Alai

Het vacuolaire ATPase (V-ATPase) is een multi-subunit ATP gedreven protonpomp die intracellulaire vesicles en extracellulair milieu verzuurt en daardoor betrokken is bij een groot aantal biologische functies . Eerdere overzichten hebben op elegante wijze de structuur en functie van V-ATPase beschreven. Hier bespreken we de recente literatuur met betrekking tot de functie van het V-ATPase en zijn bijdrage aan verschillende celprocessen in de normale fysiologie, met de nadruk op kanker. We presenteren ook in detail de regulatie van Notch en andere signaalwegen door V-ATPase en onthullen een tot nu toe minder bekende functie van V-ATPase in celsignalering.

Subunit isovormen

Structureel is het V-ATPase een roterende nanomotor bestaande uit meerdere subeenheden, elk met meerdere isovormen . De subeenheden zijn gerangschikt in twee domeinen: een perifeer V1-domein, verantwoordelijk voor de ATP-hydrolyse en een integraal membraandomein VO, dat functioneert bij de protonentranslocatie. De structuur van het V-ATPase is in hoge mate geconserveerd in alle eukaryote cellen en is betrokken bij diverse functies in verschillende soorten. Bij zoogdieren bestaat het V1 domein uit acht verschillende subeenheden (A, B, C, D, E, F, G en H) terwijl het VO domein uit zes verschillende subeenheden bestaat (a, c, c’, c”, d, e) . De verschillende vereisten van verzuring in intracellulaire blaasjes en het extracellulaire milieu sturen de V-ATPase functie en regulatie. Om de pompefficiëntie te verlagen of te verhogen regelt V-ATPase de koppeling tussen ATP-hydrolyse en protonenpompen. Dit proces wordt bewerkstelligd door de ‘a’-subeenheid van V-ATPase. Evenzo is de cel- en compartimentspecifieke targeting van V-ATPase ook afhankelijk van de ‘a’-subeenheid-isovormen. VOa is een 100-kDa integraal membraaneiwit met een N-terminale cytosolische staart en 9 transmembraandomeinen. Vier isovormen van de ‘a’-subeenheid (a1, a2, a3 en a4) zijn geïdentificeerd met verschillende vesiculaire en celtype distributie. VOa1 komt tot expressie op de synaptische vesikels en VOa2 komt tot expressie op intracellulaire vesikels zoals golgi en vroege endosomen. VOa3 komt tot expressie op het plasmamembraan van osteoclasten, terwijl VOa4 tot expressie komt op het plasmamembraan van intercalerende niercellen. Verder is de N-terminus van subeenheid ‘a’ een belangrijk motief dat het V1-domein aan het membraan bindt en waarvan ook is gemeld dat het een unieke pH-sensor in lysosomen is. De expressie en isovorm lokalisatie van subunit ‘a’ is van cruciaal belang voor het functioneren van V-ATPase.

Physiologische functie van V-ATPase

Het V-ATPase wordt alom tot expressie gebracht en vervult diverse biologische functies binnen cellen van de meeste weefsels door vesiculaire, luminale en extracellulaire verzuring. Om talrijke cellulaire functies te bereiken, vergemakkelijkt V-ATPase de gelokaliseerde concentratie van protonen in zure vesikels van de endocytische en exocytische routes.

Vesiculaire verzuring

Endosomen en lysosomen

V-ATPase is het best bekend voor zijn rol in de verzuring van intracellulaire vesikels zoals endosomen en lysosomen. Aan het oppervlak van endosomen verzuurt V-ATPase en moduleert daardoor belangrijke cellulaire processen zoals receptor endocytose en vesiculaire trafiek. Verzuring van endosomen door V-ATPase is cruciaal voor endocytische internalisatie van receptor ligand complexen. Na signaalinitiatie, laat de lagere pH in endosomen het ligand vrij en recycleert het naar het plasmamembraan. In lysosomen helpen V-ATPasen de lage pH van 4,5 te handhaven en zijn zij ook belangrijk voor het transport van nieuw gesynthetiseerde zure hydrolasen van Golgi naar lysosomen. Verder zijn fagosomen en autofagosomen in respectievelijk macrofagen en tumorcellen ook afhankelijk van de zure pH die door V-ATPase wordt gehandhaafd voor de activiteit van de afbrekende enzymen in deze compartimenten.

Golgi

De sortering van exocytische en endocytische machinerie begint bij het golgi-complex. Belangrijk is dat de meeste eiwitten glycosylering ondergaan, een cruciale posttranslationele modificatie binnen het golgi-apparaat. Mutaties in de a2 subeenheid van V-ATPase leiden tot cutis laxa, een autosomaal recessief rimpelig huid syndroom waarbij een verminderde glycosylatie van extra cellulaire matrix eiwitten wordt waargenomen. Hoewel V-ATPase genetisch gecorreleerd is met een glycosyleringsdefect, is de precieze relatie tussen golgi-verzuring en eiwitrijping niet onderzocht.

Gespecialiseerde blaasjes

V-ATPase is een belangrijk eiwit dat tot expressie komt in gespecialiseerde compartimenten van specifieke celtypes. Tijdens de neurotransmissie levert V-ATPase de cruciale proton-drijfkracht die nodig is voor de vorming van synaptische vesikels en de daaropvolgende accumulatie van neurotransmitters. In pancreascellen is de van V-ATPase afhankelijke verzuring belangrijk voor de exocytose van insuline. V-ATPase regelt ook de splitsing-fusie balans van vesiculaire systeem door interactie met Soluble NSF Attachment protein Receptor (SNARE) en GTPase .

Luminale verzuring

V-ATPases werden aanvankelijk geïdentificeerd op intracellulaire vesikels, maar het belang van plasmamembraan V-ATPases is enorm gegroeid . In de epitheelcellen van de proximale tubulus van de nier, zorgt de a4 isovorm van V-ATPase voor het zuur-base evenwicht en de verzuring van de urine (systemische acidose) . Evenzo verzuurt het V-ATPase van het plasmamembraan in heldere cellen van de epididymis het luminale compartiment en helpt het bij de rijping en opslag van sperma. In osteoclasten van het bot vertaalt lysosomaal V-ATPase zich naar het plasmamembraan tijdens botresorptie om de lacunae aan te zuren . Plasmalemmal V-ATPase is van cruciaal belang voor de werking van interdentale cellen van het oor, epitheelcellen van de neus en het gezichtsvermogen . Disfunctie van V-ATPase wordt geassocieerd met pathologische aandoeningen zoals nier tubulaire acidose, doofheid, aantasting van de reukzin, en osteoporose Een schematische weergave van de rol van V-ATPase in de vesiculaire en luminale verzuring is weergegeven in Fig. 1.

Rol in kanker

Recentelijk is plasmamembraan V-ATPase uitgebreid bestudeerd in kanker, waar het helpt een alkalisch intracellulair milieu in stand te houden dat gunstig is voor groei en een zuur extracellulair milieu dat gunstig is voor invasie . In tumoren is aangetoond dat de expressie van V-ATPase hoger is naar de voorrand van prolifererende kankercellen van borst-, prostaat-, long-, ovarium-, lever-, pancreas-, melanoom- en slokdarmkankers. Borstkankercellen brengen V-ATPase tot expressie op het plasmamembraan om de extracellulaire ruimte aan te zuren en de kwantitatieve expressie van V-ATPase correleert met invasiviteit en metastatisch potentieel van de cellijn. De exacte bijdrage van V-ATPase aan de groeiende tumor wordt bereikt door zijn invloed op de moleculaire mechanismen/pathways die hieronder worden besproken.

Immunomodulatie

De a2 isovorm van Vacuolair ATPase (VOa2 of a2V) heeft een immunomodulerende rol bij zwangerschap en kanker. Studies naar a2V in de voortplantingsbiologie hebben een tot nu toe onbekende rol voor deze molecule aan het licht gebracht bij de normale rijping en productie van sperma en bij de innesteling van embryo’s. In de tumor micro-omgeving polariseert het N terminale domein van a2V macrofagen naar de tumor-geassocieerde macrofagen (M2 type) en stimuleert het verschillende monocyte subsets via endocytose pathway. Volgend op deze bevindingen, werd verder aangetoond dat a2V deficiëntie in tumorcellen de residente macrofaag populatie in de tumor micro-omgeving verandert en in vivo tumorgroei beïnvloedt. a2V komt tot expressie op de primaire granules van neutrofielen en helpt de pH te behouden in de exocytische route tijdens neutrofiele activatie. Behandeling van humane neutrofielen met recombinant N-terminaal peptide van a2V (a2NTD) bevordert neutrofiele migratie en polarisatie. Samen benadrukken deze studies de immunomodulerende rol van V-ATPase in het opwekken van krachtige immuunreacties.

Warburg effect

Een kenmerk van kanker is het Warburg effect waarbij cellen verschuiven van oxidatieve fosforylering naar aërobe glycolyse . Verschillende studies wijzen op de hypothese dat kankercellen meer afhankelijk zijn van V-ATPase dan van andere pH-regulatoren zoals Na+H+ wisselaars, bicarbonaat transporters en proton-lactaat symporters om de gunstige alkalische intracellulaire pH en zure extracellulaire pH te bereiken. Alkalisatie van cytosol activeert glycolyse terwijl het oxidatieve fosforylatie onderdrukt. Verder worden sommige glycolyse gerelateerde oncogenen zoals Hypoxia Induced Factor (HIF-1) gereguleerd door pH verandering geïnduceerd door V-ATPase.

Zure proteasen

Gevolg van extracellulaire verzuring in tumoren is de activering van zure proteasen, dat zijn enzymen die de extracellulaire matrix klieven tijdens tumor invasie. Deze enzymen behoren tot de klasse van zure proteinases zoals cathepsines , Matrix Metallo Proteinases (MMP) en gelatinases en zijn actief bij een zure pH . Bovendien wordt de activiteit van intracellulaire enzymen zoals γ-secretase, die actief zijn bij een zure pH, ook versterkt door een verhoogde activiteit van V-ATPase in de blaasjes. Dit leidt vervolgens tot ontregeling van oncogene pathways zoals Notch.

Resistentie tegen geneesmiddelen en V-ATPase remmers

De veranderde pH van de tumormicro-omgeving kan de gevoeligheid voor chemotherapeutische geneesmiddelen beïnvloeden. Anthracyclines en alkaloïden hebben een pKa van 7 tot 8 en worden geïnternaliseerd naar het endosomale compartiment. Recente gegevens suggereren dat het gebruik van V-ATPase remmers niet alleen cytosolische pH-veranderingen veroorzaakt die leiden tot celdood, maar ook de opname van geneesmiddelen verbetert, waardoor het een effectieve component wordt van een combinatorische behandeling van kanker . Bij eierstokkanker komt a2V tot expressie aan de voorrand van kankercellen en moduleert het de activiteit van MMP9. Verder draagt a2V bij tot cisplatine gemedieerde geneesmiddelenresistentie in ovariumkanker en selectieve remming van a2V zou kunnen dienen als een efficiënte strategie om chemo-resistente ovariumkanker te behandelen. De V-ATPase remmers bafilomycine en concanamycine behoren tot een klasse van pleomacroliden die zich richten op de VO sector en efficiënt de V-ATPase activiteit remmen. Recentelijk is van Apicularen en archazoliden gemeld dat zij krachtige en specifieke remmers van V-ATPase zijn. Alle beschikbare kleine molecule remmers hebben echter een significante toxiciteit gezien de betrokkenheid van V-ATPase in de normale celfysiologie. Daarom zou de ontwikkeling van specifieke neutraliserende antilichamen tegen de ‘a’ subeenheid isovorm die celspecifieke expressie heeft een efficiënt alternatief kunnen zijn om directe remming van V-ATPase te veroorzaken, terwijl ook indirect multimedicijnresistentie wordt aangepakt met combinatorisch gebruik.

Autofagie

Autofagie is het proces van selectieve afbraak of recycling van cargos die door autofagosomen worden afgeleverd aan lysosomen . Tumorcellen vertonen een wisselende afhankelijkheid van autofagie naarmate zij zich ontwikkelen van primaire tumor tot de sterk uitgezaaide solide tumor . Cellulaire ladingen die gemarkeerd zijn voor degradatie worden door autofagische processen aan de lysosomen afgegeven. De protonpompactiviteit van V-ATPase is verantwoordelijk voor de activering van lysosomale zure hydrolasen die de lading die uit autofagosomen wordt opgenomen afbreken. Hoewel studies wijzen op de noodzaak van een functioneel V-ATPase voor autofagie en de V-ATPase remmer Bafilomycine wordt gebruikt als klassieke remmer van autofagie, is de exacte rol van V-ATPase in membraandynamiek van autofagische flux niet begrepen. Een recente studie meldde dat behandeling met Bafilomycine, dat de activiteit van zowel V-ATPase als de Ca2+ pomp SERCA remt, leidde tot blokkade van de autofagische flux, terwijl V-ATPase deficiënte lysosomen nog steeds in staat waren te fuseren met autofagosomen. Deze resultaten suggereren de betrokkenheid van V-ATPase in de afbraak van autofagische lading in lysososomen dan in autofagische flux en wijzen op de noodzaak van het ontwikkelen van specifieke remmers en gen manipulatie technieken om de exacte rol van V-ATPase in verschillende belangrijke celprocessen te bestuderen.

Signalering

De endolysosomale route is belangrijk voor zowel positieve als negatieve regulering van signaalwegen . Het eerste bekende verslag van betrokkenheid van V-ATPase bij signalering kwam uit een studie die aantoonde dat remming van V-ATPase door Bafilomycine de internalisatie van EGFR beïnvloedde. Sindsdien is V-ATPase in verband gebracht met signaaltransductie geassocieerd met m-TOR (mammalian Target Of Rapamycin), Wnt, TGF-β en Notch signalering.

Notch signalering

De meest bestudeerde signaaltransductie pathways gereguleerd door V-ATPase is Notch. Dit kan worden toegeschreven aan het feit dat Notch signalering afhankelijk is van de endolysosomale route voor zijn activering, onderhoud en degradatie van de belangrijkste mediatoren van de route. V-ATPase handhaaft de pH balans in de cel en speelt een belangrijke rol in endocytose, protease activering en proteïne degradatie. Specifiek, a2V (V-ATPase subunit- VOa2) werd eerder gelokaliseerd in vroege endosomen – de plaats voor receptor endocytose. Na binding aan het ligand neemt de Notch-receptor de endocytische route en wordt gekliefd door proteasen voor activering. Later worden de receptoren afgebroken in het lysosoom. In Drosophila veroorzaken mutaties in Vps25, een onderdeel van de ESCRT-machine die het endosomaal sorteren van signaalreceptoren regelt, accumulatie van de Notch-receptor in endosomen en versterken ze de Notch-signalering. In een studie waarin drosophila-mutaties van Hrs, een andere component van ESCRT, werden geanalyseerd, stapelt Notch zich op in endosomen maar veroorzaakt geen ectopische activering van Notch-signalering . Het verlies van autofagie leidt tot activatie van de Notch signalering in de Drosophila eierstok follikel cellen door verstoring van de Notch afbraak. In tegenstelling tot deze rapporten toonde een onafhankelijke studie aan dat mutaties in Rabconnection-3 de proton-pomp activiteit van V-ATPase verstoren en Notch ophopen in late endosomen na S2 splitsing, waardoor Notch signalering in Drosophila en zoogdiercellen vermindert. Deze bevindingen werden gevolgd door rapporten in Drosophila die verder aangaven dat door de verzuring van de endolysosomale route, V-ATPase nodig is voor de activering van Notch in endosomen evenals voor de degradatie van Notch in lysosomen . Tijdens de ontwikkeling van zoogdieren verminderde expressie van een dominant negatieve subeenheid van V-ATPase in neurale precursors de Notch signalering en depleteerde neurale stamcellen wat leidde tot neuronale differentiatie. Onlangs werd bij studies in astrocyten in het netvlies van Nuc1 gemuteerde ratten aangetoond dat de Notch signalering ontregeld was. De vermindering in Notch signalering was te wijten aan gemuteerd βA3/A1-crystalline, dat de V-ATPase activiteit reguleert, wat resulteert in een verminderde endosomale verzuring en γ-secretase activiteit, waardoor de snelheid van Notch receptor processing wordt beïnvloed. Dit is een interessante bevinding, gezien het feit dat de rol van V-ATPase in het gezichtsvermogen nu in opkomst is. Samen geven deze bevindingen aan dat de regulatie van Notch signalering door V-ATPase zowel positieve als negatieve gevolgen kan hebben, afhankelijk van de cellulaire lokalisatie van de V-ATPase activiteit (endosomen vs lysosomen) en de afhankelijkheid van Notch receptor verwerking op de endosomale route. Hoewel de wisselwerking tussen V-ATPase en Notch werd onderzocht in de context van V-ATPase afhankelijke endolysosomale verzuring die de Notch signalering beïnvloedt, suggereert een recent rapport dat de regulering ook omgekeerd zou kunnen zijn. Meer bepaald suggereren de auteurs dat Presinilin1 (PS1), een component van het γ-secretase enzymencomplex dat verantwoordelijk is voor de splitsing van Notch receptor en β-amyloid peptide, fysiek interageert met de VOa1 isovorm van V-ATPase en deze van het endoplasmatisch reticulum naar de lysosomen stuurt. Onze studies hebben aangetoond dat V-ATPase de Notch signalering in borstkanker en melkklier ontwikkeling reguleert. a2V komt tot expressie op het oppervlak van prolifererende borstklier epitheelcellen en Triple Negative Breast Cancer (TNBC) cellen, wat aangeeft dat het een rol speelt in cel proliferatie tijdens de normale ontwikkeling en ziekte. In TNBC versterkt remming van a2V de Notch signalering door het blokkeren van lysosomale en autofagische degradatie van de Notch receptor. Verlies van a2V in de borstklier van de muis leidt tot abnormale Notch activatie en belemmert de ductale morfogenese, wat lactatiedefecten veroorzaakt. Notch signalering wordt geactiveerd tijdens vroeggeboorte geïnduceerd door infectie met PGN + poly (I:C), wat resulteert in upregulatie van pro-inflammatoire reacties, en de remming ervan verbetert de in-utero overleving van levende foetussen. Verder in premature arbeid geïnduceerd door ontstekingsreactie op LPS injectie, werd up-regulering van Notch-gerelateerde ontsteking en down-regulering van angiogenese factoren waargenomen. In zowel infectie en inflammatoire premature arbeid modellen, waren we in staat om het fenotype te redden door de behandeling met γ-secretase remmers (GSI) . Dit effent de weg voor een belangrijke toekomstige richting, vooral omdat GSI een efficiënte remmer is van Notch Signaling en momenteel in klinische tests voor verschillende kankers. Hieruit blijkt dat de V-ATPase en Notch wisselwerking belangrijk is tijdens de normale ontwikkeling en bij ziekten zoals Alzheimers en verschillende kankers.

Wnt signalering

De Wnt signaleringsroute speelt een belangrijke rol in cel- en weefselonderhoud, polariteit en differentiatie. Bij de mens is ontregeling van de Wnt signalering betrokken bij kanker. Een klassiek voorbeeld van ontregelde Wnt signalering is colorectale kanker, waarbij het verlies van Adenomateuze Polyposis Coli (APC), een negatieve regulator van Wnt signalering, tumorigenese in gang zet. Tijdens de signalering werken Wnt-liganden in op doelcellen door binding aan Frizzed, Fz en LRP (lage dichtheid-lipoproteïne), een receptorcomplex op de celoppervlakte dat leidt tot ontmanteling van Glycogeensynthase Kinas (GSK-3) en vervolgens het vrijkomen van β-catenine. β-catenine is de belangrijkste downstream mediator van de Wnt pathway, die Wnt doelwit oncogenen genen zoals c myc en cyclinD1 activeert. De (P) RR, Pro Renin Receptor ook ATP6ap2 genoemd, fungeert als een adaptor molecuul tussen V-ATPase en het Wnt receptor complex LRP 5/6 . In Xenopus en Drosophila, is aangetoond dat V-ATPase interageert met LRP 5/6 receptor complex en zowel genetische knockdown en farmacologische remming van V-ATPase interfereren met signaaltransductie en aanzienlijk verminderen cellulaire respons op Wnt signalering . Bovendien, V-ATPase reguleert indirect Wnt signalering mediator β-catenine en Notch mediator NICD is aangetoond door autofagie.

TGF-β signalering

Mutaties in het a2V gen veroorzaken Autosomaal recessief Cutis Laxa (ACL) syndroom waarbij patiënten zich presenteren met een verminderde hoeveelheid extra cellulaire matrix eiwitten zoals Collageen wat resulteert in rimpelige huid fenotype. Deze bevindingen worden ondersteund door een mechanistisch onderzoek naar de mutaties die verantwoordelijk zijn voor cutis laxa bij de mens, waarbij werd vastgesteld dat de a2P405L-mutatie onstabiel is en defect is in de golgi-handel in vergelijking met het wildtype. Verder wijzen rapporten op een glycosyleringsdefect in ACL resulterend in verhoogde bevordert transformerende groeifactor-beta (TGF-β) signalering bij deze patiënten met a2V mutaties . V-ATPase bevordert TGF-β geïnduceerde epitheliale-mesenchymale transitie van rat proximale tubulaire epitheelcellen. Naast het effect op Notch signalering, activeerde a2V remming de Wnt route in TNBC en de TGF-β route in mammaire epitheelcellen. Dit suggereert dat de rol van a2V in het moduleren van signaal mediatoren niet exclusief is voor Notch. Verder vertoonden deze muizen ook een vermindering van het totale collageen als gevolg van verminderde glycosylering.

mTOR signalering

In mTOR signalering, voelen het Serine threonine kinase mTOR en andere componenten van het mTOR complex 1 (mTORC1) aminozuur beschikbaarheid cellulaire stress, en moduleren groei.Bij aminozuurstimulatie activeert V-ATPase de Guanine Exchange Factor (GEF) activiteit van Ragulator ten opzichte van RagA, die op zijn beurt RagC GTP hydrolyse bevordert. De GTP-gebonden RagA en GDP-geladen RagC rekruteren samen mTORC1 naar het lysosomale oppervlak. Geactiveerde mTORC1 reageert op groeifactorsignalen en regelt de omschakeling van celdood naar proliferatie. Een recent rapport suggereerde de betrokkenheid van osteoclast protonpomp regulator Atp6v1c1 in het versterken van borstkanker groei door het activeren van de mTORC1-route en botmetastase door het verhogen van V-ATPase activiteit .