Szczepy wirusowe
HCoV-229E (VR-740) i HCoV-OC43 (VR-1558) były namnażane w ludzkich diploidalnych fibroblastach płuc MRC-5 (CCL-171) i WI-38 (CCL-75), odpowiednio (wszystkie z ATCC, Manassas, VA). Obie ludzkie linie komórkowe hodowano w podłożu MEM uzupełnionym 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 2 mM L-alanylo-L-glutaminą, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny (Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA). Podłoże do infekcji wirusowej składało się z MEM lub RPMI-1640 plus 2% inaktywowanego termicznie FBS dla HCoV-229E i HCoV-OC43, odpowiednio. Szczepy wirusowe namnażano przez inokulację kolb zawierających 24-godzinne komórki gospodarza, które były w 80-90% konfluentne. Po godzinnej inkubacji, monowarstwę komórek przemywano i inkubowano w świeżym podłożu infekcyjnym przez trzy lub cztery dni w temperaturze 35 °C dla HCoV-229E i w temperaturze 33 °C dla HCoV-OC43. Supernatant zawierający zapas roboczy wirusa zbierano przez odwirowanie (300 g przez 15 minut). Miano wirusa określano na podstawie 50% dawki infekcyjnej w hodowli tkankowej TCID50, oceniając efekty cytopatyczne (CPE), które oceniano pod mikroskopem jasnego pola (10×) jako wakuolizację cytoplazmy, zaokrąglenie komórek i łuszczenie.
Komora stacjonarna do napromieniania aerozolem
Jednoprzebiegowa, dynamiczna komora do napromieniania aerozolem/wirusem była używana do generowania, naświetlania i zbierania próbek aerozolu, jak opisano wcześniej23. Aerozole wirusowe były generowane przez dodanie roztworu wirusa w nebulizatorze do terapii oddechowej o wysokiej wydajności rozszerzonego aerozolu (Westmed, Tucson, AZ) i działanie przy użyciu pompy powietrza z wejściowym natężeniem przepływu 11 L/min. Wirus napływał do komory i był mieszany z suchym i nawilżonym powietrzem w celu utrzymania wilgotności w zakresie ok. 50-70%. Wilgotność względna, temperatura i rozkład wielkości cząstek aerozolu były monitorowane przez cały czas pracy. Aerozol naświetlano światłem dalekiego UVC i ostatecznie zbierano za pomocą BioSamplera (SKC Inc., Eighty Four, PA).
Lampa dalekiego UVC była umieszczona w odległości około 22 cm od komory naświetlania UV i skierowana na plastikowe okienko o wymiarach 26 cm × 25,6 cm × 254 μm przepuszczające promieniowanie UV (TOPAS 8007 × 10, TOPAS Advanced Polymers Inc., Florence, KY). Zgodnie z naszymi poprzednimi doświadczeniami z użyciem tej komory23 , natężenie przepływu przez system wynosiło 12,5 l/min. Objętość obszaru naświetlania UV wynosiła 4,2 L, tak więc każdy aerozol był naświetlany przez około 20 sekund podczas przechodzenia przez okno. Cała komora naświetlania znajdowała się w szafie poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2, a wszystkie wejścia i wyjścia powietrza były wyposażone w filtry HEPA (GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA), aby zapobiec przedostawaniu się niepożądanych zanieczyszczeń do systemu lub jego opuszczaniu.
Wydajność komory naświetlania
Niestandardowa komora naświetlania symulowała przenoszenie aerozoli wirusów wytwarzanych przez ludzki kaszel i oddychanie. Komora działała przy średniej wilgotności względnej 66% i średniej temperaturze 24 °C we wszystkich cyklach. Średni rozkład wielkości cząstek wynosił 83% pomiędzy 0,3 μm a 0,5 μm, 12% pomiędzy 0,5 μm a 0,7 μm i 5% >0,7 μm (Tabela 3). Aerozolizowane wirusy były skutecznie przenoszone przez system, o czym świadczy kontrola (zerowa ekspozycja) wykazująca wyraźną integrację wirusa (ryc. 2 i 3, lewy górny panel).
Lampa Far-UVC i dozymetria
Źródłem Far-UVC używanym w tym badaniu był moduł lampy ekscymerowej 12 W 222-nm KrCl wyprodukowany przez USHIO America (Item #9101711, Cypress, CA). Lampa jest wyposażona w opatentowane optyczne okienko filtrujące w celu zmniejszenia emisji lampy poza szczytem emisji 222 nm KrCl. Lampa była umieszczona w odległości 22 cm od okna komory naświetlania i skierowana na środek okna. Pomiary mocy optycznej wykonywano przy użyciu krzemowego fotodetektora 818-UV/DB o niskiej mocy wzmocnionej UV z miernikiem mocy optycznej 843-R (Newport, Irvine, CA). Dozymetrię wykonywano przed rozpoczęciem eksperymentu, aby zmierzyć fluencję w komorze w położeniu aerozolu.
Odległość między lampą a komorą napromieniania pozwalała pojedynczej lampie na równomierne napromieniowanie całego obszaru okna naświetlania. Pomiary przy użyciu fotodetektora krzemowego wykazały intensywność naświetlania wynoszącą około 90 μW/cm2 w całym obszarze naświetlania. Komora wyposażona jest w aluminiową powierzchnię odbijającą, znajdującą się naprzeciwko okna naświetlania. Podobnie jak w naszej poprzedniej pracy z tą komorą23, współczynnik odbicia tej powierzchni wynosił około 15%. Dlatego ostrożnie oszacowaliśmy natężenie na całym obszarze naświetlania na 100 μW/cm2. Przy lampie umieszczonej 22 cm od okna i biorąc pod uwagę czas 20 sekund potrzebny na przejście cząstki aerozolu przez okno naświetlania, obliczyliśmy całkowitą dawkę naświetlania cząstki na 2 mJ/cm2. Użyliśmy dodatkowych arkuszy plastikowych okien przepuszczających promieniowanie UV w celu równomiernego zmniejszenia intensywności w całym obszarze ekspozycji, aby stworzyć różne warunki ekspozycji. Podczas naszej poprzedniej pracy z tymi arkuszami zmierzyliśmy transmisję bliższą 65%23 , podczas tych testów zmierzyliśmy, że transmisja 222-nm każdego arkusza wynosi około 50%. Ten spadek transmisji jest prawdopodobnie spowodowany fotodegradacją plastiku w czasie4. Dodanie jednego lub dwóch arkuszy plastiku zakrywających okno naświetlania zmniejsza dawkę naświetlania odpowiednio do 1 i 0,5 mJ/cm2.
Protokół doświadczalny
Jak opisano wcześniej23, roztwór wirusa w nebulizatorze składał się z 1 ml pożywki Modified Eagle’s Medium (MEM, Life Technologies, Grand Island, NY) zawierającej 107-108 TCID50 koronawirusa, 20 ml dejonizowanej wody i 0,05 ml zrównoważonego roztworu soli Hanka z wapniem i magnezem (HBSS++). Komora napromieniowywania pracowała z aerozolem cząstek wirusa przepływającym przez komorę i kanał obejściowy przez 5 minut przed każdym pobraniem próbki, w celu ustalenia pożądanej wartości RH. Pobieranie próbek rozpoczynano poprzez zmianę przepływu powietrza z kanału obejściowego do BioSamplera za pomocą zestawu zaworów trójdrożnych. BioSampler był początkowo wypełniony 20 ml HBSS++ w celu przechwycenia aerozolu. Podczas każdego pobierania próbek, które trwało 30 minut, wnętrze komory napromieniowywania było naświetlane 222-nm światłem far-UVC, wpadającym przez plastikowe okienko. Zmianę dawki dalekiego promieniowania UV-UVC dostarczanej do cząstek aerozolu uzyskano poprzez wprowadzenie dodatkowych folii z tworzywa sztucznego przepuszczających promieniowanie UV, jak opisano powyżej, dostarczając w ten sposób trzy testowe dawki 0,5, 1,0 i 2,0 mJ/cm2. Badania kontrolne zerowej dawki przeprowadzono przy wyłączonej lampie ekscymerowej. Po zakończeniu okresu pobierania próbek roztwór z BioSamplera był wykorzystywany do badań zakaźności wirusa.
Testy zakaźności wirusa
TCID50
W celu określenia zakaźności wirusa zastosowaliśmy test 50% dawki zakaźnej w hodowli tkankowej28. W skrócie, 105 komórek gospodarza zostało umieszczonych w każdej studzience 96-studzienkowej płytki dzień przed eksperymentem. Komórki przemywano dwukrotnie w HBSS++ i seryjne rozcieńczenia 1:10 w medium infekcyjnym eksponowanego wirusa z BioSamplera nakładano na komórki na dwie godziny. Następnie komórki przemywano dwukrotnie w HBSS++, pokrywano świeżym podłożem infekcyjnym i inkubowano przez trzy lub cztery dni w temperaturze 34 °C. Efekty cytopatyczne (CPE) oceniano pod mikroskopem z jasnym polem (10×) jako wakuolizację cytoplazmy, zaokrąglenie i odpadanie komórek. TCID50 obliczano metodą Reeda i Muencha28,38. Aby potwierdzić wyniki CPE, próbki zostały utrwalone w 100% metanolu na pięć minut i zabarwione 0,1% fioletem krystalicznym. Wyniki są podawane jako szacunkowa liczba jednostek tworzących płytki (PFU)/ml przy użyciu konwersji PFU/ml = 0,7 TCID50 przez zastosowanie rozkładu Poissona29.
Immunofluorescencja
Aby ocenić, czy wzrastające dawki światła 222-nm zmniejszyły liczbę zakażonych komórek, wykonaliśmy standardowy fluorescencyjny protokół immunostaining w celu wykrycia antygenu wirusowego w ludzkich komórkach gospodarza23. Krótko mówiąc, 2 × 105 komórek gospodarza (komórki MRC-5 dla HCoV-229E i WI-38 dla HCoV-OC43) umieszczono w każdej studzience 48-studzienkowej płytki dzień przed eksperymentem. Po przepuszczeniu przez komorę napromieniania przez 30 minut, 150 μl zawiesiny wirusa pobranej z BioSamplera nakładano na monowarstwę komórek gospodarza. Komórki inkubowano z wirusem przez godzinę, po czym przemywano trzykrotnie HBSS++, a następnie inkubowano przez noc w świeżym medium infekcyjnym. Zakażone komórki były następnie utrwalane w 100% lodowatym metanolu w 4 °C przez 5 minut i znakowane anty-ludzką glikoproteiną kolca koronawirusa (40021-MM07, Sino Biologicals US Inc., Chesterbrook, PA) 1:200 w HBSS++ zawierającym 1% surowiczej albuminy bydlęcej (BSA; Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA) w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę z delikatnym wstrząsaniem. Komórki przemywano trzykrotnie w HBSS++ i znakowano kozim anty-mysim Alexa Fluor-488 (Life Technologies, Grand Island, NY) 1:800 w HBSS++ zawierającym 1% BSA, w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności, delikatnie wstrząsając. Po trzykrotnym płukaniu w HBSS++, komórki barwiono przy użyciu Vectashield zawierającego DAPI (4′,6-diamidino-2-fenyloindol) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) i obserwowano przy użyciu obiektywu 10× mikroskopu fluorescencyjnego Olympus IX70 wyposażonego w wysokorozdzielczą, wysokowydajną kamerę cyfrową Photometrics PVCAM i oprogramowanie Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD). Dla każdej dawki 222-nm i rodzaju wirusa, reprezentatywne wyniki powtórzono dwukrotnie. Dla każdej próbki uzyskano do dziesięciu pól widzenia połączonych obrazów DAPI i Alexa Fluor-488.
Analiza danych
Frakcja przeżywająca (S) wirusa została obliczona przez podzielenie frakcji PFU/ml przy każdej dawce UV (PFUUV) przez frakcję przy dawce zerowej (PFUcontrols): S = PFUUV/PFUcontrols. Wartości przeżycia obliczono dla każdego powtórzonego doświadczenia i przekształcono w logarytm naturalny (ln), aby zbliżyć rozkład błędów do normalnego39. Solidna regresja liniowa przy użyciu iterowanych ponownie ważonych najmniejszych kwadratów (IWLS)40,41 została przeprowadzona w oprogramowaniu R 3.6.2 przy użyciu tych znormalizowanych wartości ln jako zmiennej zależnej i dawki UV (D, mJ/cm2) jako zmiennej niezależnej. Stosując to podejście, przeżywalność wirusa opisano kinetyką pierwszego rzędu zgodnie z równaniem4:
gdzie k jest stałą szybkości inaktywacji UV lub współczynnikiem podatności (cm2/mJ). Regresję przeprowadzono z terminem intercept ustawionym na zero, reprezentującym definicję 100% względnej przeżywalności przy zerowej dawce UV, oddzielnie dla każdego badanego szczepu wirusa. Dane przy zerowej dawce, które z definicji reprezentują ln = 0, nie zostały włączone do regresji. Niepewność (95% przedziały ufności, CI) dla parametru k dla każdego szczepu wirusa oszacowano za pomocą bootstrappingu dla każdej metody regresji, ponieważ bootstrapping może skutkować bardziej realistycznymi oszacowaniami niepewności, w porównaniu ze standardowym przybliżeniem analitycznym opartym na normalności asymptotycznej, w małych zbiorach danych, takich jak te użyte tutaj (n = 3 HCoV-229E i n = 4 dla HCoV-OC43). Dobroć dopasowania została oceniona przez współczynnik determinacji (R2). Analizę reszt pod kątem autokorelacji i heteroskedastyczności przeprowadzono przy użyciu odpowiednio testu Durbina-Watsona42 i testu Breuscha-Pagana (zaimplementowanego w pakiecie R lmtest)43. Oszacowania parametrów (k) dla każdego szczepu wirusa porównywano ze sobą w oparciu o 95% CI oraz bezpośrednio za pomocą testu t, wykorzystując wielkości prób, wartości k i ich błędy standardowe. Przekrój poprzeczny inaktywacji wirusa, D90, który jest dawką UV, która inaktywuje 90% naświetlonego wirusa, został obliczony jako D90 = – ln/k. Inne wartości D zostały obliczone w podobny sposób.