëntbeheer met de vooruitgang van de moleculaire diagnostiek is het beheer van HIV-1-patiënten geweest. Volgens de huidige behandelingsrichtlijnen wordt succes bij de behandeling gedefinieerd als een HIV-1 RNA concentratie van minder dan 75 kopieën/mL.1 De definitie van falen bij de behandeling varieert volgens wereldwijde, nationale en landspecifieke richtlijnen, maar wordt gewoonlijk gedefinieerd als een HIV-1 RNA concentratie tussen 50-1000 kopieën/mL.1-3

Deze behandelingsafkapwaarden liggen aan de lage kant van het dynamische bereik van de real-time PCR-tests waar de precisie en reproduceerbaarheid in het geding kunnen zijn. Factoren die de viral load assay prestaties kunnen beïnvloeden zijn het geautomatiseerde platform, nucleïnezuurextractie chemie, PCR primer/probe selectie en ontwerp, PCR amplificatie condities en assay calibratie strategie. Hier zullen we verschillende ontwerpbenaderingen en hun mogelijke invloed op de assayprestaties en klinische resultaten bespreken. (Figuur 1)

Extractieproces

Bij de keuze van de extractiechemie moet men zorgvuldig rekening houden met het monstertype en de analyt. Zo adviseert het Department of Health and Human Services (DHHS) in geval van HIV-1 dat HIV-1 RNA moet worden gebruikt als marker van HIV-1 viremie.1

Het onderscheid tussen HIV-1 RNA en proviraal DNA is belangrijk, omdat het laatste geen marker is van actieve virale replicatie, maar eerder van het vrijkomen van een latent reservoir van het virus, dat al in de cellen is geïntegreerd. Een extractiechemie die zowel HIV-1 RNA als proviraal DNA zuivert, zou de arts geen nauwkeurige weergave van de werkelijke virale replicatie geven; daarom moet in het geval van dit virus alleen de extractiechemie worden gebruikt die specifiek HIV-1 RNA zuivert, om proviraal DNA van de downstream kwantificering uit te sluiten.

Aternatief zou het gebruik van totale nucleïnezuurextractiechemie (TNA) voor de kwantificering van HIV-1 kunnen leiden tot vals-positieve resultaten of onnauwkeurige kwantificering, wat nadelige gevolgen zou hebben voor de behandeling van de patiënt. TNA-extractiechemie kan worden gebruikt voor moeilijkere monstertypes zoals urine of ontlasting of voor assays die zowel RNA/DNA-doelen moeten detecteren.

Doelwitselectie

De extreme virale diversiteit van HIV-, HBV- en HCV-stammen is van het grootste belang om ervoor te zorgen dat moleculair-diagnostische (MDx) tests het juiste resultaat geven, ongeacht de stam(men) die in een monster aanwezig is (zijn).

Om dit probleem aan te pakken, moet het optimale assayontwerp beginnen met de selectie van primer/probe-doel in een genetisch conservatieve regio waar virale diversiteit de minste potentiële impact zal hebben. De genetisch conservatieve regio’s kunnen alleen worden bepaald door sequenties van diverse virale stammen te vergelijken.

Om aan deze behoefte te voldoen, is een wereldwijd surveillanceprogramma van cruciaal belang om de bestaande virale diversiteit in omloop voor HIV-, HBV- en HCV-stammen uitgebreid te beoordelen.4 In een surveillanceprogramma worden sequenties van stammen die in geografisch diverse regio’s zijn verzameld, gebruikt om te bepalen welke regio’s van een viraal genoom het best geconserveerd zijn en het meest geschikt zijn voor detectie met een moleculair-diagnostische test. Door gebruik te maken van circulerende virale sequenties om het testontwerp te onderbouwen, wordt het risico dat stammen door een test worden gemist, aanzienlijk verminderd.

Probe-ontwerp en PCR-cyclusomstandigheden

Naast de selectie van het doelgebied zijn het probe-ontwerp en de PCR-cyclusomstandigheden van cruciaal belang voor een nauwkeurige kwantificering van de virale belasting. Het sonde-ontwerp moet tolerant zijn voor natuurlijk voorkomende polymorfismen en, op hun beurt, voor mogelijke mismatches die binnen het gegeven doelgebied kunnen voorkomen. In de loop van de tijd heeft de sondetechnologie zich verder ontwikkeld, evenals de PCR-methodologie. Het bredere scala van MDx-toepassingen op basis van PCR-technologie naast virale kwantificering vereist het gebruik van verschillende probe-ontwerpen. Probes met minimale groefbinding worden meestal gebruikt voor genotypering en detectie van enkelvoudige nucleotidepolymorfismen.

TaqMan-probes worden vaak gebruikt in assays waarin doelregio’s een hoge mate van instandhouding hebben. Gedeeltelijk dubbelstrengs probes, die beter bestand zijn tegen hoge niveaus van genetische heterogeniteit, hoofdzakelijk als gevolg van de lengte van de probe en de bindingsvoorwaarden, worden gebruikt in gebieden waar een hoge mate van heterogeniteit bestaat.5

Naast het ontwerp van de sonde worden ook de cycli vaak geoptimaliseerd om aan de prestatie-eisen te voldoen (b.v. tolerantie van mogelijke mismatches). Fase-afhankelijk fietsen is een aanpak met cycli bij een lagere temperatuur om de aanvankelijke strengheid te verminderen, gevolgd door cycli bij hoge temperaturen om de specificiteit te behouden. Deze aanpak vermindert het nadelige effect van potentiële primer-mismatches op de monsterkwantificering. Wanneer het moeilijk is om het significante effect van zeldzame polymorfismen te vermijden, kan de detectie van een tweede doelwit in het testontwerp worden opgenomen. Wanneer sequentiediversiteit van invloed is op de detectie van één regio van het virale genoom, zorgt de detectie van een tweede regio ervoor dat een accuraat resultaat wordt verkregen. Gezien de complexiteit van moleculaire tests en de grote virusdiversiteit moet bij het ontwerpen van moleculaire tests een alomvattende aanpak worden overwogen, waarbij gebruik wordt gemaakt van globale surveillance en doelgerichte probeontwerpen. Het simpelweg aanpassen van één strategie, zoals dual-target, kan een vals gevoel van veiligheid geven.

Kalibratiestrategie

Kalibratiestrategie is een integraal onderdeel van het ontwerp van moleculaire assays en is van cruciaal belang om de reproduceerbaarheid over een groot dynamisch bereik te waarborgen. De meeste kwantitatieve methodologieën voor therapiebeheer maken momenteel gebruik van een externe kalibratiecurve om de concentratie van een analyt te bepalen.

In deze assays wordt het signaal van de analyt in een patiëntenmonster vergeleken met een reeks monsters met een bekende concentratie en wordt een eenvoudige lineaire regressie (y=mx+b) gebruikt om de virale belasting te berekenen. Bij deze aanpak worden meestal kalibratiemiddelen gebruikt die als patiëntmonsters door het hele proces worden verwerkt, zodat zowel extractie- als amplificatiereagentia en -instrumenten kunnen worden gekalibreerd.

Als alternatief kunnen kalibratiemiddelen worden gebruikt die niet door de extractie zijn verwerkt, maar deze aanpak brengt het risico met zich mee dat verschillen in terugwinning of een verandering in de reagenssamenstelling niet worden meegerekend, wat mogelijk tot verschillen in kwantificering zou leiden.

Een andere, minder vaak toegepaste strategie is een interne kwantitatieve standaard. Bij deze toepassing wordt gebruik gemaakt van een polynomiale regressielijn van de derde orde (y = ax3 + bx2 + cx + d) over het lineaire bereik met een toelaatbaar maximumverschil van lineariteit. Eerdere studies hebben gesuggereerd dat het aanvaardbare toelaatbare verschil van lineariteit voor sommige van de assays ± 0,2 Log10 bedroeg.6 Dit toelaatbare verschil van lineariteit en de kalibratiebenadering verklaren ook de vertekening die vaak tussen de methodologieën wordt waargenomen, alsook de grotere onnauwkeurigheid aan de onderkant van het dynamische bereik, waar vaak klinische beslissingen worden genomen.

Conclusie

Nauwkeurige en precieze moleculaire assayprestaties zijn van cruciaal belang voor een adequaat therapiebeheer. Onnauwkeurige viral load resultaten kunnen leiden tot onjuiste behandeling en de patiënt kan worden achtergelaten op falende therapie. Deze verkeerde diagnose heeft veel ruimere implicaties dan het beheer van één enkele patiënt, aangezien zij ook kan leiden tot een toename van de overdracht van de resistente virusstam. Vanuit het oogpunt van therapiebeheer is een virus met mutaties die met resistentie in verband worden gebracht, moeilijker te behandelen met beperktere therapiemogelijkheden. Bovendien kunnen vals-positieve percentages onnodige kosten voor herhalingstests of duurdere resistentietests toevoegen, evenals ongerustheid bij de patiënt en de arts.

1. Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in Adults and Adolescents with HIV ontwikkeld door Department of Health and Human Services. https://aidsinfo.nih.gov/guidelines). Accessed September 2019.
2. European AIDS Clinical Society (EACS). EACS Guidelines Version 9.1 October 2018.
3. National Department of Health, South Africa, April 2015, accessed August 2, 2017: https://aidsfree.usaid.gov/sites/default/files/tx_south-africa_pmtct_2015.pdf.
4. Brennan CA, Bodelle P, Coffey R, et al. HIV global surveillance: fundament voor retroviral discovery and assay development. Tijdschrift voor medische virologie. 2006;78 Suppl 1:S24-29.
5. Luk KC, Devare SG, Hackett JR, Jr. Partially double-stranded linear DNA probes: novel design for sensitive detection of genetically polymorphic targets. Journal of Virological Methods. 2007;144(1-2):1-11.
6. Vermehren J, Colucci G, Gohl P, et al. Ontwikkeling van een tweede versie van de Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan hepatitis C virus kwantitatieve test met verbeterde genotype inclusiviteit. Tijdschrift voor Klinische Microbiologie. 2011;49(9):3309-3315.

Acknowledgment: Auteur wil Mary Rodgers en Shihai Huang erkennen en bedanken voor hun review van dit artikel.