Alai

RTT fibroblasts show a defective autophagy activation under starving conditions

Om de hypothese betreffende een defecte autofagie bij RTT patiënten te verifiëren, analyseerden we autofagie activering onder verhongering omstandigheden in de huid primaire fibroblasten geïsoleerd uit RTT-patiënten (n = 4) en gezonde proefpersonen (n = 4)17,19.

We bepaalden eerst de levensvatbaarheid in de tijd van gezonde en RTT-fibroblasten gekweekt in verhongeringsmedium door zowel MTT- als Trypan-blauwe uitsluitingstests. Met betrekking tot de levensvatbaarheid van RTT fibroblasten gekweekt in standaard medium, RTT fibroblast levensvatbaarheid daalde na 4 uur van verhongering (20 ± 3,3% van stervende cellen, p < 0,05); dit percentage aanzienlijk toegenomen na 6-8 uur van verhongering (60 ± 5,1% van stervende cellen, p < 0,05) (Fig. 1a). Omgekeerd waren gezonde fibroblasten nog volledig levensvatbaar na 4 uur verhongering met slechts een zeer geringe vermindering van de levensvatbaarheid na 6-8 uur (10 ± 1,2% van stervende cellen, p < 0,01) met betrekking tot de levensvatbaarheid van fibroblasten gekweekt in standaard medium (Fig. 1a). Dus, als uit een directe vergelijking van de levensvatbaarheid van de twee cellijnen op elk tijdstip, bleek dat de levensvatbaarheid van RTT fibroblasten ernstig werd gecompromitteerd vanaf tijdstip 4 h (zie details in de figuur legenden, p < 0,05). Bovendien bleek uit een Western blotting (WB) analyse dat in RTT fibroblasten die 4 uur verhongerd waren, een band die overeenkomt met het p25 fragment van het poly (ADP-ribose)polymerase-1 (PARP) sterk verhoogd was (96 ± 4%, p < 0.001) ten opzichte van de zwakke detectie op tijdstip 0. Dit fragment komt vrij door de caspase-afhankelijke afbraak van het eiwit tijdens de vroege fase van apoptose inductie (Fig. 1b)35. Het p25 fragment was bijna niet detecteerbaar in de gezonde fibroblasten onder dezelfde experimentele omstandigheden.

Deze gegevens bevestigden dat RTT fibroblasten niet groei verdroegen in een hongermedium, en snel apoptose ondergingen. Daarom hebben we verder onderzocht de autofagische flux door het monitoren van de LC3B-II marker klaring in de aanwezigheid en in de afwezigheid van een lysosoom-remmer, zoals chloroquine (CQ)24,25,26,27,28,29,30.

Na te hebben uitgesloten dat een CQ-gekoppeld cytotoxisch effect (Supplementary Fig. S1), werden gezonde en RTT fibroblasten gekweekt, hetzij in rust of in hongersnood media gedurende 2 uur in de aanwezigheid of afwezigheid van 20 µM van CQ om de LC3B-II / GAPDH ratio te kwantificeren door WB (Fig. 2a). Het patroon van de LC3B-II/GAPDH ratio (of een andere interne controle die niet wordt gemoduleerd door autofagie) onder omstandigheden van autofagie activering en in de aanwezigheid en in de afwezigheid van CQ (of een andere lysosomale remmer) wordt beschouwd als een geldige strategie om de autofagie flux te controleren.

In gezonde fibroblasten, gekweekt in standaard medium, LC3B-I was duidelijk immuno-detected, terwijl LC3B-II was flauw. De LC3BII/GAPDH ratio van gezonde fibroblasten gekweekt in standaard medium in de afwezigheid en in de aanwezigheid van CQ was vergelijkbaar (Fig. 2a, linker paneel). Deze observatie suggereert dat de basale autofagie bijna niet detecteerbaar was in de gezonde fibroblasten (Fig. 2a, linker paneel).

Wanneer deze cellen werden gekweekt in het verhongeringsmedium en in de afwezigheid van CQ gedurende 2 uur, nam de LC3B-II/GAPDH ratio toe (60 ± 4.8%, p < 0,05) in vergelijking met die van gezonde fibroblasten gekweekt in standaard medium, hetzij in afwezigheid of aanwezigheid van CQ (die, zoals eerder vermeld, identiek was) (Fig. 2a, linker en rechter paneel). Dit gedrag wijst er inderdaad op dat LC3-I daadwerkelijk lipidatie onderging om LC3B-II te vormen, een vroege marker van autofagie activering24,25,26,27,28,29,30. Om de aanwezigheid van deze autofagie activering te testen, kweekten we cellen in een verhongeringsmedium in aanwezigheid van CQ gedurende 2 uur en zij vertoonden een verdere toename van de LC3B-II/GAPDH ratio (94 ± 5,5%, p < 0,001) ten opzichte van gezonde fibroblasten gekweekt in standaard medium (Fig. 2a, linker en rechter paneel).

Daarnaast was het verschil tussen de LC3B-II/GAPDH-verhouding van gezonde fibroblasten gekweekt in verhongeringsmedium in afwezigheid en in aanwezigheid van CQ statistisch significant (p < 0,05, Fig. 2a, linker paneel)

Dus, volgens de standaard interpretatie van het LC3B-II patroon door WB analyse, geeft het algemene resultaat aan dat, in afwezigheid van voedingsstoffen, gezonde fibroblasten de vorming van autofagosomen stimuleren die accumulatie ondergaan in aanwezigheid van CQ. Dit gedrag is verenigbaar met een normale autofagische flux24,25,26,27,28,29,30. Interessant is dat in het geval van RTT fibroblasten gekweekt in standaard medium, terwijl LC3B-I duidelijk immuno-detecteerbaar was, LC3B-II zeer vaag was in de cellen zowel in afwezigheid als in aanwezigheid van CQ (Fig. 2a, linker paneel). Onder hongercondities en in afwezigheid van CQ suggereerde het verschijnen van een vage band die overeenkomt met LC3B-II in RTT-fibroblasten pas na lange blootstelling van het filter dat ten minste een minimale lipidatie van LC3B-I optrad (Fig. 2a, linker paneel). Vandaar dat de LC3B-II/GAPDH verhouding tussen RTT fibroblasten gekweekt in verhongeringsmedium in de afwezigheid van CQ verhoogd was (93 ± 5.5%, p < 0.001) ten opzichte van die van RTT fibroblasten gekweekt in standaard medium in de afwezigheid van CQ (Fig. 2a, rechter paneel).

Het toedienen van CQ aan RTT fibroblasten gekweekt in verhongeringsmedium leidde echter niet tot een verdere toename van de LC3B-II/GAPDH ratio die verhoogd was (95 ± 3,5%, p < 0,001) in vergelijking met cellen gekweekt in standaard medium in de afwezigheid van CQ, maar niet significant verhoogd was ten opzichte van de LC3B-II/GAPDH ratio van RTT fibroblasten gekweekt in verhongeringsmedium in de afwezigheid van CQ (Fig. 2a, linker paneel). Deze bevinding suggereert dat er geen accumulatie van autofagosomen optreedt in RTT cellen en de WB analyse ondersteunde een blokkade, op een bepaald niveau, in de autofagie flux24,25,26,27,28,29,30,31.

Om onze hypothese betreffende een mogelijke defecte autofagische flux verder te versterken, controleerden we de afbraak van twee erkende autofagie reporter substraten in gezonde en RTT fibroblasten verhongerd voor 2 en 4 uur in de afwezigheid van CQ, namelijk: (i) het p62/SQSMT1 eiwit, dat helpt bij het opruimen van poly-geubiquitineerde eiwitaggregaten en dat zelf wordt afgebroken door de lysosomale hydrolasen36; (ii) het 20 S proteasoom, dat snel wordt afgebroken onder verhongerde omstandigheden37,38. Ten opzichte van het basale niveau van de twee proteïnen (d.w.z. tijdstip 0) werd bij gezonde fibroblasten een daling in de tijd waargenomen van de p62/tubuline-verhouding (44 ± 10% na 4 uur, p < 0,001) en van de PSMA-3/GAPDH-verhouding (d.w.z. de α7-subeenheid van het 20 S-proteasoom) (45 ± 3,1% na 2 uur, 11 ± 5,2% na 4 uur, in beide gevallen p < 0,001) (Fig. 2b, bovenste paneel).

In het geval van RTT-fibroblasten was de afname van de p62/tubuline-verhouding in de tijd niet statistisch significant, zelfs niet na 4 uur (89 ± 9%), terwijl de afname van de PSMA3/GAPDH-verhouding na 2 uur (81 ± 4,4%, p < 0,05) en 4 uur (78 ± 5,1%, p < 0,05) significant verschillend was in vergelijking met het basale niveau van het eiwit (d.w.z. tijdstip 0) (Fig. 2b, onderste paneel). Verschillen tussen de gezonde en RTT groepen waren echter alleen statistisch significant in het geval van de p62/tubuline ratio bij 4 uur (p < 0,05), terwijl de PSMA3/GAPDH ratio significant verschillend was tussen de experimentele groepen zowel bij 2 uur (p < 0.05) en 4 uur (p < 0,001) (Fig. 2b, onderste paneel).

Interessant is dat de β-tubuline en GAPDH patronen, gebruikt als interne controles voor de p62 kleuring en de PSMA3 kleuring, respectievelijk, onveranderd waren gedurende 4 uur van verhongering in gezonde fibroblasten. Echter, de intensiteit van de β-tubuline band, evenals die van de GAPDH band, daalde aanzienlijk in RTT fibroblasten verhongerd gedurende 4 uur in vergelijking met wat werd waargenomen op tijdstip 0 of tijdstip 2 uur voor deze cellen (Fig. 2b, bovenste paneel). Deze vermindering was waarschijnlijk te wijten aan het lagere aantal levende RTT fibroblasten geoogst op dit tijdstip (in overeenstemming met de slechte levensvatbaarheid van RTT fibroblasten op 4 uur van verhongering gemeld in Fig. 1a) en niet te wijten aan een down-regulatie van β-tubuline na verloop van tijd. Over het geheel genomen bleek dat RTT fibroblasten deze autofagie reporter substraten niet efficiënt afbraken, wat de hypothese van een defecte autofagie ondersteunt.

Om meer licht te werpen op de kenmerken van deze blokkade, voerden we een immuno-fluorescentie analyse uit met behulp van het LC3B antilichaam. We analyseerden gezonde en RTT fibroblasten gekweekt in standaard medium in de afwezigheid van CQ (rusttoestand) en in het verhongeringsmedium gedurende 2 uur in de aanwezigheid of afwezigheid van 20 µM CQ (Fig. 2c). In overeenstemming met de trage stofwisseling van de primaire cellen, vonden we dat rustende gezonde en RTT fibroblasten een zwakke en diffuse LC3B + kleuring vertoonden met een laag percentage van cellen met meer dan 10 stippen (dat wil zeggen autofagosomen) (8 ± 5% en 1 ± 0,5%, respectievelijk), wat aangeeft dat, door immuno-fluorescentie, de basale autofagie slecht detecteerbaar was in overeenstemming met de gegevens gerapporteerd in Fig. Met betrekking tot cellen gekweekt in standaard medium, het percentage gezonde fibroblasten gekweekt in starvation medium (in de afwezigheid van CQ) met ten minste 10 LC3B + autofagosomen was duidelijk toegenomen (82 ± 10%, p < 0,005), terwijl RTT fibroblasten gekweekt in starvation medium toonde een lichte stijging (17 ± 8%, p < 0,001). In feite was het percentage gezonde fibroblasten gekweekt in starvation medium met ten minste 10 autofagosomen significant hoger dan dat van RTT fibroblasten gekweekt onder dezelfde experimentele conditie (p < 0.005). De autofagosomen waren voornamelijk gelokaliseerd in de perinucleaire regio. In aanwezigheid van CQ werd verder een verwachte diffuse en intense LC3B+ kleuring waargenomen, hoewel in dit geval de diffuse kleuring het niet mogelijk maakte het aantal puntjes nauwkeurig te kwantificeren.

Toediening van CQ was ineffectief in RTT fibroblasten, wat duidelijk wijst op een ernstig verstoorde autofagosoom biogenese (Fig. 2c).

Gezien de relevantie van de vermeende verstoring op autofagosoom biogenese, werd een extra aanpak aangenomen om deze waarneming te bevestigen. Zowel gezonde als RTT fibroblasten, gedurende 2 uur verhongerd in de afwezigheid van CQ, werden gekleurd met een specifieke kleurstof (Cyto-ID) voor het autofagosomale membraan en geanalyseerd door immuno-fluorescentie. Zelfs in dit geval, terwijl in gezonde fibroblasten meerdere autofagosomen daadwerkelijk werden gedetecteerd, werd in RTT fibroblasten slechts een beperkt aantal kleine en geïsoleerde blaasjes waargenomen (Supplementary Fig. S2). Het verschil in het percentage cellen met ten minste 5 Cyto-ID positieve stippen tussen gezonde en RTT fibroblasten was duidelijk significant (80 ± 4% vs 8 ± 6%, respectievelijk, p < 0,001). Daarom leverde de algemene analyse bewijs dat een defecte autofagosoom biogenese optreedt in RTT primaire fibroblasten.

Verouderde RBC’s van RTT patiënten met de R255X MeCP2 mutatie behouden mitochondriën

Wij hebben vervolgens onderzocht of er nog meer tekenen van defecte autofagie ex vivo konden worden waargenomen bij RTT patiënten. Vanwege het feit dat mitochondriën klaring een klassiek autofagie-gebaseerd mechanisme is dat voorkomt in circulerende reticulocyten in de laatste fase van de rijping tot RBC’s32,33,34 hebben we ons onderzoek ook uitgebreid naar ex vivo menselijke RBC’s om na te gaan of mitochondriën worden behouden in deze cellen.

Daarom werden RBC’s van RTT-patiënten (n = 15) en van gezonde donoren (n = 11) geanalyseerd met transmissie elektronen microscopie (TEM). Het TEM onderzoek toonde de aanwezigheid aan van structuren die lijken op mitochondriën (SRM) in bi-concaaf gevormde RBC’s geïsoleerd van de meerderheid van de RTT patiënten (11 van de 15). Onder deze 11 RTT patiënten, vertoonden drie van hen de meest ernstige cohort van symptomen en ook een hoge frequentie van RBC’s (20 ± 4%) (Fig. 3a-h). Zoals verwacht, waren SRM niet detecteerbaar in gezonde RBC’s (Fig. 3I). Verschillen tussen gezonde en RTT-proefpersonen waren statistisch significant (p < 0,0004; Fig. 3, onderste paneel).

Niettemin werd de ernst van de symptomen gebaseerd op de klinische beoordeling en dienovereenkomstig, die drie patiënten met de meest ernstige van de symptomen alle droeg de R255X mutatie van het MeCP2-gen dat wordt geassocieerd met een ernstige prognose39.

Om die reden en omdat wij geen mogelijkheid hadden om een groter aantal patiënten met andere mutaties met een lage of geen frequentie van mitochondria-bevattende RBC’s in te schrijven, hebben wij onze aandacht op de analyse van deze drie patiënten geconcentreerd. TEM analyse documenteerde, in deze drie bovengenoemde gevallen, de aanwezigheid van structuren die leken op intacte of gedeeltelijk verteerde mitochondriën (hetzij elektronendicht of helder), die normaal of halter (langwerpig) van vorm waren, en over het algemeen klein met vage cristae (Fig. 3a-h). In feite bleken de grootte en de algehele vorm van deze structuren in overeenstemming te zijn met die van mitochondriën die in rijpe RBC’s werden behouden in niet-RTT muismodellen van defecte macroautofagie (d.w.z. de Ulk1-/- muizen) of mitofagie (d.w.z. de Nix-/- muizen), gerapporteerd door andere auteurs32,33. Interessant is dat de morfologische veranderingen van mitochondriën die wij waarnamen, zoals de verminderde dimensie, de langgerekte (d.w.z. haltervormige) structuur en, in het bijzonder, de aanwezigheid van vage cristae reeds zijn beschreven in de spier en in het cerebellum van RTT patiënten20,21. Om de mitochondriale identiteit van het SRM te bevestigen, hebben we RBC’s van gezonde donoren en deze RTT patiënten met ernstige symptomen gekleurd met een anti-COX-IV (cytochroom c oxidase) antilichaam. Een statistisch significant aantal RBC’s van de drie RTT patiënten in vergelijking met RBC’s van gezonde proefpersonen (35 ± 5% vs 0,2 ± 0,01%, respectievelijk, p < 0,005) vertoonde een COX-IV+ stippenpatroon dat mitochondriën retentie suggereerde (Fig. 4). Het gemiddelde gehalte aan mitochondriën per cel werd berekend op 1,2 ± 0,2 organellen per RBC bij RTT-patiënten en 0,002 ± 0,0002 bij gezonde proefpersonen (p < 0,005) (Fig. 4). Verschillen in het percentage RBC’s met mitochondriën tussen TEM- en IF-onderzoek kunnen worden toegeschreven aan het feit dat de mogelijkheid om de organellen met TEM te detecteren strikt afhankelijk is van de dunne doorsnede van de cel, die hun aanwezigheid kan belemmeren, terwijl de IF-benadering niet op deze manier beperkt is.

Om deze resultaten verder te bevestigen, voerden we een cytofluorimetrische analyse uit van de RBC’s van zowel gezonde proefpersonen als de drie RTT-patiënten met behulp van een anti-CD71 (transferrinereceptor) en anti-COX-IV antilichamen. De frequentie van CD71-positiviteit, een marker van onrijpe RBC’s, was niet significant verschillend bij gezonde en RTT-patiënten (1,34 ± 0,13% vs 1,03 ± 0,3%; aanvullende Fig. S3). Benadrukt moet worden dat de RTT-patiënten in de studie normale hematologische parameters vertoonden en, hoewel de reticulocytenindex, althans bij een paar proefpersonen, lager was dan die welke bij gezonde proefpersonen werd aangetroffen, waren de algemene verschillen tussen de twee patiëntengroepen niet statistisch significant (Tabel 1). Omgekeerd werd een zeer zwakke COX-IV+ populatie waargenomen in gezonde RBC’s, terwijl een hogere frequentie van COX-IV+ cellen werd waargenomen in RTT RBC’s (0,056 ± 0,004% vs 1,15 ± 0,19%, respectievelijk, p < 0,01). Deze resultaten werden verder bevestigd door het gebruik van Mitotracker Green (MT) kleuring (Supplementary Fig. S3), die een toename van MT + RBC’s in een RTT-patiënt (met de R255X MeCP2 mutatie) versus een gezonde patiënten (0,37% vs 0,16%), vergelijkbaar met die waargenomen met de COX-IV antilichaam eerder beschreven gedocumenteerd.

Om de identiteit van SRM verder te valideren, werd een gelijk aantal RBC’s gelyseerd en geanalyseerd door WB onder denaturerende en reducerende omstandigheden. De filters werden gekleurd met antilichamen tegen sirtuin-3, een de-acetylase dat specifiek tot expressie komt in de mitochondriale matrix40. Sirtuin3 werd in deze benadering als mitochondriale marker gekozen omdat, anders dan bij COX-IV en andere mitochondriale markers, het molecuulgewicht ervan in het elektroforetische patroon niet overlapt met dat van hemoglobine-ketens of hemoglobine-oligomeren. Bij de drie onderzochte RTT-patiënten werd voor elke patiënt een statistisch significante toename van de sirtuin-3/GAPDH-verhouding waargenomen ten opzichte van dezelfde verhouding in lysaten van gezonde RBC’s (p < 0. 001) (aanvullende fig. S4).

Deze drie patiënten, die alle de MeCP2-mutatie droegen (d.w.z. R255X), vertoonden het slechtste fenotype, met een zeer hoog percentage RBC’s dat ten minste 1 mitochondriaal vertoonde. Het zeer beperkte aantal patiënten waarover wij beschikten maakte het echter moeilijk om een statistisch significante conclusie te trekken over de mogelijkheid van een verband tussen de ernst van de ziekte en de mate van mitochondriale retentie in rijpe RBC’s. Een ander punt, dat de moeite van het vermelden waard lijkt, is dat retentie van mitochondriën binnen rijpe RBC’s in de eerder genoemde Ulk1-/- en Nix-/- muismodellen leidde tot bloedarmoede of andere bloedpathologieën die waarschijnlijk werden bepaald door de verhoogde klaring van deze abnormale erytrocyten door miltmacrofagen32,33. Bij de RTT-patiënten die in deze studie werden opgenomen, werd slechts een zeer beperkte en statistisch niet significante daling van de hematologische waarden geregistreerd, en zij leken geen bloedarmoede te hebben of aan andere bloedpathologieën te lijden. De discrepantie tussen onze resultaten en die van de muismodellen zou te wijten kunnen zijn aan het feit dat het uitschakelen van macroautofagie- of mitofagiegenen (d.w.z. Ulk1-/- en Nix-/- muizen, respectievelijk) een zeer hoog percentage mitochondriaal-behoudende RBC’s induceert en de retentie van verschillende organellen binnen RBC’s, hetgeen aanzienlijk ernstiger is in vergelijking met het defect dat bij RTT-patiënten is vastgesteld32,33. Hoewel we een significant hoog aantal mitochondria-behoudende RBC’s hebben waargenomen bij patiënten met de R255X mutatie (Fig. 4), was het aantal organellen in elke cel zeer laag in RTT RBC’s (Fig. 4). Dit zou niet voldoende kunnen zijn om grote morfologische en functionele veranderingen in RBC’s te veroorzaken. Het is vermeldenswaard dat, hoewel de mitochondriale retentie in RBC’s ten minste één factor zou kunnen zijn die de ernstige redox onbalans bepaalt die in RTT RBC’s is waargenomen in combinatie met een aanzienlijke verandering van de energietoestand en het metabolisme (d.w.z, ATP/ADP en NADH/NAD verhouding), meldden recente studies dat de kinetiek van zuurstofbinding aan hemoglobine en zuurstofdiffusie die van gezonde patiënten bijna overlapt16,17,23,41.

De schijnbare discrepantie tussen onze resultaten en die van muismodellen zou ook een verklaring kunnen vinden in het feit dat het RTT syndroom een X-gebonden aandoening is die bijna uitsluitend het vrouwelijk geslacht treft en inactivering van een van de twee exemplaren van het X-chromosoom (XCI) een willekeurig fenomeen is dat zich voordoet tijdens de embryogenese, zoals algemeen gedocumenteerd42,43. In het geval van het RTT-syndroom zou de toevallige XCI dus naar verwachting in somatische cellen een mozaïcisme veroorzaken, waarbij de helft van de cellen het wil-type allel tot expressie brengt, en de andere helft het gemuteerde allel van het MeCP2-gen. Interessant is dat de mogelijkheid dat ten minste enkele MeCP2-mutaties geassocieerd zouden kunnen zijn met een niet-willekeurige XCI in het neuronale weefsel, overeenkomt met de fenotypische variabiliteit van RTT-patiënten (en ook voor de bekende gevallen van RTT), een kenmerk dat uitvoerig is gedocumenteerd42,43. Theoretisch, als de helft van de hematologische progenitors in het beenmerg het X-chromosoom met de MeCP2-mutatie behoudt, zou slechts de helft van de circulerende rijpe RBC’s het pathologische allel dragen, waardoor het aantal circulerende mitochondria-bevattende RBC’s beperkt zou zijn. Niettemin is een verhoogde prevalentie van niet-willekeurige XCI ten gunste van het wil-type allel waargenomen in circulerende leukocyten bij sporadische RTT-patiënten42,43. Wat dit punt betreft, zou het een grote uitdaging zijn om na te gaan of de patiënten die al dan niet een laag aantal mitochondriaal-bevattende RBC’s vertonen, ook een minder significante aantasting van mitofagie of de niet-willekeurige XCI vertonen, die zou leiden tot de positieve selectie van hematologische progenitors die het wil-type MeCP2-allel dragen.

Dus, gezien de complexiteit van de RTT pathologie, verkiezen wij te stellen dat de RTT patiënten, samen met de patiënten die getroffen zijn door het Pearson Syndroom, de eerste gevallen van mitochondriën retentie in menselijke rijpe RBC’s zouden kunnen vertegenwoordigen44.

Aanwijzingen voor defecte autofagie in het cerebellum van Mecp2-nul muizen

Gezien het feit dat RTT een neurologische ontwikkelingsstoornis is, hebben we, om onze resultaten die wijzen in de richting van een systemische defecte autofagie verder te ondersteunen, immuno-histochemische analyses uitgevoerd voor p62 en ubiquitine van het cerebellum (d.w.z. een orgaan waarin mitochondriën worden vastgehouden).een orgaan waarin mitochondriale veranderingen en andere belangrijke histologische afwijkingen zijn waargenomen)21,45 van 9-weken oude wild-type muizen en 5-weken oude (asymptomatische) en 9-weken oude (symptomatische) Mecp2 -/y muizen. Voor elke experimentele conditie, werd het orgaan geïsoleerd van drie dieren geanalyseerd. Vergeleken met wt, vertoonde RTT cerebellum een toename in de intensiteit van p62 (Fig. 5a) en Ub (Fig. 5b) kleuring in alle lagen (d.w.z., korrels, Purkinje en corticale lagen), die lineair was met de leeftijd van de dieren. Bovendien leken de hypergekleurde structuren op intracellulaire aggregaten. Volgens de semikwantitatieve evaluatie van de intensiteit van de kleuring van ofwel p62/SQSTM1 en Ub, waren de verschillen tussen het cerebellum van 5-weken dieren versus gezonde dieren, en van 9-weken dieren versus 5-weken dieren statistisch significant (p < 0.05).

Het histologische verschil tussen asymptomatische en symptomatische dieren suggereert dat de autofagie-verandering bij de geboorte afwezig of zwak zou kunnen zijn, terwijl deze geleidelijk toeneemt tijdens de eerste levensweken (en mogelijk wanneer de MeCP2-activiteit een piek bereikt), hetgeen aanleiding geeft tot de symptomen.