Alai

Abstract

Rheumatoïde artritis (RA) is een auto-immuunziekte. Wespengif (WV), dat beschouwd wordt als een traditioneel volksmedicijn in de Jingpo nationaliteit in Yunnan, China, verlicht reumatoïde artritis. De huidige studie had tot doel het effect van wespengif op het verbeteren van reumatoïde artritissymptomen bij experimentele ratten te onderzoeken. We stelden een model op van type II collageen- (CII-) geïnduceerde artritis (CIA) in SD ratten en onderzochten de remming van ontsteking en auto-immuunrespons. De anti-artritische effecten van WV werden geëvalueerd aan de hand van de pootzwelling, en de histopathologische score en histopathologische veranderingen van de aangetaste poot werden beoordeeld. De ontstekingsremmende effecten werden beoordeeld aan de hand van het niveau van IL-6, TNF-α, IL-1β, en het aantal ontstekingscellen in het perifere bloed. De verandering van de T-cel subset ratio in de milt van de ratten werd gedetecteerd door middel van flowcytometrie, en tegelijkertijd werden de viscera index en immuun serum globuline niveaus geëvalueerd. De resultaten suggereerden dat verschillende doses WV (0,125, 0,25, en 0,5 mg/kg) de zwelling van de poot en de artritisscore bij CIA-ratten aanzienlijk verminderden ten opzichte van de onbehandelde controle (). WV (0,25 en 0,5 mg/kg) verlichtte de synoviale weefselletsels van de enkelgewrichten en de histopathologische scores van synoviocytaire hyperplasie en inflammatoire celinfiltratie in vergelijking met de voertuiggroep (). Wat betreft immunologische regulatie, 0,5 mg / kg WV verlaagde de immuun serum globuline niveaus (), en we vonden verder dat WV (0,5 mg / kg) de immuunrespons van Th-cellen onderdrukte, terwijl het de functies van Tc-cellen en Treg-cellen in miltcellen aanzienlijk verhoogde (). De immunosuppressieve werking van WV was analoog aan het remmende effect op IL-1β, TNF-α, IL-8, IL-6, COX-2, en PGE2 niveaus in rattenserum. Concluderend toonden deze bevindingen aan dat WV een antiarthritische activiteit vertoonden, die in verband zou kunnen worden gebracht met hun remmende effecten op immunoregulatie en ontstekingsremmende werking.

1. Inleiding

Rheumatoïde artritis (RA) is een chronische auto-immuunziekte die kan leiden tot systemische complicaties, lichamelijke handicaps en zelfs vroegtijdig overlijden. Hyperplasie van de synoviale cellen, chronische ontsteking van het synovium, en de vernietiging van kraakbeen en bot zijn de belangrijkste kenmerken van RA. Bovendien spelen de synergetische effecten van T-cellen, B-cellen en pro-inflammatoire cytokines ook een sleutelrol in het pathofysiologische proces. Wanneer CD4+ T cellen geactiveerd worden, produceren zij pro-inflammatoire cytokines die de immuunrespons versterken door andere mononucleaire cellen, synoviale fibroblasten, chondrocyten, en osteoclasten te stimuleren. Het vrijkomen van deze ontstekingsbevorderende cytokinen, vooral TNF-α, IL-6, en IL-1β, kan bijdragen tot synovitis.

De huidige klinische geneesmiddelen voor de behandeling van RA zijn vooral gericht op het verminderen van ontstekingsmediatoren, zoals niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen (NSAID’s), ziektemodificerende antirheumatische geneesmiddelen (DMARD’s), en biologische middelen. Zo werd het folaatanaloog methotrexaat (MTX), als NSAID, in 1988 door de FDA goedgekeurd voor RA. Het is bovendien het meest gebruikte middel geworden in de behandeling van RA omwille van zijn immunosuppressieve activiteit, ontstekingsremmend effect, en lage kostprijs . MTX is echter geen ideaal therapeutisch middel omwille van zijn ongewenste nevenwerkingen op het neuronale, gastro-intestinale en immuunsysteem, en dat geldt ook voor andere geneesmiddelen . Daarom is een groeiend aantal mensen op zoek naar nieuwe alternatieven om de inefficiëntie en veiligheid van deze geneesmiddelen aan te pakken. In de theorie van de traditionele Chinese geneeskunde (TCM) wordt RA beschouwd als een van de arthralgie syndromen (“Bi Zheng” in TCM), mogelijk veroorzaakt door exogene wind, vochtigheid, en warmte of koude pathogenen . De toepassing van TCM in de preventie en behandeling van ziekten heeft een geschiedenis van enkele eeuwen, toenemend belang in de behandeling van RA toegeschreven aan de opmerkelijke werkzaamheid, maar minder bijwerkingen en kosten.

Venom therapie, als een complementaire en alternatieve geneeskunde benadering, wordt al enkele eeuwen gebruikt voor de behandeling van pijn, ontsteking, en artritis in de volksgeneeskunde . Al in de periode van de Warring States wordt in de Innerlijke Canon van de Gele Keizer (“Huangdi Neijing” in het Chinees) vermeld: “Bijensteek is therapeutisch ondanks het toxische risico”. Volgens modern medisch onderzoek heeft bijengif (BV) een antiarthritische, ontstekingsremmende en pijnstillende werking die toe te schrijven is aan de activering van het centrale remmende en modulerende immuunsysteem via meerdere mechanismen. Verschillende klinische studies hebben ook aangetoond dat BV artritis-gerelateerde symptomen kan verbeteren .

Gif van de wesp bevat een verscheidenheid aan biologisch actieve bestanddelen, waaronder biogene aminen, stoffen met een hoge moleculaire massa (zoals enzymen, allergenen, en bioactieve peptiden), en polyamine toxinen. Het wespengif vertoonde verschillende farmacologische effecten bij de behandeling van pijn, ontstekingsziekten en neurodegeneratieve ziekten. Vespa magnifica (Smith) is een soort sociale wesp, die voorkomt in Yunnan, China. In de afgelopen jaren zijn veel verbindingen met antistolling, antiplatelet, anti-inflammatie, en immunosuppressieve activiteiten afgescheiden van hun gif . Op basis van zijn opmerkelijk effect op reumatoïde artritis, is het een gewoonte geworden om op grote schaal gebruikt te worden in Jingpo, een Chinese nationale minderheid . Niettemin, voor zover wij weten, zijn er slechts weinig rapporten over antireumatische acties van wespengif.

In het huidige werk, werd het collageen-geïnduceerde artritis (CIA) model aangenomen om de pathogenese van RA nauwkeurig na te bootsen. Veranderingen in het pootvolume zijn klassiek gebruikt voor het evalueren van ontstekingsremmende effecten op RA zoals gebruikelijk . Bovendien evalueerden we het effect van WV (wespengif van Vespa magnifica) in hetzelfde model. Tenslotte werd de effectiviteit van WV op anti-inflammatoire en immunomodulatie waargenomen door H&E kleuring van gewrichtsweefsel, flowcytometrie van T-cel subsets in milt, evenals ELISA van serum IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-8, COX-2, PGE2, en reumafactoren (IgG, IgA, en IgM).

2. Materialen en Methoden

2.1. Experimentele dieren

Mannelijke SD ratten (60 ratten, 180-220 g) werden verkregen van Hunan Slake Jingda Laboratory Animal Co., Ltd. (Hunan Slake Jingda Laboratory Animal Co., Ltd.). De dieren werden gehuisvest in standaard polypropyleen kooien bekleed met ruwe bolster (vernieuwd na 48 uur). De dieren werden gehuisvest in een 12 uur licht-donker cyclus bij ongeveer 22 ± 2°C en een relatieve vochtigheid van 60-70%, en de dieren hadden vrije toegang tot water en standaard voer. De ratten werden willekeurig toegewezen aan 8 controles en 52 modellen, en vervolgens werd een minimumperiode van 7 d toegestaan voor aanpassing aan elk experiment. Alle experimentele procedures werden uitgevoerd volgens de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Institutes of Health) en goedgekeurd door de Ethische Commissie van Dali University.

2.2. Diermodel van CIA en behandelingsprotocol

Ratten werden ontsmet met alcohol en subcutaan geïnjecteerd aan de rechter vola pedis, rug, en staart met 1 mg/ml CCII (Kip type II Collageen) emulgator voor de eerste immunisatie, die bestaat uit CCII (C9301, Sigma) geëmulgeerd 1 : 1 met onvolledige Freund’s adjuvant (F5506, Sigma). De inductiedag werd ontworpen als dag 0. De boosterdosis werd opnieuw geïnjecteerd aan de buik, rug en staart samen met 1 ml CCII-emulgator op dag 8. De geïnjecteerde voet werd gedefinieerd als de ontstekingsvoet, terwijl de andere voet zonder injectie werd genoteerd als de secundaire voet. Vervolgens werden de collageen-geïnduceerde artritis (CIA) ratten behandeld op dag 14 en beëindigd op dag 28. Na het begin van de CIA, werden de modelratten willekeurig verdeeld in vijf groepen volgens de klinische scores. Groep I: modelgroep die een hypodermische injectie (1 ml/kg) kreeg met normale zoutoplossing als vehikel. Groepen II-IV: CIA-ratten kregen een hypodermische injectie van respectievelijk 0,125, 0,25 en 0,5 mg/kg WV (wespengif, van Vespa magnifica (Smith) in Yunnan, China, gevriesdroogd poeder gemaakt van exsudaat van wespenstaartklieren , verdund met normale zoutoplossing), als de behandelingsgroepen. Groep V: positieve controlegroep kreeg TwHF (Tripterygium wilfordii Hook F, No. 20181001, Huangshi Feiyun Pharmaceutical Co., Ltd.) van 9 mg/kg op dezelfde manier. Tegelijkertijd werd hetzelfde volume normale zoutoplossing alleen gegeven aan de normale ratten in de controlegroep. De ratten kregen allen een dagelijkse toediening gedurende 14 dagen.

2.3. Basis Evaluatie van Experimentele Artritis

De ernst van CIA werd periodiek geëvalueerd op basis van pootzwelling en artritisscores. Ratten werden gewogen op dag 0-28 van de studie, en de dikte en omtrek van de enkels in de ontstekingsvoet (de rechtervoet) en de secundaire voet (de linkervoet) werden afzonderlijk gemeten met een schuifmaat en meetlint op dag 0, 14, en 28. De artritisscore werd beoordeeld op basis van onafhankelijke waarnemingen van drie geleerden. Elke poot werd gescoord op een schaal van 0-4, wat betekent dat de maximale totaalscore voor beide achterpootgewrichten 8 was. De beoordelingscriteria waren als volgt: 0 = geen oedeem of enige visuele veranderingen; 1 = licht oedeem en beperkt erytheem; 2 = licht oedeem en erytheem; 3 = duidelijk oedeem en aanzienlijk erytheem; en 4 = ernstig oedeem en uitgebreid erytheem . Op dag 28 werden de dieren opgeofferd, waarna het serum en de secundaire enkelgewrichten werden verzameld en verwerkt voor verdere analyse.

2.4. Histopathologie van de enkelgewrichten

De linker achterpoten, zonder naburige weefsels te verwijderen, werden onmiddellijk gewassen met PBS gedurende 2-3 keer, gefixeerd met 10% formaline gedurende 48 uur, en ontkalkt met 5% salpeterzuur gedurende 24 uur totdat de botcortex gemakkelijk met een naaldpunt kon worden doorgenomen. De monsters werden ingebed in paraffine secties en gesneden in plakjes (5 urn) voor routine hematoxyline-eosine (H&E) kleuring. Pathologische veranderingen van de gewrichten werden waargenomen met een lichtmicroscoop (Olympus, Japan) en gefotografeerd. De foto’s werden genomen bij een vergroting van 200x. Veranderingen in synoviocytaire hyperplasie en inflammatoire celinfiltratie werden ook gedetecteerd. Histopathologische veranderingen werden gescoord, respectievelijk, met behulp van de volgende criteria: 0 = geen waarneembare veranderingen; 1 = mild; 2 = matig; 3 = ernstig .

2.5. Analyse van de Viscera Index

Ratten werden opgeofferd en de lever, milt en thymus werden volledig weggesneden, waarbij het omliggende vetweefsel en de fascia zorgvuldig werden gescheiden. De natte massa van lever, milt en zwezerik werd gemeten met een elektronische balans, en de ingewanden index (inclusief lever index, milt index, en zwezerik index) werd berekend volgens de volgende formule. Viscera index = orgaan massa (mg)/lichaams massa (g) × 100%.

2.6. ELISA’s van Serum Biochemische Indexen

Het serum van experimentele ratten werd verzameld, en de concentraties van TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, COX-2, en PGE2 werden gedetecteerd door enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits (Nanjing JianCheng, China) volgens de instructies van de fabrikant. ELISA kits om de expressieniveaus van IgA (ERC015), IgG (ERC016), en IgM (ERC017) op te sporen werden aangekocht bij NeoBioscience Co, Ltd., Shenzhen, China.

2.7. Flow Cytometry of Arthritis Spleen

Het aantal T-celsubsets werd gedetecteerd met behulp van flowcytometrie. Lymfocyten werden geoogst uit ratten miltcellen, die werden gehomogeniseerd door ze door een 200 mesh nylon zeef te halen. De cellen werden gefiltreerd in PBS-buffer met 10% foetaal runderserum. De celconcentratie werd aangepast tot ongeveer 2 × 106/ml, en 3 ml rode bloedcellen lysisbuffer (Solarbio, China) werd toegevoegd om de rode bloedcellen op te lossen gedurende minder dan 5 minuten. Vervolgens werden de cellen gecentrifugeerd bij 1200 rpm gedurende 5 min, tweemaal gewassen met FBS-PBS buffer die 10% foetaal runderserum bevat, en vervolgens gecentrifugeerd bij 1200 rpm gedurende 5 min. Elke 100 μl celsuspensie werd in centrifugebuisjes gedaan. De lymfocyten werden gekleurd met anti-CD3-FITC (nr. 557354; BD, USA), anti-CD4-APC (nr. 565432; BD, USA), anti-CD8-PerCP (nr. 558824; BD, USA), en anti-CD25-PE (nr. 554866; BD, USA). De monoklonale antilichamen werden aan elk buisje toegevoegd, opnieuw gemengd en gedurende 30 minuten op ijs gelaten. De FBS-PBS-buffer (1 ml) werd aan elk monsterbuisje toegevoegd en gedurende 5 min. bij 1200 rpm gecentrifugeerd, waarna het supernatans werd afgegoten. De vorige stap werd tweemaal herhaald, zodat de cellen zonder binding aan monoklonale antilichamen volledig werden geëlueerd. De experimentele cellen werden gemengd met 500 pi FBS-PBS buffer. De verhoudingen CD25 + / CD4 + en CD4 + / CD8 + T-cellen werden bepaald met behulp van een FACS Canto Flow-cytometer (BD, USA) .

2.8. Statistische Analyses

De gegevens werden statistisch geanalyseerd met behulp van SPSS10.0. De gegevens werden gepresenteerd als gemiddelde ± standaardafwijking van het gemiddelde (S.D.M). De significantie van de verschillen tussen elke groep werd geanalyseerd door een-weg ANOVA gevolgd door een Tukey test. In het bijzonder werden de artritisscore en de histopathologische score geanalyseerd met de Wilcoxon rank sum test. Waarden van werden als statistisch significant beschouwd.

3. Resultaten

3.1. WV verlichtte het symptoom van artritis bij CIA-ratten

De artritische symptomen werden met succes bij ratten opgewekt door type II collageen volgens de instructies in te spuiten, wat zich uitte in significante macroscopische tekenen van ernstige roodheid en zwelling in de secundaire poot en het enkelgewricht van CIA-ratten in Figuur1(a), indien vergeleken met de gezonde controlegroep. De enkelgewricht dikte en omtrek waren blijkbaar verhoogd in voertuigen op dag 14 (figuur 1 (b)) in vergelijking met die in controles; ze waren echter opvallend verminderd na TwHF en alle WV behandelde groepen op dag 28 in vergelijking met die van de modelgroep (alle ) (figuur 1 (b)). Toen we de dikte en de omtrek van de enkelgewrichten in zowel de ontstekingsvoet als de secundaire voet maten, werd op basis van de gegevens de duidelijke zwellingsafname aangetoond (figuur 1(b)). De resultaten van de zwellingsgraad gaven aan dat WV het pootoedeem onder controle kon houden en de secundaire ontsteking aan de poot en het enkelgewricht kon verlichten, wat overeenkomt met het TwHF-effect.

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figuur 1

Effect van WV op de artritische symptomen van elke groep. (a) De mate van zwelling van de poten in alle groepen. (b) De dikte en omtrek van de enkelgewrichten zowel in de ontstekingsvoet als in de secundaire voet bij alle groepen. (c) Vergelijking van de artritis score tussen alle groepen.

Daarnaast werd de artritis score verminderd met verschillende graden door de behandeling van WV afhankelijk van de hoeveelheid dosis zoals getoond in figuur 1(c). De artritis score van de voertuiggroep was 6,5 ± 1,0 op dag 14 (vs dag 0, ). De index was significant gedaald in de groep behandeld met TwHF op dag 28, met 2,8 ± 0,8 (vs dag 14, ). Evenzo was de afname van de indexen door WV significant en dosisafhankelijk (3,2 ± 0,6 bij 0,5 mg/kg, 4,3 ± 0,7 bij 0,25 mg/kg, en 5,6 ± 0,7 bij 0,125 mg/kg) (ernstig vs. 14 dagen, ). Dit gaf aan dat de werkzaamheid van WV bij 0,5 mg/kg gelijk was aan die van de groep die behandeld werd met TwHF.

3.2. WV verlichtte de Pathologische Veranderingen van Gewrichten in CIA Ratten

H&E kleuring (Figuur 2(a)) toonde aan dat het synoviale membraan van enkelgewrichten van de controle ratten een regelmatige cellulaire ordening had, zonder enige synoviocyte hyperplasie, inflammatoire cel infiltratie, en een glad kraakbeen oppervlak. Ter vergelijking, de histologische architectuur van de gewrichten van de voertuiggroep ratten was duidelijk abnormaal met infiltratie van immuuncellen, synoviocytaire hyperplasie, een verhoogd aantal bloedvaten en erosie van kraakbeen en bot. De gewrichten van de TwHF en WV groepen waren significant verzwakt ten opzichte van die van de voertuiggroep en bewogen in de richting van die van de controlegroep. Histopathologische scores (Figuur 2(b)) wezen op (voertuiggroep) de abnormale synoviale voeringcel en infiltratie van ontstekingscellen in artritische gewrichten; TwHF en WV behandelingen verlaagden de gemiddelde histopathologische score aanzienlijk en herstelden het kraakbeen in vergelijking met de voertuiggroep ().

(a)

(b)

(a)
(b)

Figuur 2

Effecten van WV op artritisprogressie en gewrichtshistologie bij CIA-ratten. (a) Histopathologie van gewrichtsweefseldoorsneden van CIA-ratten behandeld met verschillende doses WV en TwHF en normale ratten door H&E kleuring. Oorspronkelijke vergroting ×200. a, botvernietiging; b, infiltratie van immuuncellen; c, hypertrofisch synovium. (b) Histopathologie scores van synoviocyte hyperplasie en inflammatoire cel infiltratie in alle groepen. vergeleken met de controlegroep; vergeleken met de voertuiggroep.

3.3. Effects of WV on Viscera Index and Immune Serum Globulin Levels in CIA Rats

Vergeleken met de controlegroep, daalde de leverindex van de voertuiggroep aanzienlijk () en steeg WV (0.25 en 0.5 mg/kg) duidelijk (). Vergeleken met de controlegroep namen de miltindex en de thymusindex van de voertuiggroep duidelijk toe (); TwHF en WV speelden een remmend effect op hen dat met name tot uiting kwam in het effect van 0,5 mg/kg dosis WV op de thymusindex (figuur 3(a)).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figuur 3

Effecten van WV op de ingewandenindex en de immuunserumglobulinegehalten bij CIA-ratten. (a) Veranderingen in de milt-, thymus- en leverindex in alle groepen. (b) De expressie IgG, IgA, en IgM niveaus in serum van alle groepen. vergeleken met de controlegroep; vergeleken met de voertuiggroep.

De expressie IgG-, IgA-, en IgM-niveaus waren sterk verbeterd bij CIA-ratten () vergeleken met de controlegroep, terwijl ze lager werden na TwHF-verwerking (). En de niveaus van serum IgG werden verlaagd in de WV (0,5 mg/kg) groep vergeleken met de voertuiggroep (). Deze remming werd ook toegepast op IgA en IgM in WV-groepen (0,25 en 0,5 mg/kg) (figuur 3(b)).

3.4. Effecten van WV op T Cell Subsets in de milt van CIA-ratten

Het aantal CD4+ T-cellen nam significant toe in de voertuiggroepen vergeleken met de controlegroep (), terwijl die in TwHF en WV (0,5 mg/kg) groepen significant lager waren dan de voertuiggroep (figuur 4(a)). Vergeleken met de controlegroep, was het aantal CD4+CD25+ T cellen in de voertuiggroep significant gedaald (), terwijl ze significant verhoogd waren in TwHF en WV (0.5 mg/kg) groepen (), maar niet duidelijk in de andere groepen (Figuur 4(a)). Vergeleken met de controlegroep was de vermindering in de voertuiggroep van het aantal CD8+ T-cellen opmerkelijk, maar alleen WV (0,125 en 0,25 mg/kg) deed de aantallen stijgen (, ) in figuur 4(b).

(a)

(b)

(a)
(b)

3.5. WV Regulated Serum Cytokines and Mediators in CIA Rats

ELISA kits (Figuur 5) toonden aan dat, in vergelijking met de controlegroep, de serumniveaus van IL-1β, TNF-α, IL-6, PGE2, COX-2, en IL-8 aanzienlijk verhoogd waren in de voertuiggroep en duidelijk werden hersteld door TwHF (9 mg/kg) en WV (0,5 mg/kg) (). Ondertussen werden de expressies van IL-6 en PGE2 onderdrukt door 0,125 en 0,25 mg/kg dosering van WV (). WV (0,125 en 0,25 mg/kg) verminderde op vergelijkbare wijze de expressie van COX-2 en IL-8 in vergelijking met het voertuig (, ). Dit gaf aan dat CCII-geïnduceerde ontsteking waarschijnlijk de oorzaak was van de pathologische veranderingen die werden gezien in de artritische ratten, en WV kon de ontstekingsreactie verlichten.

Figuur 5

Effecten van WV op IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, PGE2, en COX-2 niveaus in CIA rattenserum. vergeleken met de controlegroep; vergeleken met de voertuiggroep.

4. Discussie

RA is een chronische auto-immuunziekte die gekenmerkt wordt door pijn, zwelling en geleidelijke vernietiging van de gewrichten, met functieverlies als gevolg. cHoewel methotrexaat (MTX) tabletten offen beschouwd worden als een geneesmiddel voor de behandeling van reumatoïde artritis , worden ze gewoonlijk geassocieerd met bijwerkingen van het geneesmiddel (ADRs). Vandaar dat we trachtten te evalueren of wespengif (WV) een potentieel alternatief geneesmiddel zou kunnen zijn voor RA.

De huidige studie was de eerste, voor zover ons bekend, om de therapeutische rol van WV (van Vespa magnifica) te onderzoeken in collageen-geïnduceerde artritis (CIA) geïnduceerd in SD ratten en vergeleken met het klinisch bewezen effect van TwHF. Tripterygium wilfordii Hook F (TwHF), ook bekend als Lei Gong Teng in TCM, wordt in China al vele jaren gebruikt voor de behandeling van RA, en de extracten van TwHF hebben zowel in vivo als in vitro studies anti-inflammatoire en immunosuppressieve activiteiten laten zien. Wij stelden het model van CIA-ratten op gedurende 14 dagen en verwijderden 12 schijnbare incompetenties die mogelijk te wijten waren aan het falen van de injectie uit 52 ratten, dat wil zeggen, de CIA-ratten hadden een artritispercentage van 77%. De controlegroep vertoonde geen tekenen van oedeem of ontsteking (Figuren 1 en 5), en onze bevindingen zijn in overeenstemming met eerdere studies van RA en CIA, die rapporteerden dat CCII emulgator de ernst van oedeem en ontstekingsschade in de gewrichten induceerde . Vervolgens waren de verbeterde symptomen in de WV (0,5 mg/kg) groep vergelijkbaar met die van het positieve geneesmiddel TwHF, waarvan is gerapporteerd dat het de ontstekingsreactie van RA remt , maar het effect van de lage dosis was niet significant op de vermindering van de zwelling en de remming van IL-1β en TNF-α (Figuren 1 en 5). Bovendien stelden we vast dat de ratten in de voertuiggroep een ruwere vacht en een slechtere mentale toestand hadden dan die in de controlegroep; deze omstandigheden waren des te beter geworden in de behandelingsgroep.

Om de therapeutische werkzaamheid van WV verder te evalueren, werden H&E-kleuring uitgevoerd in weefselmonsters van de linker achterenkelgewrichten om het pathologische kenmerk te analyseren, en we ontdekten dat synoviale cellen ontsteking, proliferatie en invasie van gelokaliseerd kraakbeen en bot veroorzaken in de voertuiggroep (figuur 2), en deze macroscopische veranderingen zijn consistent met eerdere rapporten . Bovendien, TwHF en WV behandeling gedurende 14 dagen verminderde synoviale cel hyperplasie en inflammatoire cel infiltratie aanzienlijk in vergelijking met onbehandeld (figuur 2). Chronische synovitis is de pathologische basis van RA. De synoviale ontsteking wordt aangestuurd door een complexe interactie tussen synoviocyten en infiltrerende cellen van het aangeboren en het adaptieve immuunsysteem. Daarom werd de viscerale index van immuunorganen zoals milt en thymus berekend in dit experiment. Het is vermeldenswaard dat we geen significant verschil in gewicht vonden tussen de voertuig- en behandelingsgroep; daarom gebruikten we de representatieve ingewanden index om de algehele gezondheid van de ratten weer te geven. We vonden dat TwHF en WV de stijging van de viscerale index van milt en thymus in CIA ratten konden verminderen (figuur 3(a)); dit zou hun rol kunnen weerspiegelen in het verlichten van de immuunversterking veroorzaakt door RA. We zagen ook de verandering in de leverindex gedurende dit proces; onze resultaten toonden aan dat TwHF de leverindex niet deed herleven hoewel de behandeling effectief was, wat ons herinnerde aan de giftigheid voor de lever in een eerder rapport. Gelukkig werd dit niet gevonden in de WV groep (Figuur 3(a)). Met uitzondering van de verminderde leverindex in de voertuig- en TwHF-groep, werden er geen bijwerkingen waargenomen bij deze ratten, wat te wijten zou kunnen zijn aan de lage dosering die we gebruikten. Bovendien detecteerden we ook reumafactoren (RFs), een diagnostische marker voor RA, voornamelijk IgG, IgA en IgM isotypen; het heeft een hoge detectiegraad bij patiënten met RA . Uit deze studie bleek dat onbehandelde CIA ratten significant hogere niveaus van IgG, IgA, en IgM antilichamen in serum hadden dan die in TwHF en WV groepen (figuur 3(b)); deze resultaten kwamen goed overeen met de klinische gegevens zoals gerapporteerd. Er kon dus worden vastgesteld dat TwHF en WV (0,5 mg/kg) de overmatige autoimmuunrespons van CIA-ratten konden terugdringen tot een niveau dat dicht bij normaal lag. Daarentegen was het effect van WV (0,125 en 0,25 mg/kg) niet duidelijk, terwijl nog moet worden afgewacht of een hogere dosis het effect zal verbeteren in plaats van als een gif te werken, dus we hebben ons nog steeds gericht op deze drie doses om het effect van WV op RA in dit experiment te onderzoeken.

Vorig onderzoek heeft aangetoond dat synoviale ontsteking immuuncellen rekruteert en activeert door mediatoren te produceren, en T-cellen spelen een vitale rol bij de regulatie van RA . Wat betreft de rol van ontstekingsbevorderende cytokines in auto-immuniteit, is het essentieel om de balans tussen verschillende T-celsubsets te overwegen, voornamelijk verdeeld in twee hypotypen op basis van hun functie en fenotype: CD4+ helper T (Th) cel en CD8+ cytotoxische T (Tc) cel. Th- en Tc-cellen, die gekenmerkt worden door de productie van diverse specifieke cytokines, vergemakkelijken de adaptieve immuunrespons. CD4+CD25+ T (Treg) cellen daarentegen hebben een cruciale functie in het behoud van immuuntolerantie door het controleren van ontstekingsreacties en het onderdrukken van de activiteit van de bovengenoemde immuuncellen. In deze studie vonden we een grote concentratie van Th en Tc cellen in de milt cellen en merkten we ook een verminderde functie van Treg cellen in CIA ratten. Gelukkig werd het evenwicht tussen T cel subsets beschermd met TwHF en WV behandeling (figuur 4). Van belang is dat de ophoping van immuuncellen de promotor is van lokale gewrichtsontsteking, en de geactiveerde immuuncellen geven een grote hoeveelheid proinflammatoire cytokines af, die vervolgens de activering en proliferatie van synoviale cellen induceren en de progressie van gewrichtsontsteking verder verergeren. Eerdere studies hebben aangetoond dat IL-6 de meest dominante cytokine is in de pathogenese van RA , en excessieve hoeveelheden IL-1β, evenals TNF-α en IL-8, zijn aangetroffen in de synoviale vloeistof van RA-patiënten . De productie van COX-2 en PGE2 na stimulatie met IL-1β is ook toegenomen, en het blokkeren ervan verlichtte de symptomen van RA aanzienlijk. Vergelijkbare bevindingen werden waargenomen in onze experimentele resultaten, en we bevestigden dat TwHF en WV (0,5 mg/kg) effectief de niveaus van IL-6, IL-8, PGE2 en COX-2 konden verlagen; ook werden de verhoogde concentraties van IL-1β en TNF-α geïnduceerd door RA onderdrukt, behalve bij de WV (0,125 en 0.25 mg/kg) groepen (figuur 5).

Deze resultaten suggereerden dat WV de functies heeft van het verlichten van gewrichtszwelling, het remmen van synoviale ontsteking, het onderdrukken van excessieve immuunrespons, en het beschermen van immuunhomeostase, die de symptomen kunnen verbeteren en effectieve remedies kunnen worden voor RA. Er is gerapporteerd dat wespengif een aantal bioactieve moleculen bevat, waaronder aminen, kleine peptiden, en zelfs enzymen, allergenen en toxinen met een hoge moleculaire massa. Wat WV onderscheidt van BV is dat BV voornamelijk ontstekingsremmende, antioxidatieve en pijnstillende effecten heeft op RA, en het bevat een verscheidenheid aan verschillende peptiden, waaronder melittine, fosfolipase A2, apamine, enzovoort . De mechanismen voor de behandeling van RA met deze twee giffen kunnen verschillend zijn en zijn verdere studie waard. Hoewel er geen bijwerkingen werden waargenomen in het bereik van 0,125 tot 0,5 mg/kg WV, was verdere evaluatie van de actieve bestanddelen en de veiligheid van WV extract vereist.

5. Conclusies

Wespengif verlichtte synoviale hyperplasie en kraakbeenvernietiging veroorzaakt door CIA, mogelijk als gevolg van de vermindering van de proinflammatoire factor en het immunoregulerende effect. Deze studie toonde aan dat wespengif een potentieel therapeutisch alternatief zou kunnen zijn voor RA. Naast het feit dat het al vele jaren een volksrecept is, verdient WV verdere studie om ontdekt, onderzocht en erkend te worden.

Beschikbaarheid van gegevens

De gegevens die gebruikt zijn om de bevindingen van deze studie te ondersteunen, zijn opgenomen in het artikel en kunnen vrij ter beschikking worden gesteld.

Ethische goedkeuring

De studie werd goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Dali.

Conflicts of Interest

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflicten zijn met betrekking tot de publicatie van dit artikel.

Authors’ Contributions

YG schreef het manuscript en assisteerde bij de constructie en groepering van diermodellen. WXY en HL voerden H&E kleuringen en flowcytometrie uit. XMD en LLN waren verantwoordelijk voor ELISA kits. ZBY, HRZ, en HX waren belangrijke medewerkers bij het schrijven van het manuscript. ZBY en CGZ beheerden en superviseerden het project. Alle auteurs lazen en keurden het uiteindelijke manuscript goed.

Acknowledgments

Een deel van dit werk werd ondersteund door Yunnan Provincial 2011 Collaborative Innovation Center for Entomoceutics. De huidige studie werd gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China (subsidie nrs. 81360679 en 81703742), Yunnan Applied Basic Research for Young Scholars (subsidie nr. 2016FD074), Natural Science Foundation van de provincie Yunnan (subsidie nr. 2017FA050), en Dali University Innovation Team of Advanced Pharmaceutics of Entomological Bio-Pharmacy R&D (grant no. ZKLX2019101).