Alai

1Introduction

Bloedingen compliceren vaak het klinische beloop van cirrose. De meest voorkomende en potentieel levensbedreigende plaats van bloeding is het maagdarmkanaal. Dit kan het gevolg zijn van een verscheidenheid van laesies, waaronder gastro-oesofageale varices en portale hypertensieve gastropathie of andere laesies die bij de algemene bevolking voorkomen zoals oesofagitis, Mallory-Weiss scheuren en peptische ulcusziekte. Het sterftecijfer als gevolg van gastro-intestinale bloedingen is hoog; tot 30% van de initiële varicesbloedingen zijn fataal. Bij patiënten met cirrose kunnen ook cutane of mucosa-gerelateerde bloedingen optreden, zoals bloeduitstortingen, purpura, epistaxis, gingivale bloedingen, menorragie en bloedingen bij invasieve ingrepen zoals leverbiopsie. Lange tijd werd gedacht dat dit verhoogde bloedingsrisico verband hield met verworven hemostatische stoornissen bij cirrotische patiënten. In feite synthetiseert de lever bijna alle stollingsfactoren, met uitzondering van factor VIII. Men dacht dat de verminderde synthese van stollingsfactoren verantwoordelijk was voor abnormale conventionele laboratoriumtests die de globale stollingsactivering aantonen, zoals de protrombinetijd (PT) en de geactiveerde partiële tromboplastine (aPTT). Er is echter opgemerkt dat ondanks de verlengde PT en aPTT bij veel cirrotische patiënten geen bloedingen optreden, zelfs niet na een leverbiopsie of andere potentieel hemorragische procedures. Bovendien doen zich bij sommige cirrotische patiënten trombo-embolische voorvallen voor ondanks abnormale conventionele laboratoriumtests. Tot nu toe hebben slechts enkele studies de invloed van stollingsstoornissen op het bloedingsrisico bij cirrotische patiënten onderzocht.

Deze studie heeft tot doel de relatie tussen hemostatische stoornissen en het bloedingsrisico bij cirrotische patiënten te beoordelen door de hemostatische balans te onderzoeken bij cirrotische patiënten met en zonder bloedingen in vergelijking met controles.

2Materialen en methoden

De studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki van de World Medical Association en werd goedgekeurd door de lokale ethische commissie. Alle patiënten gaven hun geïnformeerde toestemming vóór inclusie in de studie.

2.1Patiëntenpopulatie en studieopzet

Eenenenenenenenveertig cirrotische patiënten vormden de groep gevallen en 50 gezonde controles gematcht voor leeftijd en geslacht werden opgenomen in een cross-sectionele studie. Gegevens over bloedingen, kenmerken van cirrose en medicatie werden uit medische dossiers gehaald. De ernst van de cirrose werd geschat aan de hand van de Child Turcotte Pugh score. Patiënten die binnen 2 maanden voor of na inclusie een bloeding hadden, werden geïdentificeerd. Voor elk van deze patiënten werden de plaats en de ernst van de bloeding bepaald. Patiënten die een bloeding hadden met deglobulisatie (daling van het hemoglobinegehalte met 2g/dl of meer) waarvoor al dan niet een transfusie nodig was, werden beschouwd als patiënten met een ernstige bloeding. Exclusiecriteria waren hepatocellulair carcinoom of een andere maligniteit, bacteriële infectie, chronische ontstekingsziekte, nefrotisch syndroom, nierfalen, bekende erfelijke stollingsafwijkingen en gebruik van anticoagulantia of anti-plaatjesmedicijnen. De patiënten werden in twee groepen verdeeld: (H+) groep omvatte patiënten die bloedingsepisoden ervoeren en (H-) groep omvatte patiënten die dat niet deden.

2.2Bloedafname

Bloedmonster werd afgenomen via venapunctie in plastic buisjes met 3,2% natriumcitraat als antistollingsmiddel in de verhouding van één tot negen delen antistollingsmiddel/bloed. Slecht bloedplaatjesplasma (PPP) werd verkregen na een dubbele centrifugatie van het bloed bij 2500×g gedurende 15min. PPP werd gealiquoteerd en bij -80°C ingevroren totdat stollingstests werden uitgevoerd.

2.3Laboratoriumtests2.3.1Conventionele laboratoriumtests

De protrombinetijd (PT) en geactiveerde partiële tromboplastinetijd (aPTT) werden respectievelijk gemeten met de humane tromboplastine (neoplastine, STAGO) en het geautomatiseerde APTT-reagens (APTT, STAGO). Het fibrinogeen werd gemeten met (STA fibrinogeen, STAGO).

2.3.2Pro- en anticoagulantiefactoren

De pro- en anticoagulantiefactoractiviteiten werden als functionele activiteiten bepaald met STAGO-reagentia: Factor VIII en XII activiteiten werden gemeten met standaard aPTT gebaseerde stollingstests (respectievelijk met DEFICIENT VIII en IMMUNODEF XII). Factor VII-, factor V- en factor II-activiteiten werden gemeten met op PT gebaseerde stollingstests (respectievelijk met DEFICIENT VII, DEFICIENT V, IMMUNODEF II). De proteïne C (PC) en proteïne S (PS) activiteiten werden gemeten met behulp van stollingstests (STACLOT PC en STACLOT PS). De activiteit van antitrombine (AT) werd bepaald met behulp van chromogene assay (STACHROM AT). Alle tests werden uitgevoerd op STA COMPACT MAX (STAGO; Asnières Frankrijk). Het tellen van de bloedplaatjes werd uitgevoerd op de hematologieanalysator (SYSMEX XT 2000i; Cobe, Japan).

2.3.3Thrombinegeneratie

De trombinegeneratie (TG) werd gemeten met behulp van de geijkte geautomatiseerde trombinemethode (trombiniscoop-Thermosysteem). De coagulatie werd op gang gebracht in de PPP na toevoeging van weefselfactor 1pmol/L en fosfolipiden (PPP reagens laag-STAGO) in twee stappen: in afwezigheid dan in aanwezigheid van proteïne C activator (PROTAC; STACLOT PC STAGO). De registratie van de in de loop van de tijd gegenereerde trombine werd uitgevoerd met een fluorogeen substraat (FLUCAT, STAGO). De TG werd uitgedrukt als endogeen trombine potentieel (ETP) in nmol×min.

2.3.4Hemostatisch evenwicht

Hemostatisch evenwicht werd beoordeeld door middel van procoagulant/anticoagulant factor verhoudingen en ETP verhouding met/zonder PC activator.

2.4Statistische analyse

Statistical Package for Social Science (SPSS) software versie 21.0 (IBM Corp., Armonk. New York, USA) werd gebruikt voor analyse van de gegevens. De gegevens werden samengevat als gemiddelde en percentage. Studiegroepen werden vergeleken met behulp van de χ2 test voor kwalitatieve variabelen. Student’s t en ANOVA tests werden gebruikt voor de analyse van parametrische gegevens. Mann-Whitney U- en Kruskal-Wallis H-tests werden gebruikt voor de analyse van niet-parametrische gegevens. p-waarde kleiner dan of gelijk aan 0,05 werd als significant beschouwd.

3Resultaten

De gemiddelde leeftijd van de patiënten bij inclusie was 57,8 jaar (16-91 jaar). De gemiddelde leeftijd bij diagnose van cirrose was 55 jaar (6-88 jaar). Er waren 24 mannen en 27 vrouwen. De belangrijkste etiologie van cirrose was virale hepatitis (64,7%). De patiënten werden ingedeeld volgens de Child-Pugh score als klasse A bij 14 patiënten (27,5%), klasse B bij 22 patiënten (43,2%), en klasse C bij 15 patiënten (29,3%). (H+) groep omvatte 9 patiënten (17,6%). Bloedingen waren varicesale bloedingen (n=6), gastro-intestinale bloedingen secundair aan maag- (n=1) en duodenale (n=1) ulcera en gingivorrhagia (n=1). De bloedingen werden als licht tot matig beoordeeld bij 6 patiënten en als ernstig bij 3 andere. Beide patiëntengroepen waren vergelijkbaar wat betreft leeftijd, geslacht en Child-Pugh score.

Voor de controles traden er uiteraard geen bloedingen op binnen 2 maanden voor of na inclusie.

3.1Conventionele laboratoriumtesten

Er was geen significant verschil in gemiddelde niveaus van PT, aPTT en fibrinogeen tussen (H+) en (H-) groepen. Het aantal bloedplaatjes was significant lager bij (H+) patiënten dan bij (H-) patiënten (p=0,01) (tabel 1).

3.2Procoagulerende en anticoagulerende factoren

De gemiddelde niveaus van pro- en anticoagulerende factoren waren significant lager bij cirrotische patiënten die bloedingen hadden doorgemaakt (H+) dan bij controles. Factor VIII was echter significant hoger bij cirrotische patiënten dan bij controles (166% vs. 94,5%; p=0,045). Er was geen significant verschil tussen de (H+) en (H-) groepen wat betreft de niveaus van pro- en anticoagulantiefactoren (tabel 2).

3.3Thrombine generatie

Er was geen significant verschil tussen (H+) patiënten en controles wat betreft het gemiddelde ETP-niveau zonder PC-activator (respectievelijk 716,1 vs. 811nmol×min; p=0,5). In aanwezigheid van PC-activator was ETP verrassend hoger bij (H+) patiënten dan bij controles (725 vs. 387nmol×min; p=0,05).

Echter was er geen significant verschil tussen de patiëntengroepen wat betreft ETP met en zonder PC-activator.

3.4Hemostatisch evenwicht3.4.1De verhoudingen tussen pro- en anticoagulantiefactoren

Vergeleken met controles waren VIII/anticoagulantiefactoren (VIII/PC, VIII/PS, VIII/AT), VII/PC en XII/PC significant hoger bij (H+) patiënten. Alle andere verhoudingen bleven ongeveer op hetzelfde niveau.

Er werd geen significant verschil in alle verhoudingen vastgesteld tussen patiënten die bloedingen hadden (H+) en patiënten die geen bloedingen hadden (H-) (tabel 3).

3.4.2ETP-ratio

ETP-ratio met/zonder PC-activator was significant hoger bij (H+) patiënten dan bij controles (0.97 vs. 0,51; p=0,017) (Fig. 1A).

Echter was er geen significant verschil tussen de patiëntengroepen wat de ETP-verhouding betreft (fig. 1B).

4Discussie

De huidige studie toonde aan dat de hemostatische balans, beoordeeld door verhoudingen van pro- tot anticoagulerende factoren en ETP ratio met/zonder PC activator, in het voordeel was van een hypercoagulabiliteitstoestand, zelfs bij cirrotische patiënten die bloedingen hadden doorgemaakt. Bij vergelijking van beide patiëntengroepen genereerden cirrotische patiënten die bloedingen hadden gehad ongeveer evenveel trombine als degenen die geen bloedingen hadden gehad. Voor zover wij weten, waren er geen gepubliceerde studies die de invloed van trombine-generatie assay bij het beoordelen van het bloedingsrisico bij cirrose onderzochten.

De belangrijkste beperking van deze studie is echter het kleine aantal cirrotische patiënten die bloedingen ervoeren.

De bloedingsneiging bij cirrotische patiënten, namelijk bij die met gevorderde leverziekte, werd ondersteund door vele klinische observaties . De meest relevante hemorragische gebeurtenissen bij dergelijke patiënten zijn het gevolg van slokdarmvaricesruptuur en portale hypertensieve gastropathie . Bloedingen kunnen ook optreden als gevolg van dezelfde laesies die in de algemene bevolking worden gezien, zoals een maagzweer, epistaxis, gingivorrhagia, blauwe plekken of als gevolg van invasieve procedures. In onze studie was een varicesbloeding de meest voorkomende plaats van bloeding, aangezien deze bij tweederde van de patiënten voorkwam.

Historisch werden hemostatische afwijkingen ten gevolge van leverfalen, zoals een verlengde PT en aPTT, verondersteld een weerspiegeling te zijn van bloedingsstoornissen die frequent voorkomen bij cirrotische patiënten. Daarom werd de PT vaak gecorrigeerd door middel van vers ingevroren plasma voorafgaand aan een leverbiopsie of andere potentieel hemorragische procedures.

In de huidige studie was er geen significant verschil tussen patiënten die bloedingen hadden ervaren en degenen die dat niet hadden wat betreft de gemiddelde PT- en aPTT-waarden. Onze resultaten zijn in overeenstemming met die van vele artikelen die suggereren dat deze conventionele tests niet zo goed zijn in het voorspellen van bloedingen bij verworven in vergelijking met congenitale coagulopathieën. Segal et al. vonden zelfs geen bewijs om te concluderen dat een verlengde PT bloedingen kan voorspellen tijdens invasieve diagnostische procedures. Bovendien merkte Tripodi op dat, paradoxaal genoeg, cirrotische patiënten met een bijna normale PT konden bloeden terwijl patiënten met een relatief abnormale PT dit gewoonlijk niet deden. Het gebrek aan voorspellend vermogen van de PT voor bloedingen kan het best worden verklaard door het feit dat alleen de procoagulerende en niet de anticoagulerende activiteit (PC, PS, AT) door de PT wordt weergegeven. Aangezien zowel de procoagulans- als de anticoagulansfactoren bij cirrose verlaagd zijn, zouden PT en aPTT niet het evenwicht tussen pro- en anticoagulansfactoren kunnen weergeven.

Wat het aantal bloedplaatjes betreft dat in de huidige studie is beoordeeld, hadden patiënten die een bloeding hadden gehad significant lagere niveaus dan patiënten die geen bloeding hadden gehad (p=0,01). Onze resultaten kwamen overeen met die van El Bokl e.a. waar het aantal bloedplaatjes significant lager bleek te zijn bij cirrotische patiënten die hematemesis en melena hadden doorgemaakt dan bij patiënten die geen bloedingen hadden doorgemaakt (p

0,0001) . Deze bevindingen zouden kunnen worden ondersteund door de meervoudige kwantitatieve en kwalitatieve veranderingen die van invloed kunnen zijn op de bloedplaatjes bij patiënten met een chronische leverziekte. Verhoogde sekwestratie van bloedplaatjes in de milt veroorzaakt door portale hypertensie en verminderde trombopoëtine productie door de zieke lever zijn de belangrijkste mechanismen van trombocytopenie bij cirrotische patiënten. Naast trombocytopenie is ook een gebrekkige functie van de bloedplaatjes vastgesteld, aangezien de adhesie, de aggregatie en vervolgens het vermogen om trombine te produceren bij cirrotische patiënten verstoord zijn. Deze bevindingen werden ondersteund door verscheidene klinische waarnemingen waaruit bleek dat een trombocytentelling van 3 geassocieerd was met een significant verhoogd risico op bloedingen in verband met invasieve procedures. Het aantal bloedplaatjes lijkt dus betrouwbaarder te zijn dan andere conventionele hemostatische tests (TP of aPTT) bij het beoordelen van het bloedingsrisico. Hoewel er geen prospectieve studies zijn die de drempelwaarde van het aantal bloedplaatjes voor profylactische transfusie bij cirrotische patiënten bepalen, bevelen de AASLD-richtlijnen voor leverbiopsie aan een bloedplaatjestransfusie te overwegen voorafgaand aan de leverbiopsie bij een aantal bloedplaatjes van 3 (klasse I niveau C) .

In de huidige studie was er geen verschil tussen (H+) en (H-) patiënten met betrekking tot het plasma fibrinogeengehalte. Siddiqui et al. vonden echter een significante correlatie voor een verlaagde fibrinogeenspiegel met gastro-intestinale bloedingen bij cirrotische patiënten (RR=1,47; 95% CI, 0,64-3,35) .

In feite wordt verondersteld dat hypofibrinogenemie, die vaak wordt gezien bij patiënten met gevorderde cirrose, het bloedingsrisico verhoogt, aangezien fibrinogeen zowel dient als een precursor van fibrine en als een mediator van bloedplaatjesaggregatie . Het bloedingsrisico wordt bijzonder hoog geacht wanneer de fibrinogeenspiegel lager is dan 1g/L . In de huidige studie kunnen onze resultaten met betrekking tot het fibrinogeenniveau worden verklaard door het feit dat de meerderheid van de patiënten een stabiele leverziekte had.

In de huidige studie waren procoagulantiefactoren (II, V, VII en XII) en anti-coagulantiefactoren (PC, PS en AT) significant lager bij cirrotische patiënten die een bloeding hadden dan bij controles. FVIII was echter duidelijk verhoogd in de eerste groep. Verscheidene eerdere studies kwamen overeen met onze resultaten, ongeacht de bloedings- of trombotische status van cirrotische patiënten.

Bij vergelijking van (H+) en (H-) patiënten werd geen verschil in niveaus van pro- en anticoagulantiefactoren vastgesteld. In overeenstemming met onze resultaten toonden El Bokl et al. geen significant verschil aan tussen beide patiëntengroepen wat het FVIII niveau betreft. Echter, paradoxaal genoeg, was PC significant lager bij cirrotische patiënten die bloedingen hadden ervaren in vergelijking met degenen die dat niet hadden (36,4% vs. 65%; p=0,018) . Deze bevindingen suggereren dat bloedingen bij cirrotische patiënten geen verband houden met de plasmaniveaus van stollingsfactoren. Gerandomiseerde gecontroleerde onderzoeken leveren inderdaad bewijs voor de effectiviteit van recombinant geactiveerde factor VII-infusie bij het onder controle houden van bloedingen uit varices of tijdens hepatectomie.

In de huidige studie, met betrekking tot hemostatische balans, waren VIII/anticoagulant factoren (VIII/PC; VIII/PS en VIII/AT), VII/PC en XII/PC significant hoger bij (H+) patiënten dan bij controles. Alle andere verhoudingen waren ruwweg op hetzelfde niveau tussen (H+) patiënten en controles. Evenzo toonden eerdere studies aan dat de ratio’s pro- tot anticoagulantiefactoren (II/PC, V/PC, VIII/PC en VIII/AT) significant hoger waren bij cirrotische patiënten dan bij controles.

In de huidige studie lagen alle ratio’s van pro- tot anticoagulantiefactoren tussen beide patiëntengroepen op hetzelfde niveau. El Bokl et al. toonden echter paradoxaal genoeg een significant hoger niveau van FVIII/PC aan bij cirrotische patiënten die bloedingsincidenten hadden gehad dan bij patiënten die geen bloedingsincidenten hadden gehad.

Wat de trombinevorming betreft die in de huidige studie werd beoordeeld, was er geen verschil tussen de controle- en de patiëntengroepen.

Na activering van PC was de ETP-ratio significant hoger bij (H+) patiënten dan bij controles (p=0,017). Deze bevindingen kwamen overeen met die van Tripodi et al. die een resistentie tegen het antistollingseffect van geactiveerd PC bij cirrotische patiënten suggereerden. Deze “hypercoagulabiliteitsstatus” zou bij cirrotische patiënten zelfs een beschermend effect tegen bloedingen kunnen hebben. In dezelfde context bereikte de ETP ratio geen statistische significantie tussen beide patiëntengroepen. Deze bevinding vormt een extra argument tegen de traditionele opvatting dat stollingsstoornissen die bij cirrotische patiënten worden vastgesteld, voorspellers van bloedingen zijn.

Het lijkt erop dat gastro-intestinale bloedingen kunnen worden verklaard door hemodynamische veranderingen die verband houden met portale hypertensie. Gevorderde leverziekte, grote varices, variceale wandspanning en de aanwezigheid van rode wale markering zijn gerapporteerd als risicofactoren voor variceale bloedingen bij cirrotische patiënten. Endotheeldisfuncties, bacteriële infecties en nierinsufficiëntie kunnen ook bijdragen tot gastro-intestinale bloedingen. Andere bloedingen zoals epistaxis, gingivorrhagia en blauwe plekken kunnen worden verklaard door trombocytopenie, die op haar beurt voornamelijk te wijten is aan portale hypertensie.

Alvorens af te ronden is het vermeldenswaard dat bij patiënten met chronische leverziekte, vitamine K deficiëntie een van de belangrijkste factoren is die betrokken zijn bij de hierboven beschreven stollingsstoornissen. Een tekort aan vitamine K kan namelijk niet alleen leiden tot een verminderde synthese van stollingsfactoren, maar ook tot de productie van ondergecarboxyleerde precursors van deze eiwitten die functioneel inactief zijn. Deze proteïnen staan bekend als proteïnen geïnduceerd door vitamine K afwezigheid (PIVKA) zoals ondergecarboxyleerd protrombine (PIVK-II) waarvan is aangetoond dat het wordt afgescheiden door hepatocellulaire carcinoma cellen van cirrotische patiënten. Hoewel in sommige eerdere studies is gerapporteerd dat de toediening van vitamine K bij dergelijke patiënten de stollingsstoornissen niet verbeterde, zijn de gegevens over de gevoeligheid van ondergecarboxyleerd protrombine nog steeds tegenstrijdig. Vandaar dat we zouden kunnen speculeren dat het waarschijnlijk verstandig zou zijn om geen vitamine K toe te dienen bij cirrotische patiënten om een significante daling van het niveau van ondergecarboxyleerd protrombine te voorkomen, dat een rol zou kunnen spelen bij de vroege diagnose van hepatocellulair carcinoom bij dergelijke patiënten .

Concluderend kunnen onze bevindingen, hoewel ze voorzichtig geïnterpreteerd moeten worden vanwege het kleine aantal (H+) patiënten, het concept ondersteunen dat abnormale conventionele laboratoriumtesten zoals verlengde PT en aPTT niet correleren met het bloedingsrisico bij cirrotische patiënten. Het aantal bloedplaatjes lijkt echter een betere voorspeller van bloedingen te zijn dan PT en aPTT. De hemostatische balans is verschoven in de richting van een hypercoagulabiliteitstoestand, zelfs bij cirrotische patiënten die bloedingen hebben ondervonden. Wij vermoeden dat gastro-intestinale bloedingen bij dergelijke patiënten voornamelijk hemodynamisch zijn als gevolg van portale hypertensie. Verdere studies moeten rekening houden met het fibrinolytische systeem. In feite is hyperfibrinolyse in sommige gevallen gerapporteerd als een oorzaak van bloedingen bij cirrotische patiënten, hoewel dit concept controversieel blijft.AfkortingenETP

Eendogene trombine potentiaal

PC

eiwit C

PT

trombine tijd

aPTT

geactiveerde partiële tromboplastine

PPP

poor platelet plasma

PS

eiwit S

AT

antithrombine

TG

trombinegeneratie

overdracht van auteursrecht

Als tegenprestatie voor het feit dat de Fundación Clínica Médica Sur (FCMS) actie onderneemt om mijn inzending te beoordelen en te bewerken, dragen de ondergetekende auteurs, gezamenlijk en hoofdelijk, hierbij alle rechten, aanspraken en belangen hierin, inclusief alle auteursrechten in alle vormen en media nu of later bekend, over aan de FCMS. De auteurs behouden het niet-exclusieve recht om het artikel geheel of gedeeltelijk en op niet-concurrerende wijze te gebruiken in toekomstige werken van henzelf, mits het auteursrecht op gepaste wijze wordt gecrediteerd aan de Stichting. Indien de FCMS voornoemde inzending niet publiceert, stemt de FCMS ermee in haar rechten daarop vrij te geven (NB: materiaal dat door werknemers van de federale overheid in hun officiële functie is opgesteld, is mogelijk niet auteursrechtelijk beschermd). Er wordt geen garantie gegeven dat het artikel zal worden gepubliceerd.

Auteursverantwoordelijkheid

Ik, de ondergetekende auteur, verklaar dat ik voldoende heb deelgenomen aan de intellectuele inhoud, de analyse van gegevens, indien van toepassing, en het schrijven van het artikel, om er de publieke verantwoordelijkheid voor te nemen. Ik heb de definitieve versie van het artikel beoordeeld, ben van mening dat het een geldig werk is, en keur het goed voor publicatie. Als auteur van dit artikel verklaar ik dat niets van het materiaal in het manuscript eerder is gepubliceerd, is opgenomen in een ander manuscript, of momenteel in overweging is voor publicatie elders. Ik verklaar ook dat het artikel niet is geaccepteerd voor publicatie elders, noch heb ik enig recht of belang in het artikel overgedragen aan een derde partij.

Financiële openbaarmaking

Ik, de ondergetekende auteur, verklaar dat ik geen commerciële associaties heb (bijv. adviesbureaus, aandelenbezit, aandelenbelangen, patent-licentie regelingen) die een belangenconflict zouden kunnen opleveren in verband met het ingediende artikel. Dit werk ontving geen specifieke subsidie van financieringsinstanties in de publieke, commerciële of not-for-profit sectoren.

Institutional Review Board/Animal Care Committee Approval

Ik, de ondergetekende auteur, verklaar dat mijn instelling het protocol heeft goedgekeurd voor elk onderzoek waarbij mensen of dieren betrokken zijn en dat alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met ethische en humane principes van onderzoek.

Author contributions

Asma labidi, Hela Baccouche, Monia Fekih en Neila BenRomdhane ontwierpen de studie.

Hela Baccouche voerde biologische tests uit.

Asma Labidi en Hela Baccouche analyseerden de gegevens.

Asma labidi schreef het manuscript met de steun van Hela Baccouche.

Alle auteurs bespraken de resultaten en droegen bij aan het uiteindelijke manuscript.

Conflict of interest

None.

Informed consent

Alle patiënten gaven hun geïnformeerde toestemming voor publicatie van de casusgegevens.