Alai

Kanker van hoofd en nek is de zevende meest voorkomende vorm van kanker door incidentie en mortaliteit, met 890.000 nieuwe gevallen en 450.000 sterfgevallen wereldwijd in 2018 . Behandeling blijft een uitdaging met de huidige therapieën resulterend in vijf-jaars overlevingspercentages van minder dan 50% voor patiënten met lokaal gevorderde ziekte . Geneesmiddelenresistentie en toxiciteit beperken de werkzaamheid van chemotherapeutica zoals cis- of carboplatine, 5-fluorouracil, en taxanen. De introductie van gerichte agentia zoals cetuximab, nivolumab of pembrolizumab heeft het resultaat verbeterd, maar heeft het probleem van primaire of verworven behandelingsresistentie bij de meerderheid van de patiënten niet opgelost . Slechts zeer weinig biomarkers worden momenteel in de klinische praktijk gebruikt of zijn daadwerkelijk overgegaan tot validatie voor routinematig gebruik . Betrouwbare preklinische modellen zijn daarom van cruciaal belang om de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij HNSCC resistentie tegen behandeling en progressie beter te begrijpen, en om meer effectieve therapeutische strategieën te ontwikkelen.

Geïmmortaliseerde cellijnen afgeleid van HNSCC tumoren vormen een waardevol instrument voor functionele analyse van resistentie tegen behandeling. Drug screening in monolayer celculturen blijft de gangbare benadering voor het identificeren van nieuwe therapeutische middelen. Driedimensionele (3D) culturen, die de architectuur van het tumorweefsel en de cellulaire omgeving beter weergeven, zouden echter superieur kunnen zijn voor het voorspellen van de werkzaamheid van geneesmiddelen bij patiënten. Er zijn inderdaad grote variaties in gevoeligheid voor bestraling en geneesmiddelen aangetoond in studies waarbij gebruik werd gemaakt van 3D-celculturen, vergelijkbaar met die welke werden aangetroffen bij in vivo tumoren. Zelfs als 3D-culturen nuttig zijn om de interacties tussen verschillende celpopulaties te bestuderen, reproduceren zij niet volledig de complexiteit van HNSCC. De ontwikkeling van nieuwe therapieën zal dus uiteindelijk klinisch relevante diermodellen van HNSCC vereisen, die nauwkeurig de cellulaire en moleculaire veranderingen weergeven die geassocieerd zijn met het ontstaan en de progressie van menselijke kanker. In dit opzicht hebben carcinogeen geïnduceerde HNSCC modellen, transgene dieren en transplanteerbare xenograft modellen hun intrede gedaan op het gebied van HNSCC onderzoek. Deze review beschrijft de meest gebruikte preklinische modellen van HNSCC (schematisch weergegeven in Fig. 1) en geeft een overzicht van hun sterke punten en beperkingen. We bespreken ook nieuwe benaderingen van gepersonaliseerde behandelingsselectie op basis van deze modellen.

Ex vivo modellen

Geïmmortaliseerde HNSCC cellijnen

Vier decennia geleden werden de eerste protocollen voor ex vivo culturen van HNSCC cellen gerapporteerd . Na het oplossen van eerdere obstakels, zoals fibroblast overgroei en afhankelijkheid van feeder lagen met deze protocollen, werden HNSCC cellijnen met succes opgericht. Kweektechnieken zijn sindsdien verder verbeterd, en verschillende HNSCC cellijnen die stabiel groeien over talrijke passages zijn gegenereerd. Een gedetailleerde beschrijving van alle beschikbare HNSCC cellijnen zou buiten het bestek van dit overzicht vallen. Wij verwijzen de lezer daarom graag naar twee eerdere overzichtsartikelen. Aangezien geïmmortaliseerde HNSCC cellijnen gemakkelijk in stand gehouden en uitgebreid kunnen worden, zijn zij op grote schaal gebruikt om genetische veranderingen en biologische reacties op chemische en genetische verstoringen te bestuderen, om potentiële moleculaire doelwitten te identificeren, en om nieuwe kleine moleculaire en biologische therapeutica te ontwikkelen. Meer recent is aangetoond dat deze cellijnen ook kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van intratumorale heterogeniteit en klonale evolutie die optreedt onder druk van therapie. Gegevens van dergelijke uitgebreide moleculaire en functionele studies in deze modellen zijn verzameld in bibliotheken zoals de Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE), die een waardevolle opslagplaats van menselijke kankerdiversiteit vertegenwoordigt.

Hoewel HNSCC cellijnen gekweekt in tweedimensionale (2D) monolaagculturen belangrijke modellen blijven in de zoektocht naar nieuwe therapeutische benaderingen voor deze ziekte, lijden zij over het algemeen aan hun onvermogen om de histologische aard, driedimensionale (3D) architectuur en structurele en functionele verschillen van de tumor in vivo te weerspiegelen. Deze beperkingen hebben een aanzienlijke invloed op de informatieve waarde van in vitro studies die de doeltreffendheid van gevestigde en nieuwe behandelingsmodaliteiten voor HNSCC in monolayer culturen evalueren. Inderdaad werden opmerkelijke verschillen in gevoeligheid van 2D versus 3D culturen van HNSCC cellijnen gerapporteerd voor bestraling en behandeling met geneesmiddelen, b.v. met cisplatine , cetuximab en de mTOR remmer AZD8055 . Vergelijkende moleculaire analyse van cellen die groeien in 2D versus 3D kweken gaven mogelijke verklaringen voor de lagere gevoeligheid van cellen in 3D kweken, zoals de expressie en activering van genen geassocieerd met DNA reparatie , en verhoogde expressie niveaus van genen geassocieerd met epitheliale-mesenchymale overgang en stamheid onder 3D omstandigheden.

Genetische instabiliteit en het optreden van klonale selectie tijdens in vitro kweken zijn verdere potentiële beperkingen van kanker cellijnen, en kunnen verklaren waarom bevindingen met cellijnen vaak moeilijk te reproduceren zijn. Een uitgebreide analyse van stammen van de veelgebruikte MCF7 borstkanker- en A549 longkankercellijnen heeft inderdaad een uitgebreide genomische variatie tussen de stammen aan het licht gebracht, die in verband werd gebracht met variatie in biologisch zinvolle celeigenschappen. Belangrijk is dat, wanneer de stammen werden getest tegen 321 kankerbestrijdende verbindingen, er aanzienlijk verschillende geneesmiddelenreacties werden waargenomen, waarbij ten minste 75% van de verbindingen sommige stammen sterk inhielden, maar bij andere volledig inactief waren. Deze studie onderstreept duidelijk de dringende behoefte aan verbeterde ex vivo modellen om maximaal reproduceerbaar kankeronderzoek te ondersteunen.

Geavanceerde ex vivo modellen van HNSCC

Köpf-Maier en collega’s waren de eersten die een methode vaststelden waarmee menselijke carcinomacellen van verschillende histologische entiteiten, waaronder plaveiselcelcarcinomen (SCC’s) van de keelholte, zich in vitro konden reorganiseren tot “organoïde structuren” . Zij toonden aan dat deze organoïde culturen de kritische eigenschappen van de in vivo toestand behielden, zoals de 3D architectuur, de groei van heterogene celtypes van een individueel carcinoom en de morfologische differentiatie onder relatief eenvoudige experimentele omstandigheden . In een latere studie toonde dezelfde groep aan dat deze organoïde culturen kunnen worden gebruikt voor het testen van geneesmiddelen, en dat de responsgegevens die daaruit werden verkregen, overeenkwamen met de respons van patiënten op therapie. De auteurs waren de eersten die organoïde culturen voorstelden als gepersonaliseerd in vitro platform voor het testen van geneesmiddelen, waarmee de individuele chemosensitiviteit van carcinomen binnen enkele dagen kon worden voorspeld.

Sindsdien zijn technieken om weefsels in vitro in 3D als organotypische structuren te laten groeien verfijnd. Protocollen zijn ontwikkeld voor het opzetten van organoïden uit volwassen en embryonale stamcellen die in staat zijn om zichzelf te organiseren in 3D-structuren die het weefsel van oorsprong weerspiegelen (voor een overzicht zie Clevers, 2016 ). De eerste volwassen stamcel-afgeleide organoïde culturen werden vastgesteld van intestinale stamcellen van muizen die werden geplaatst in omstandigheden nabootsing van de intestinale stamcel niche . Voorwaardelijke herprogrammering geïnduceerd door toevoeging van R-spondin-1, epidermale groeifactor (EGF) en Noggin aan het kweekmedium, en inbedding van de cellen in een extracellulaire matrix-providerende keldermembranen extract, is aangetoond dat volwassen stamcellen te stimuleren tot zelfvernieuwing, proliferatie en gedifferentieerde nakomelingen te vormen, die lijken op de darm epitheel . Deze techniek, die oorspronkelijk werd ontwikkeld om geïnfecteerd, ontstekings- en neoplastisch weefsel van het menselijke maag-darmkanaal te bestuderen, is niet alleen gebruikt voor het opzetten van organoïdculturen van een verscheidenheid van menselijk normaal weefsel, maar ook van tumorweefsel dat van patiënten afkomstig is. Deze studies hebben de reeks beschikbare kankermodellen aanzienlijk uitgebreid en verbeterd.

Meer recent werden de vroege bevindingen van Köpf-Maier en collega’s dat HNSCC organoïde culturen een geschikt in vitro platform zijn voor het testen van geneesmiddelen, bevestigd door verschillende onafhankelijke studies. Hoewel aanzienlijke verschillen in de slagingspercentages van het opzetten van primaire op lange termijn groeiende organoïdculturen van HNSCC-patiënten werden gerapporteerd (30% versus 65% ), beschreven alle studies tot nu toe unaniem dat organoïden veel eigenschappen van de oorspronkelijke tumor behouden, waaronder intratumorale heterogeniteit , mutatieprofiel en eiwitexpressiepatronen . Bovendien werd aangetoond dat organoïden hun tumorigene potentieel bij xenotransplantatie behielden. Reacties op behandeling met geneesmiddelen in vivo bleken vergelijkbaar met de IC50 berekend uit organoïden door drug gevoeligheid assays in vitro Bovendien, stralingsgevoeligheid gegevens van organoïde testen gecorreleerd met klinische respons bij patiënten . Belangrijk is dat niet alleen behandelingsgerelateerde effecten in tumoren, maar ook ongewenste neveneffecten van therapie in normaal weefsel in organoïd-modellen kunnen worden bestudeerd. Bijvoorbeeld, patiënt-afgeleide speekselklier organoids zijn gebruikt voor het ontleden van de moleculaire basis van hyposalivation, een frequente ernstige bijwerking van bestraling.

Een verdere studie geïdentificeerd primaire 2D-celculturen van HNSCC patiënten tumoren als aanvullende waardevolle ex vivo HNSCC model . Hier, geïndividualiseerde grootschalige screening van anti-kanker therapeutica reproduceerbaar geïdentificeerd geneesmiddelen die anti-tumor activiteit vertonen in gematchte patiënt-afgeleide xenograft (PDX) modellen, waardoor extra bewijs dat primaire HNSCC culturen kunnen worden gebruikt om therapeutische besluitvorming te ondersteunen in een routinematige klinische setting.

Organoïde culturen van menselijke normale, dysplastische en maligne tongweefsels zijn ook gebruikt voor het reproduceren van de belangrijkste stappen van de tong tumorigenese . Histomorfometrie, immunohistochemie, en elektronenmicroscopie analyses in 3D co-culturen van tong-afgeleide primaire keratinocyten en fibroblasten in collageen matrix toonden aan dat de gelaagde groei, celproliferatie, en differentiatie vergelijkbaar waren tussen co-culturen en hun respectieve inheemse weefsels, echter, ze verschilden sterk in culturen gekweekt zonder fibroblasten . Deze resultaten ondersteunen eerdere studies die een belangrijke rol van kanker-geassocieerde fibroblasten in de pathogenese van HNSCC aantonen. Deze gegevens, samen met de uitgebreide literatuurgegevens over tumorbevorderende effecten van de tumormicro-omgeving (TME), pleiten sterk voor het toekomstig gebruik van meer geavanceerde preklinische modellen die alle belangrijke TME-componenten omvatten. Nieuwe protocollen zijn tegenwoordig beschikbaar voor het genereren van organoïden die naast stromale cellen ook de immuuncellen van de patiënt bevatten. Hoewel organoïdculturen dus beperkingen hebben, zoals het verbruik van aanzienlijke tijd en middelen en de opname van niet gedefinieerde extrinsieke factoren die de uitkomst van de experimenten kunnen beïnvloeden (tabel 1), zouden deze culturen geschikte modellen kunnen zijn voor de ontwikkeling en optimalisering van toekomstige behandelingsstrategieën, waaronder immuun-oncologische geneesmiddelen.

Diermodellen

Carcinogeen-geïnduceerde diermodellen van mondkanker

Het is bekend dat de meeste humane SCC’s worden geïnduceerd door chronische blootstelling aan carcinogenen. Aanvankelijk faalden experimentele benaderingen om maligne tumoren in de mond chemisch te induceren altijd, omdat het mondslijmvlies resistenter was tegen de inwerking van chemicaliën dan de huid. Uiteindelijk kon met 9, 10 dimethyl-1, 2, benzantraceen (DMBA) met succes HNSCC worden geïnduceerd in de hamsterwangzak als diermodel. Net als bij patiënten verliep de carcinogenese van de mucosa in vier opeenvolgende stadia: hyperplasie, atypische hyperplasie, carcinoma in situ, en plaveiselcelcarcinoom. Er waren echter moeilijkheden om een onderscheid te maken tussen veranderingen van het epitheel veroorzaakt door direct contact met het carcinogeen versus echte premaligne transformatie omdat veranderingen voorbijgaand en omkeerbaar waren in de DMBA-geïnduceerde wangtumoren. Bovendien bezaten de door DMBA veroorzaakte tumoren niet veel van de histologische kenmerken van gedifferentieerd HNSCC en leken zij niet sterk op vroege menselijke laesies. Nog belangrijker is dat de tumor zich voordeed in de hamsterwangzak, die een immunodeficiënt gebied vertegenwoordigt dat bij de mens afwezig is, zodat dit model het menselijke HNSCC niet erg goed nabootste. Hoewel DMBA vervolgens op grote schaal werd gebruikt in mondkankermodellen van hamsters en ratten, bleek het moeilijk te zijn mondcarcinoom met DMBA bij muizen te induceren. 4-Nitroquinoline 1-oxide (4-NQO), een in water oplosbaar quinolone derivaat, werd toen geïntroduceerd als krachtige inducer van orale tumoren. Toediening van 4-NQO met drinkwater of de topische toepassing ervan resulteerde in meerdere dysplastische, preneoplastische en neoplastische laesies na langdurige behandeling in zowel rat- als muismodellen, en deze laesies leken sterk op neoplastische transformatie in de mondholte bij de mens. Na verschillende wijzigingen werd het model gestandaardiseerd door Tang et al. , die aantoonden dat toediening van 4-NQO in het drinkwater van C57BL/6 muizen gedurende 16 weken mondholtecarcinogenese met hoge incidentie bevordert.

Door de opeenvolging van gebeurtenissen en het type laesies te recapituleren dat wordt gezien tijdens carcinogenese bij de mens, bieden de hierboven beschreven carcinogeen-geïnduceerde diermodellen een uitstekend in vivo systeem voor het bestuderen van belangrijke “driver events” van orale carcinogenese. Deze modellen zijn ook op grote schaal gebruikt voor de ontwikkeling van strategieën voor kankerchemopreventie, terwijl minder studies gebruik hebben gemaakt van deze diermodellen om de werkzaamheid van geneesmiddelen voor de behandeling van gevestigde tumoren te evalueren. Een belangrijke beperking als screeningplatform voor geneesmiddelen is de lange tijd die nodig is om de evaluatie van de effecten van een testverbinding te voltooien (tabel 1). De meeste carcinogeen-geïnduceerde diermodellen van HNSCC hebben tot 40 weken nodig om volwaardige carcinomen te ontwikkelen, en zelfs langer als metastase het studie-eindpunt is. In deze context biedt een recent rapport van Wang en collega’s een potentiële kortere weg door gebruik te maken van 4NQO-afgeleide cellijn-geïnduceerde tongtumor xenograften als een alternatief meer expedient syngeneic muismodel.

Het grote voordeel van het 4NQO-geïnduceerde diermodel is zijn geschiktheid om effecten van carcinogene en genetische factoren in tumorigenese te bestuderen, vooral in een immunocompetente omgeving. Het biedt dus een geschikt platform voor het versnellen van de ontwikkeling van immunotherapeutische regimes in HNSCC . Het model is ook met succes gebruikt om de rol van vermeende kankerstamcellen in behandelingsresistentie, recidief, en metastase te onderzoeken. Het potentieel voor het ontwikkelen van nieuwe therapeutische strategieën gericht op niet alleen de proliferatieve tumor bulk, maar ook de relatief rustige subpopulatie van kankerstamcellen is vastgesteld.

Genetisch gemanipuleerde muismodellen

Wanneer DNA schade door chemicaliën willekeurig optreedt, wordt volgens de tumor evolutietheorie willekeurige verwerving van mutaties in het genoom gevolgd door selectie van klonen met genetische veranderingen die celoverleving en proliferatie vergemakkelijken. Moleculaire profileringstudies hebben verschillende vermoedelijke ‘driver genen’ geïdentificeerd die bijdragen tot de ontwikkeling van kanker in HNSCC. Deze moleculaire studies leverden echter geen direct bewijs voor causaliteit of een gedetailleerd inzicht in de biologische mechanismen waardoor deze genen tumorontwikkeling aandrijven. Hoewel carcinogeen-geïnduceerde diermodellen het heterogene landschap van genomische veranderingen in humane primaire tumoren goed kunnen reproduceren, is slechts een fractie van deze mutaties de drijvende kracht achter tumorigenese door het aantasten van oncogenen of tumoronderdrukkende genen, maar veel mutaties zijn passagiers zonder duidelijke bijdrage aan tumorontwikkeling. Deze studies tonen ook niet aan of de drijvende krachten essentieel zijn voor het in stand houden van de tumor en zijn daarom wellicht van beperkt nut voor het ontwerpen van effectieve therapeutische strategieën. Daarentegen bieden preklinische modelsystemen zoals genetisch gemanipuleerde muismodellen (GEMMs) een experimenteel haalbare benadering waarin de biologische effecten van specifieke mutaties in detail bestudeerd kunnen worden in een gecontroleerde genetische achtergrond. In de volgende hoofdstukken beschrijven we de belangrijkste bevindingen van eerdere studies op basis van GEMMs in HNSCC.

Er zijn tot nu toe maar weinig GEMMs beschreven die geassocieerd zijn met spontane HNSCC-vorming in afwezigheid van chronische blootstelling aan carcinogenen (tabel 2). Een genetisch gemanipuleerd muismodel van mondkanker werd voor het eerst geïntroduceerd door Schreiber en collega’s . Na kruising van muizen die transgeen zijn voor het v-Ha-ras gen met transgene muizen die E6/E7 van het humaan papilloma virus (HPV)-16 bevatten, werd de ontwikkeling van tumoren in de mond, het oor en het oog vanaf de leeftijd van ongeveer 3 maanden waargenomen. Tegen 6 maanden had 100% van de bi-transgene dieren tumoren in de mond ontwikkeld, terwijl de prevalentie in elk van de twee single-transgene groepen 0% was. De voorwaarde van een tweede genetische hit voor tumorigenese werd ook gemeld voor een transgeen model van K-rasG12D, waarin een tamoxifen-induceerbaar Cre recombinase onder controle van de keratine-14 (K14) promoter werd gebruikt voor het richten van de endogene K-ras locus . In het single-transgene model, werden alleen grote papillomen in de mondholte en hyperplasias in de tong waargenomen na 1 maand tamoxifen behandeling . Echter, als muizen werden gekruist met floxed p53 voorwaardelijke knock-out muizen, 100% van de samengestelde muizen ontwikkelde tong carcinomen zo vroeg als 2 weken na tamoxifen inductie . Naast expressie van de virale oncogenen E6/E7 en verlies van TP53, zijn homozygote deletie van de transcriptiefactor krüppel-like-factor 4 (KLF4) en heterozygote deletie van SMAD4 geïdentificeerd als tweede genetische hits die in combinatie met een oncogene driver-mutatie de vorming van orale tumoren met hoge prevalentie bevorderen (tabel 2).

Ondanks het feit dat de progressie van HNSCC wordt gerecapituleerd, blijft de geschiktheid van de hierboven beschreven HNSCC modellen als platform voor het onderzoeken van nieuwe moleculair gerichte behandelingsbenaderingen enigszins twijfelachtig, gezien het feit dat de genetische veranderingen die tumorigenese in deze dieren stimuleren, niet of slechts zelden worden aangetroffen in HNSCC patiënten. In het algemeen werden mutaties in HRAS en KRAS slechts in 6 en 0,2% van de HNSCC patiënten gevonden, en homozygote deletie van KLF4 en SMAD4 in respectievelijk 0 en 4% van de gevallen. Bovendien zijn gevallen met een van de samengestelde tumorgevoelige genotypen van de hierboven beschreven GEMM’s niet geïdentificeerd in het HNSCC-cohort van The Cancer Genome Atlas (TCGA) . Een GEMM van spontaan HNSCC dat meer lijkt op de moleculaire kenmerken van de menselijke ziekte zou het enkelvoudige gen-knockout model van SMAD4 in hoofd en hals epithelia (HN-Smad4del/del) kunnen zijn, gerapporteerd door Bornstein en collega’s. Inderdaad, hoewel homozygote deletie zeldzaam is, wordt SMAD4 heterozygoot verlies gedetecteerd in 30-35% van primaire HNSCCs geassocieerd met downregulatie van Smad4 expressie niveaus. Meer recent werd een significante intratumorale heterogeniteit van SMAD4 verlies in primaire HNSCC tumoren gerapporteerd. Interessant is dat in ex vivo culturen afgeleid van PDX, de cel subpopulatie die heterozygote SMAD4 verlies door deletie of verminderde expressie vertoonde beter concurreerde dan cellen met wildtype SMAD4 genotype van de ouderlijke tumor, wat suggereert een overlevingsvoordeel van Smad4-deficiënte cellen. Ter verdere ondersteuning van de geschiktheid van deze single-knockout GEMM, HNSCC van HN-Smad4del/del muizen vertoonde een verhoogde genomische instabiliteit , die gecorreleerd is met een verlaagde expressie en functie van genen die coderen voor eiwitten in de Fanconi anemie/BRCA DNA reparatie pathway , ook gekoppeld aan HNSCC gevoeligheid bij de mens. Bovendien vertoonden zowel normaal hoofd-halsweefsel als HNSCC van HN-Smad4del/del muizen ernstige ontsteking, die ook in verband is gebracht met pathogenese bij de mens, waar orale bacteriën en inflammatoire mediatoren geassocieerd met parodontale aandoeningen co-factoren kunnen zijn in de initiatie en promotie van orale SCC.

Sinds het oorspronkelijke rapport in 2009, is het HN-Smad4del/del model gebruikt voor het in detail analyseren van de moleculaire processen die betrokken zijn bij HNSCC tumorigenese. Voor zover wij weten, is het nog niet gebruikt voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën. Deze beperking kan worden verklaard door een mediane aanvangstijd van 40 weken voor tumorontwikkeling in dit model, een beperking vergelijkbaar met carcinogeen-geïnduceerde diermodellen van mondkanker (tabel 2). De integratie van carcinogeenbehandeling om tumorvorming in single-transgene GEMMs te versnellen zou dus een geschikte manier kunnen zijn om deze beperking op te lossen, zoals reeds met succes aangetoond in studies van GEMMs met een deletie in een tumorsuppressorgen (GRHL3 , PTEN ) of overexpressie van oncogene microRNAs (tabel 1).

Patient-derived xenograft models

De ontwikkeling en verbetering van ernstig immuundeficiënte muizenstammen heeft de beschikbaarheid van PDX-modellen voor kankeronderzoek opmerkelijk vergroot. Verschillende onderzoeksgroepen hebben met succes PDX-modellen voor HNSCC ontwikkeld. In onze eigen serie werd een totaal entpercentage van 48% waargenomen, maar de entpercentages leken sterk te variëren tussen verschillende subgroepen van patiënten. De beperkende factoren voor enting zijn nog niet duidelijk geïdentificeerd. De plaats van implantatie en muizenstammen lijken van invloed te zijn op het entpercentage. Bovendien zijn pathologische risicofactoren zoals tumorhistologie en HPV-status belangrijke determinanten voor PDX-vorming. In het algemeen hebben ongedifferentieerde HPV-negatieve tumoren met een agressieve groei meer kans om te enten. Dienovereenkomstig zijn de snelheid en de kinetiek van PDX engraftment geassocieerd met een ongunstige prognose van patiënten. In tegenstelling tot HPV-negatieve tumoren, slagen HPV-geassocieerde HNSCC tumoren er vaak niet in te enten. Aangezien deze tumoren groeien op immuun-geassocieerde plaatsen zoals de tonsil of de tongbasis, houdt hun transplantatie naar immunodeficiënte muizen zonder immunologische controle van viraal geïnfecteerde cellen het risico in van co-transfer van Epstein-Barr virus (EBV) positieve B-cellen. Als gevolg daarvan treedt vaak ongecontroleerde B-celproliferatie op en transformatie tot EBV+ lymfoom. Aangezien de proliferatiesnelheid van deze kunstmatige lymfomen veel hoger is dan de tumorcelproliferatie in getransplanteerde weefselfragmenten van SCC, worden de oorspronkelijke tumortransplantaten vaak overwoekerd. Daarom is histopathologische validatie van PDX door een door de raad van bestuur gecertificeerd patholoog essentieel om de plaveiselcelcarcinoomhistologie van het model te bevestigen.

De vraag hoe goed PDX lijken op de primaire patiëntentumor is door veel groepen behandeld. Zoals aangetoond voor andere tumor entiteiten, gevestigde HNSCC modellen in muizen vertonen histopathologische kenmerken als de oorspronkelijke patiënt tumor . Uitgebreide genetische analyse van primaire tumoren en afgeleide PDX modellen door next generation sequencing onthulde vergelijkbare patronen en allelic frequenties van moleculaire afwijkingen . De correlatie tussen mutatieprofielen van oorspronkelijke tumoren en afgeleide modellen was significant hoger voor PDX (R = 0,94) in vergelijking met cellijnen (R = 0,51) . Methylome analyse toonde ook een hoge concordantie tussen PDX en patiënt tumoren. Een gemiddelde van slechts 2,7% van de onderzochte CpG sites ondergingen belangrijke methyleringsveranderingen als gevolg van het transplanteren van tumoren naar muizen. Bovendien toonden genexpressiestudies de algemene verwantschap aan van ouderlijke tumoren met hun PDX, zoals bevestigd door hun clustering samen in unsupervised hierarchical clustering analysis . In tegenstelling tot het toenemende bewijs voor het overeenkomen van genoom en transcriptoom profielen tussen PDX en primaire HNSCCs, bestaan er slechts weinig gegevens voor eiwitexpressie. Een eerste voorlopige analyse van PDX-weefsel met behulp van reverse-phase protein array (RPPA) onthulde eiwitprofielen die vergelijkbaar zijn met de TCGA HNSCC eiwitexpressiegegevens , wat suggereert dat er ook op dit niveau overeenkomst bestaat tussen origineel weefsel en afgeleid model.

Een belangrijk kenmerk van PDX is het behoud van een stromaal compartiment. Hoewel menselijk stroma wordt vervangen door muis stroma binnen de eerste passages, blijft een geïntegreerde stroma, waardoor de evaluatie van verbindingen gericht op dit compartiment of crosstalk tussen stromale compartiment en tumorcellen mogelijk maakt. Verder bouwen tumoren die in muizen zijn gekweekt hun eigen tumorvasculatuur op, wat de mogelijkheid biedt het angiogene netwerk te evalueren en te interfereren met verbindingen die gericht zijn op angiogenese. Na het opzetten van het model kunnen tumoren die in muizen zijn gekweekt, worden geoogst, vitaal worden ingevroren en indien nodig worden ontdooid en opnieuw in muizen worden getransplanteerd. Over het geheel genomen kan PDX worden beschouwd als een geschikte methode voor tumorweefselexpansie, en een veelbelovend preklinisch modelsysteem voor mechanistische studies en de ontwikkeling van therapeutische strategieën.

Met de recente komst van immunotherapie in het behandelingsalgoritme van vele kankertypes, waaronder HNSCC, is het ontbreken van een functionele immuunomgeving in PDX een belangrijk obstakel geworden dat moet worden overwonnen. Verschillende strategieën zijn voorgesteld om een immuunsysteem te implementeren in immunodeficiënte muizen. In de baanbrekende studie van Mosier en collega’s werd aangetoond dat de injectie van menselijke perifere mononucleaire cellen (PBMC’s) resulteerde in de stabiele reconstitutie op lange termijn van een functioneel menselijk immuunsysteem in muizen met ernstige gecombineerde immunodeficiëntie (SCID). Aldus konden immunoproficiënte PDX-modellen worden gegenereerd door PBMC’s van patiënten over te brengen naar de PDX-dragende muizen. Bij deze aanpak ontbreken echter een goede immuuncelontwikkeling en T-cel priming, wat resulteert in de afwezigheid van bepaalde lijnen van menselijke immuuncellen in muizen. Meer verfijnde immuunreconstitutieprotocollen die vervolgens werden ontwikkeld, zijn gebaseerd op de overdracht van menselijke CD34+ stamcellen in NSG-muizen, alsook op het implanteren van menselijke foetale thymus en leverweefsel onder het nierkapsel van deze muizen. Deze aanpak resulteerde in de langdurige enting en systemische reconstitutie van een volledig menselijk immuunsysteem met inbegrip van multilineage menselijke immuuncellen bestaande uit T-, B-, NK-, dendritische cellen en macrofagen. Helaas is deze methode niet haalbaar voor een groot aantal PDX wegens de complexiteit van het model. Een meer veelbelovende procedure is voorgesteld in melanoom waar tumor-infiltrerende T lymfocyten (TILs) geïsoleerd uit het tumorweefsel gebruikt voor PDX generatie werden in vitro geëxpandeerd door menselijke interleukine 2 (IL2) vóór injectie in tumor-dragende PDX muizen .

Het potentieel van PDX modellen om de behandeling van de patiënt te begeleiden

De waarde van PDX om individuele patiënt behandeling beslissing te begeleiden moet nog worden verduidelijkt. In het algemeen zijn patiënt-tot-PDX correlaties in verschillende tumorentiteiten, waarbij behandelingsresponsen tussen muizen en patiënten zijn vergeleken, gedaan met gebruikmaking van retrospectieve gegevens over klinische resultaten. Voor zover wij weten, zijn dergelijke vergelijkingen bij voldoende grote steekproeven nog niet uitgevoerd bij HNSCC. Belemmeringen voor de waarde van dergelijke benaderingen zijn de geneesmiddeldosering bij muizen, die gewoonlijk de maximaal getolereerde dosis weerspiegelt, dosisvariabiliteit binnen verschillende muizenstammen en vooral de definitie van een klinisch zinvol eindpunt. In de klinische setting worden tumorresponsen bepaald door RECIST. Bij muizen is een zeer heterogeen geheel van mogelijke eindpunten gebruikt om de werkzaamheid van behandelingen met één geneesmiddel te bepalen, waaronder tumorregressie uitgedrukt als relatieve groeiremming, tumorvolume in vergelijking met een controlegroep, tumorgroeiremming en tijd tot het eindpunt. Verdere algemene beperkingen van het model zijn de hoge kosten voor het opzetten van PDX, de variërende engraftatiepercentages en de tijd die verstrijkt tussen de eerste transplantatie en de resultaten van de screening van de behandeling. Tot dusver hebben wij in onze grote verzameling van bijna 80 HNSCC PDX-modellen geen voorspellende waarde kunnen vaststellen voor geneesmiddelspecifieke tumorresponsen in het xenograft-model. Niettemin adverteren verschillende bedrijven met PDX als een hulpmiddel om behandelingsrespons te voorspellen. In 2016 startte Champions Oncology een haalbaarheidsstudie (NCT02752932) om de voorspellende waarde van PDX te onderzoeken. Helaas zijn er tot nu toe geen resultaten gepubliceerd.

Het belangrijkste nadeel van PDX is de langere tijd die nodig is voor modeloprichting en -uitbreiding in vergelijking met organoïden, waardoor hun toekomstige gebruik als individueel platform voor drugscreening in de klinische routine minder waarschijnlijk is. Bovendien zou re-constitutie met van de patiënt afgeleide TME-componenten die ontbreken in beide modellen die met de huidige protocollen worden gegenereerd, veel gemakkelijker moeten kunnen worden bereikt in organoïden dan in xenograftmuismodellen. Dit zal de opname mogelijk maken van anti-kankertherapieën die het TME beïnvloeden (bv. everolimus, bevacizumab, anti-PD-1/PD-1 L-antilichamen) in toekomstige ex vivo screeningbenaderingen.