Alai

Koronawirusy spowodowały dwie pandemie na dużą skalę w ciągu ostatnich dwóch dekad, SARS i Middle East respiratory syndrome (MERS)8,9. Powszechnie uważa się, że SARSr-CoV – który występuje głównie u nietoperzy – może spowodować wybuch choroby w przyszłości10,11. Tutaj opisujemy serię przypadków spowodowanych niezidentyfikowanym ogniskiem choroby zapalenia płuc w Wuhan, w prowincji Hubei, w środkowych Chinach. To ognisko choroby – które rozpoczęło się od lokalnego targu owoców morza – znacznie się powiększyło, zarażając 2761 osób w Chinach, jest związane z 80 zgonami i doprowadziło do zarażenia 33 osób w 10 dodatkowych krajach, według stanu na 26 stycznia 2012 r.12. Typowe objawy kliniczne u tych pacjentów to gorączka, suchy kaszel, trudności w oddychaniu (duszność), ból głowy i zapalenie płuc. Początek choroby może prowadzić do postępującej niewydolności oddechowej z powodu uszkodzenia pęcherzyków płucnych (obserwowanego na obrazach tomografii komputerowej poprzecznej klatki piersiowej), a nawet do śmierci. Choroba została określona przez klinicystów jako wywołana przez wirusowe zapalenie płuc na podstawie objawów klinicznych i innych kryteriów, w tym wzrostu temperatury ciała, spadku liczby limfocytów i białych krwinek (chociaż poziom tych ostatnich był czasami prawidłowy), nowych nacieków płucnych na radiografii klatki piersiowej i braku wyraźnej poprawy po leczeniu antybiotykami przez trzy dni. Wydaje się, że większość wczesnych przypadków miała historię kontaktu z pierwotnym rynkiem owoców morza; jednakże choroba rozwinęła się i obecnie jest przenoszona przez kontakt między ludźmi.

Próbki od siedmiu pacjentów z ciężkim zapaleniem płuc (z których sześciu to sprzedawcy lub dostawcy z rynku owoców morza), którzy zostali przyjęci na oddział intensywnej terapii szpitala Wuhan Jin Yin-Tan na początku wybuchu epidemii, zostały wysłane do laboratorium w Instytucie Wirusologii w Wuhan (WIV) w celu zdiagnozowania patogenu sprawczego (Tabela danych rozszerzonych 1). Jako laboratorium badające CoV, najpierw użyliśmy starterów PCR pan-CoV do zbadania tych próbek13, biorąc pod uwagę, że ognisko wystąpiło w zimie i na rynku – to samo środowisko, w którym wystąpiły infekcje SARS. Stwierdziliśmy, że pięć próbek było PCR-pozytywnych dla CoV. Jedna próbka (WIV04), pobrana z płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF), została poddana analizie metagenomicznej przy użyciu sekwencjonowania następnej generacji w celu zidentyfikowania potencjalnych czynników etiologicznych. Z 10 038 758 całkowitych odczytów, z których 1 582 zostało zachowanych po odfiltrowaniu odczytów z genomu ludzkiego, 1 378 (87,1%) sekwencji pasowało do sekwencji SARSr-CoV (ryc. 1a). W wyniku montażu de novo i ukierunkowanej PCR uzyskaliśmy genom CoV o długości 29 891 par, który dzielił 79,6% identyczności sekwencji z SARS-CoV BJ01 (numer akcesyjny GenBank AY278488.2). Wysokie pokrycie genomu uzyskano przez remapping całkowitych odczytów do tego genomu (Extended Data Fig. 1). Sekwencja ta została zgłoszona do GISAID (https://www.gisaid.org/) (numer akcesyjny EPI_ISL_402124). Zgodnie z nazwą nadaną przez Światową Organizację Zdrowia (WHO), wstępnie nazywamy go nowym koronawirusem 2019 (2019-nCoV). Cztery kolejne sekwencje genomu o pełnej długości 2019-nCoV (WIV02, WIV05, WIV06 i WIV07) (numery akcesji GISAID EPI_ISL_402127-402130), które były ponad 99,9% identyczne ze sobą, zostały następnie uzyskane od czterech dodatkowych pacjentów przy użyciu sekwencjonowania następnej generacji i PCR (Tabela 2 danych rozszerzonych).

Genom wirusa składa się z sześciu głównych ramek odczytu otwartego (ORF), które są wspólne dla koronawirusów i szeregu innych genów akcesoryjnych (ryc. 1b). Dalsza analiza wskazuje, że niektóre z genów 2019-nCoV dzieliły mniej niż 80% identyczności sekwencji nukleotydów z SARS-CoV. Jednak sekwencje aminokwasowe siedmiu konserwowanych domen replikazy w ORF1ab, które zostały wykorzystane do klasyfikacji gatunkowej CoV, były w 94,4% identyczne między 2019-nCoV i SARS-CoV, co sugeruje, że te dwa wirusy należą do tego samego gatunku, SARSr-CoV.

Szybko opracowaliśmy metodę wykrywania opartą na qPCR na podstawie sekwencji domeny wiążącej receptor genu S, która była najbardziej zmiennym regionem genomu (ryc. 1c). Nasze dane pokazują, że startery mogły odróżnić 2019-nCoV od wszystkich innych ludzkich koronawirusów, w tym nietoperza SARSr-CoV WIV1, który dzieli 95% identyczności z SARS-CoV (rozszerzone dane Fig. 4a, b). Spośród próbek uzyskanych od siedmiu pacjentów, stwierdziliśmy, że sześć próbek BALF i pięć próbek wymazu z jamy ustnej było pozytywnych dla 2019-nCoV podczas pierwszego pobierania próbek, jak oceniono za pomocą qPCR i konwencjonalnej PCR. Jednak nie mogliśmy już wykryć próbek dodatnich dla wirusa w wymazach z jamy ustnej, wymazach z odbytu i próbkach krwi pobranych od tych pacjentów podczas drugiego pobierania próbek (ryc. 2a). Zalecamy jednak, aby do rutynowego wykrywania 2019-nCoV stosować inne cele qPCR, w tym geny RdRp lub genów otoczki (E). Na podstawie tych ustaleń proponujemy, że choroba może być przenoszona drogą powietrzną, chociaż nie możemy wykluczyć innych możliwych dróg przenoszenia, ponieważ wymagane jest dalsze badanie, w tym więcej pacjentów.

Do serologicznego wykrywania 2019-nCoV, użyliśmy wcześniej opracowanego białka nukleokapsydu (N) z nietoperza SARSr-CoV Rp3 jako antygenu dla testów immunosorbcji enzymatycznej (ELISA) IgG i IgM, ponieważ to białko dzieliło 92% tożsamości aminokwasowej z białkiem N 2019-nCoV (Extended Data Fig. 5) i nie wykazywało reaktywności krzyżowej przeciwko innym ludzkim koronawirusom, z wyjątkiem SARSr-CoV7. Byliśmy w stanie uzyskać tylko pięć próbek surowicy od siedmiu pacjentów z infekcjami wirusowymi. Monitorowaliśmy poziomy przeciwciał wirusowych u jednego pacjenta (ICU-06) 7, 8, 9 i 18 dni po wystąpieniu choroby (Tabela danych rozszerzonych 2). Zaobserwowano wyraźny trend w mianach IgG i IgM, które wzrastały w czasie, z wyjątkiem tego, że miano IgM było obniżone w ostatniej próbce (ryc. 2b). W ramach drugiej analizy przebadaliśmy próbki od 5 z 7 wirusowo dodatnich pacjentów około 20 dni po wystąpieniu choroby na obecność przeciwciał wirusowych (Tabele danych rozszerzonych 1, 2). Wszystkie próbki od pacjentów – ale nie próbki od zdrowych osób – były silnie pozytywne dla wirusowych IgG (ryc. 2b). Były również trzy próbki IgM-dodatnie, wskazujące na ostrą infekcję.

Następnie z powodzeniem wyizolowaliśmy wirusa (nazwanego 2019-nCoV BetaCoV/Wuhan/WIV04/2019) zarówno z komórek Vero E6, jak i Huh7, używając próbki BALF pacjenta ICU-06. Wyraźne efekty cytopatogenne obserwowano w komórkach po inkubacji przez trzy dni (Extended Data Fig. 6a, b). Tożsamość szczepu WIV04 zweryfikowano w komórkach Vero E6 za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej z użyciem krzyżowo reagującego przeciwciała wirusowego N (Extended Data Fig. 6c, d) oraz za pomocą sekwencjonowania metagenomicznego, którego większość odczytów mapowała do 2019-nCoV, a analiza qPCR wykazała, że wiremia wzrastała od dnia 1 do dnia 3 (Extended Data Fig. 6e, f). Cząstki wirusowe w ultracienkich przekrojach zakażonych komórek wykazywały typową morfologię koronawirusa, co uwidoczniono w mikroskopii elektronowej (Extended Data Fig. 6g). Aby dodatkowo potwierdzić aktywność neutralizacyjną wirusowych próbek IgG-dodatnich, przeprowadziliśmy testy neutralizacji surowicy w komórkach Vero E6 przy użyciu pięciu surowic pacjentów, które były IgG-dodatnie. Wykazaliśmy, że wszystkie próbki były w stanie zneutralizować 100 TCID50 (50% dawki zakaźnej w kulturze tkankowej) 2019-nCoV w rozcieńczeniu 1:40-1:80. Pokazujemy również, że ten wirus może być krzyżowo neutralizowany przez końską surowicę anty-SARS-CoV (dar od L.-F. Wang) w rozcieńczeniach 1:40; jednak potencjał reaktywności krzyżowej z przeciwciałami SARS-CoV musi być potwierdzony z surowicą anty-SARS-CoV od ludzi (Tabela danych rozszerzonych 4).

ACE2 jest znany jako receptor komórkowy dla SARS-CoV14. Aby ustalić, czy 2019-nCoV również wykorzystuje ACE2 jako receptor wejścia komórkowego, przeprowadziliśmy badania zakaźności wirusa przy użyciu komórek HeLa, które wyrażały lub nie wyrażały białka ACE2 od ludzi, podkowców chińskich, cywet, świń i myszy. Wykazaliśmy, że 2019-nCoV jest w stanie wykorzystać wszystkie białka ACE2, z wyjątkiem mysiego ACE2, jako receptor wejściowy do wejścia do komórek wykazujących ekspresję ACE2, ale nie komórek, które nie wyrażają ACE2, co wskazuje, że ACE2 jest prawdopodobnie receptorem komórkowym, przez który 2019-nCoV wchodzi do komórek (Fig. 3). Pokazujemy również, że 2019-nCoV nie wykorzystuje innych receptorów koronawirusowych, takich jak aminopeptydaza N (APN) i peptydaza dipeptydylowa 4 (DPP4) (Extended Data Fig. 7).

Badanie dostarcza szczegółowego raportu na temat 2019-nCoV, prawdopodobnego czynnika etiologicznego odpowiedzialnego za trwającą epidemię zespołu ostrej niewydolności oddechowej w Chinach i innych krajach. Specyficzne dla wirusa nukleotydy-dodatnie i serokonwersję wirusowo-białkową zaobserwowano u wszystkich badanych pacjentów i dostarcza dowodów na związek między chorobą a obecnością tego wirusa. Nadal jednak pozostaje wiele pilnych pytań, na które należy odpowiedzieć. Związek między 2019-nCoV a chorobą nie został zweryfikowany za pomocą doświadczeń na zwierzętach, aby spełnić postulaty Kocha w celu ustalenia związku przyczynowego między mikroorganizmem a chorobą. Nie znamy jeszcze przebiegu transmisji tego wirusa między gospodarzami. Wygląda na to, że wirus staje się coraz bardziej przenoszony między ludźmi. Powinniśmy ściśle monitorować, czy wirus nadal ewoluuje i staje się bardziej zjadliwy. Ze względu na brak specyficznych metod leczenia i biorąc pod uwagę pokrewieństwo 2019-nCoV z SARS-CoV, niektóre leki i przedkliniczne szczepionki przeciwko SARS-CoV mogłyby prawdopodobnie być stosowane w leczeniu tego wirusa. Wreszcie, biorąc pod uwagę szerokie rozprzestrzenianie się SARSr-CoV w ich naturalnych rezerwuarach, przyszłe badania powinny być skoncentrowane na aktywnym nadzorze tych wirusów w szerszych regionach geograficznych. W perspektywie długoterminowej należy przygotować leki przeciwwirusowe o szerokim spektrum działania oraz szczepionki na pojawiające się w przyszłości choroby zakaźne wywoływane przez tę grupę wirusów. Co najważniejsze, należy wdrożyć ścisłe przepisy przeciwko udomowieniu i konsumpcji dzikich zwierząt.

Uwaga dodana w dowodzie: Od czasu przyjęcia tej pracy, ICTV oznaczyła wirusa jako SARS-CoV-215; ponadto WHO wydała oficjalną nazwę choroby wywoływanej przez tego wirusa, która brzmi COVID-1916.

.