Alai

Faktor von Willebranda, ADAMTS13, and Thrombotic Thrombocytopenic Purpura

VWF jest syntetyzowany przez duży gen na chromosomie 12p13.31, który rozciąga się na 178 kb i zawiera 52 eksony.49 Messenger RNA (mRNA) wytwarzany przez ten gen określa polipeptyd o długości 2813 aminokwasów, który zawiera 22-aminokwasowy peptyd sygnałowy, 742-aminokwasowy propeptyd i 2050-aminokwasową sekwencję tworzącą monomeryczny blok budulcowy VWF występującego w osoczu. Po rozszczepieniu peptydu sygnałowego w retikulum endoplazmatycznym, monomery zawierające propeptyd są łączone w dimery poprzez międzyłańcuchowe wiązania disulfidowe z udziałem reszt Cys w pobliżu C-końca cząsteczki. Te dimery są następnie transportowane do aparatu Golgiego, gdzie propeptyd katalizuje międzydimerowe wiązania disiarczkowe pomiędzy resztami w domenie D3, dając długie multimery składające się z dimerów połączonych „łeb w łeb”, zawierających N-końce na obu końcach. Propeptyd jest następnie rozszczepiany przez enzym podobny do furiny, a większość powstałego ULVWF jest pakowana do ziarnistości magazynujących w celu późniejszego regulowanego wydzielania.

Tylko dwa typy komórek są znane z syntezy VWF: komórki śródbłonka i megakariocyty. W komórkach śródbłonka VWF jest przechowywany w granulkach zwanych ciałkami Weibela-Palade’a; w płytkach krwi jest przechowywany w α-granulkach. Większość VWF we krwi jest pochodzenia śródbłonkowego. Wiele bodźców może indukować uwalnianie śródbłonkowego VWF, w tym epinefryna, desamino-wazopresyna (DDAVP), histamina, trombina, toksyny Shiga i cytokiny prozapalne, w tym czynnik martwicy nowotworów (TNF)-α, interleukina (IL)-8 i IL-6 (w kompleksie z receptorem dla IL-6).50 Inne czynniki również mogą indukować uwalnianie VWF przez śródbłonek, co dostarcza wskazówek na temat niektórych czynników wywołujących TTP. Czynniki te obejmują wirusy, takie jak adenowirus51 i utleniacze, takie jak nadtlenek.52 Utleniacze nie tylko mają zdolność indukowania wydzielania ULVWF; mogą również utleniać VWF, czyniąc go nieusuwalnym przez ADAMTS1353 i bardziej adhezyjnym.54 Ponadto utleniacze, zwłaszcza te wytwarzane przez neutrofile i monocyty podczas zapalenia, mogą utleniać kluczową resztę metioninową w domenie katalitycznej ADAMTS13 i unieczynniać enzym.55.

Zarówno komórki śródbłonka, jak i płytki krwi uwalniają multimery VWF, które są większe niż multimery w prawidłowym osoczu.56 Te multimery ULVWF są nie tylko znacznie większe niż multimery normalnie występujące w osoczu; są one również znacznie bardziej adhezyjne i zdolne do spontanicznego wiązania się z płytkowym receptorem VWF – glikoproteiną Ib (GPIbα; największy polipeptyd kompleksu GPIb-IX-V) z siłą wiązania większą niż ta, którą uzyskuje się przy wiązaniu osoczowego VWF z GPIbα w obecności modulatorów – ristocetyny lub botrocetyny.57 In vivo przekłada się to na zdolność ULVWF do wiązania płytek krwi przy braku lub niskim naprężeniu ścinającym, podczas gdy przetworzony osoczowy VWF wymaga rozwinięcia wywołanego wysokim naprężeniem ścinającym, aby związać płytki krwi.58

Część nowo uwolnionego ULVWF bezpośrednio dostaje się do krwi krążącej, podczas gdy inna frakcja pozostaje przyczepiona do śródbłonka, gdzie multimery ULVWF mogą samoistnie łączyć się w łańcuchy o długości od kilkuset mikrometrów do kilku milimetrów, które pozostają zakotwiczone na powierzchni śródbłonka.59 Powierzchniowo związane łańcuchy ULVWF są hiperadhezyjne i spontanicznie wiążą płytki krwi, tworząc pokryte płytkami krwi łańcuchy o wyglądzie „koralików na sznurkach” na powierzchni śródbłonka. Pod wpływem fizjologicznych naprężeń ścinających, ozdobione płytkami krwi ULVWF struny są rozszczepiane przez ADAMTS13 i usuwane z powierzchni śródbłonka. Dalsze przetwarzanie, które nie jest jeszcze w pełni scharakteryzowane, powoduje, że VWF nie jest w stanie spontanicznie wiązać płytek krwi. Nagromadzenie ozdobionych płytkami krwi łańcuchów ULVWF na powierzchni śródbłonka w wyniku zmniejszonego stężenia lub braku ADAMTS13 w krążeniu inicjuje zakrzepicę mikronaczyniową, która prowadzi do powstawania i odkładania się bogatych w płytki krwi skrzeplin hialinowych w mikrokrążeniu – co jest charakterystyczne dla TTP.

Skręgi ULVWF składają się z wiązek multimerów VWF, a każdy z nich jest przywiązany do powierzchni śródbłonka w kilku miejscach zakotwiczenia. W przypadku braku (lub niskich stężeń) Ca2+ i Mg2+ sznurki ULVWF przyczepiają się do powierzchni śródbłonka poprzez wiązanie się z selektyną P.60 W obecności fizjologicznych stężeń kationów dwuwartościowych nitki ULVWF zakotwiczają się do powierzchni śródbłonka poprzez oddziaływanie z integryną αvβ3.61 W to zakotwiczenie nitek VWF niewątpliwie zaangażowane są inne cząsteczki, ale jak dotąd nie zostały one zidentyfikowane.

Zdolność multimerów VWF lub ULVWF do samoasocjacji w grubsze włókna i kable staje się ważnym mechanizmem regulacji właściwości adhezyjnych VWF. Savage i wsp. wykazali, że pod wpływem naprężeń ścinających i w obecności płytek krwi, multimery VWF w fazie płynnej homotypowo i odwracalnie łączą się z multimerami VWF, które są unieruchomione na powierzchni kolagenu; samoasocjujące multimery VWF wspierają adhezję płytek krwi pod wpływem naprężeń ścinających.62 Multimery VWF w fazie płynnej mogą również asocjować się z łańcuchami ULVWF przymocowanymi do powierzchni śródbłonka,63 a samoasocjację ułatwia częściowe rozłożenie cząsteczek VWF wywołane naprężeniem ścinającym64,65 lub związanie ristocetyny.66 Samoasocjujące multimery VWF tworzą sieć usieciowanych włókien na powierzchniach kolagenu64 lub w roztworze.66 Pod wpływem naprężeń ścinających multimery VWF w fazie płynnej mogą również łączyć się z multimerami VWF związanymi z płytkami krwi poprzez interakcję z GPIbα na powierzchniach płytek krwi.67 Samoasocjacja VWF na powierzchniach płytek może wywoływać aktywację płytek, promować agregację płytek i zwiększać wzrost skrzepliny.

Zdolność VWF do samoasocjacji pozwala mu wytwarzać sploty, które rywalizują lub przewyższają długość i grubość tych wytwarzanych przez polimeryzację fibryny. W syntetycznych mikronaczyniach pobudzonych do wydzielania VWF przez stymulację agonistyczną, VWF wydzielany ze ściany naczynia może łączyć się w nici zdolne do rozciągania się w świetle naczynia, szczególnie w miejscach rozwidleń i zakrętów.68 Zdolność VWF do tworzenia nici i kabli o tak ogromnych rozmiarach i rozciągania tych kabli w poprzek drogi przepływu nie tylko zwiększa szanse na wychwycenie płytek krwi przez nici, ale także zwiększa ich zdolność do rozdrabniania erytrocytów na schistocyty.

Samoistna asocjacja VWF jest regulowana nie tylko przez stres ścinający, ale także przez czynniki osoczowe, które prawdopodobnie mogą zmieniać przebieg i ciężkość epizodów TTP. Samoasocjacja VWF jest osłabiana przez lipoproteiny o dużej gęstości (HDL) i przez apoliproteinę (Apo) A-I, główny składnik białkowy w HDL. Oba te czynniki znacząco zmniejszają długość i grubość włókien VWF unieruchomionych na powierzchni śródbłonka. Adhezja płytek krwi do tych hiperadhezyjnych struktur jest również zmniejszona proporcjonalnie do zmniejszenia ilości samoasocjowanego VWF. W modelu TMA u myszy pozbawionych ADAMTS13, HDL również znacząco łagodził trombocytopenię wywołaną infuzją dużych dawek ludzkiego VWF.69 Zgodnie ze zdolnością ApoA-I do modulowania samoasocjacji VWF, jego stężenie w osoczu koreluje odwrotnie z poziomem hiperadhezyjnych VWF u pacjentów z TTP i sepsą. Wyniki te sugerują, że ingerencja w samoasocjację VWF może być nowym podejściem do leczenia zaburzeń zakrzepowych związanych z hiperadhezyjnym VWF, w tym TTP.

Metaloproteaza rozszczepiająca VWF jest 13. członkiem rodziny 18 odrębnych enzymów typu ADAMTS zidentyfikowanych do tej pory, które mają podobieństwa strukturalne.16,17 ADAMTS13 składa się z N-końcowej domeny metaloproteazy typu reprolizyny (M), a następnie domeny dezintegryny (D), domeny podobnej do trombospondyny-1 (T), domeny bogatej w cysteinę (C), która zawiera sekwencję argininy-glicyny-asparaginianu, domenę dystansową (S), siedem dodatkowych domen trombospondinopodobnych (T2-8) oraz dwie nieidentyczne domeny typu CUB (CUB1-2) na C-końcowym końcu cząsteczki (ryc. 24.2). 24.2). Domeny CUB zawierają sekwencje peptydowe podobne do podskładników dopełniacza C1r/C1s, embrionalnego białka jeżowca egf i białka morfogenicznego kości-1.70 ADAMTS13 jest 190 000-daltonową glikoproteiną wymagającą Zn2+ i Ca2+, której gen znajduje się na chromosomie 9q34 i jest wytwarzany głównie w komórkach gwiaździstych wątroby.71,72 ADAMTS13 jest hamowany przez EDTA; dlatego funkcjonalne oznaczenia enzymu najlepiej przeprowadzać na osoczu z cytrynianem.12,14-17,73-77 Osocze antykoagulowane heparyną, chlorometyloketonami (np. chlorometyloketon fenyloalaninowo-prolinowo-asparaginianowy), hirudyną i innymi bezpośrednimi inhibitorami trombiny (DTI) również byłoby zadowalające do badań. Surowica odpowiednio traktowana inhibitorami proteazy jest również odpowiednia do badania.78

Rozszczepienie VWF przez ADAMTS13 zależy od zmian konformacyjnych VWF wywołanych przez naprężenie ścinające, siłę, która zmienia konformację multimerów VWF z globularnej na otwartą.79 Po tym przejściu konformacyjnym następuje rozwinięcie jednej lub więcej domen A2 w obrębie multimeru VWF, narażając wiązanie peptydowe Tyr1605-Met1606 na rozszczepienie przez ADAMTS1379 lub utlenienie Met1606 przez podchloryn.54 Oprócz siły ścinania, przejście do dostępnej konformacji jest również ułatwione przez zmiany w strukturze domeny A2 spowodowane przyłączeniem węglowodanów,80 substytucje aminokwasów w VWD typu 2A, które destabilizują składanie domeny A2,81 i mutacje w VWD typu 2B82 i wiązanie ristocetyny,83 z których oba jednocześnie odsłaniają domenę A1 do wiązania płytek krwi i miejsca rozszczepienia ADAMTS13.

Rozpoznanie i rozszczepienie VWF przez ADAMTS13 było szeroko badane. Ostatnie dowody wskazują, że w natywnej cząsteczce ADAMTS13, C-końcowe domeny T8-CUB są w kontakcie z N-końcowymi domenami MDTCS, interakcji wewnątrzcząsteczkowej, która częściowo hamuje zdolność domen MDTCS do wiązania i rozszczepiania substratu peptydowego VWF-78. W tej natywnej konformacji ADAMTS13 jest częściowo autoinhibitowany.84,85 Zdolność ADAMTS13 do składania się do tej konformacji jest najwyraźniej ułatwiona przez elastyczność nadaną przez cztery przypuszczalne sekwencje łącznikowe znajdujące się między domenami T1 i T2, T2 i T3, T4 i T5 oraz T8 i CUB1.86 Autoinhibicja ulega złagodzeniu, gdy domeny C-końcowe są albo obcięte, albo związane przez przeciwciała lub multimeryczny VWF, co pozwala na zaangażowanie domen MDTCS w substrat.

Na podstawie analiz mutacji, badań wiązania, analiz kinetycznych i wykorzystania syntetycznych substratów peptydowych zidentyfikowano wiele miejsc interakcji między konformacyjnie aktywnym ADAMTS13 a rozwiniętą domeną A2 VWF i podsumowano je w modelu molekularnego zamka błyskawicznego,87 jak przedstawiono schematycznie na ryc. 24.3. Przy ekspozycji multimerycznego VWF na krytyczny poziom naprężeń ścinających, najpierw dochodzi do ekspozycji egzozytu w domenie A2. Egzozyt ten obejmuje region helikalny Glu1660-Arg1668, który znajduje się 65 aminokwasów C-końcowych od miejsca rozszczepienia i wiąże się z domeną dystansową ADAMTS13 z wysokim powinowactwem (KD ~ 10 nM).88-90 Naprężenie ścinające powoduje również ekspozycję drugiego egzozytu o niskim powinowactwie w domenie A2 w miejscu lub w pobliżu Asp1614 (miejsce P9′), który oddziałuje z Arg349 w domenie dezintegrynowej ADAMTS13.91 Interakcja tych dwóch egzoitów z komplementarnymi regionami w ADAMTS13 pozycjonuje miejsce rozszczepienia Tyr1605-Met1606 w VWF z aktywnym centrum w domenie metaloproteazy ADAMTS13. Obejmuje to interakcję Leu1603 (miejsce P3) w VWF z komplementarnymi Leu198, Leu232 i L272 (miejsce S3) w ADAMTS13, Tyr1605 (miejsce P1) w VWF z Leu151 i Val195 (miejsce S1) w ADAMTS13 oraz Met1606 (miejsce P1′) w VWF z Asp252-Pro256 (miejsce S1′) w ADAMTS13.92 Analiza fagowa i losowe mutacje potwierdzają i pokazują, że aminokwasy w regionie P3-P2′ i P11′ (Ile1616) są również ważne dla rozszczepiania.93 Tak więc sekwencyjna interakcja tych komplementarnych regionów w dwóch białkach wielodomenowych ułatwia specyficzne rozszczepienie wiązania scissile.

Niezdolność do degradacji multimerów ULVWF od dawna podejrzewano o powodowanie rodzinnych i nabytych idiopatycznych typów TTP lub o predysponowanie osoby do tych zaburzeń (ryc. 24.4).11,94 Krytyczne eksperymenty przeprowadzone w celu zweryfikowania tej koncepcji zostały zgłoszone w 1997 i 1998 roku. Wykazano, że u czterech pacjentów z przewlekłą nawracającą TTP występuje niedobór aktywności ADAMTS13 w osoczu.12 Ponieważ nie wykryto inhibitora enzymu, niedobór ten przypisano nieprawidłowościom w produkcji, przetrwaniu lub funkcji proteazy. W ciągu następnego roku wyjaśniono patogenezę częściej występującej nabytej idiopatycznej postaci TTP.13-15 Pacjenci z nabytą idiopatyczną TTP mieli niewielką lub żadną aktywność ADAMTS13 w osoczu podczas ostrych epizodów, ale aktywność ta wzrastała w kierunku normy po wyzdrowieniu. Chociaż testy osoczowe w tych badaniach nie były fizjologiczne, były one jednak innowacyjne i pouczające. Autoprzeciwciała immunoglobuliny (Ig) G przeciwko enzymowi prawdopodobnie odpowiadają za brak aktywności proteazy u większości pacjentów z nabytą idiopatyczną TTP.13-15 Przyczyny tej przejściowej dysregulacji immunologicznej, jak również selektywnego antygenowego ukierunkowania proteazy rozszczepiającej VWF, nie są jeszcze znane.

Pacjenci z rodzinną przewlekłą nawracającą TTP często mają multimery ULVWF w osoczu.11,94 Multimery ULVWF są wykrywane przy użyciu czułej metody elektroforezy w żelu agarozowym w niektórych próbkach osocza pacjentów podczas ostrych epizodów nabytej idiopatycznej TTP, ale nie po wyzdrowieniu.94 Wyniki te zostały wyjaśnione przez badaczy, którzy odkryli przewlekły brak ADAMTS13 w osoczu w rodzinnej przewlekłej nawracającej TTP, jak również przemijające zahamowanie enzymu podczas ostrych epizodów nabytej idiopatycznej TTP.12-15

Większość pacjentów z rodzinną TTP ma mniej niż 5% normalnej aktywności ADAMTS13 w osoczu, niezależnie od tego, czy osocze jest uzyskiwane podczas czy po ostrych epizodach (pod warunkiem, że nie otrzymywali ostatnio wlewów osocza). Większość pacjentów z nabytą idiopatyczną TTP ma mniej niż 5% normalnej aktywności ADAMTS13 w osoczu tylko podczas ostrych epizodów TTP.12-15,24,95 Poważny niedobór aktywności ADAMTS13 w osoczu pacjentów z TTP koreluje z niezdolnością do rozszczepiania multimerów ULVWF w miarę ich wyłaniania się z powierzchni komórek śródbłonka (patrz ryc. 24.4).59 W konsekwencji multimery ULVWF wydzielane przez komórki śródbłonka pozostają zakotwiczone do tych komórek i samoistnie łączą się w długie łańcuchy59 i są zdolne do wychwytywania przechodzących płytek krwi poprzez wiązanie płytkowych GPIbα (ryc. 24.5).68 (Ryc. 24.6). 24.5).68 (Płytki krwi nie wiążą się spontanicznie z mniejszymi formami VWF, które krążą po rozszczepieniu multimerów ULVWF.)56 Dodatkowe płytki krwi dołączają następnie do rosnącego agregatu płytek krwi (rekrutowane do agregatu przez aktywowaną αIIbβ3), który może urosnąć do punktu, w którym zatka naczynie (patrz ryc. 24.4).59,96 Chociaż w większości przypadków idiopatycznej TTP występuje ciężki niedobór ADAMTS13, w pewnej podgrupie nie występuje ciężki niedobór aktywności enzymu mierzony za pomocą obecnie dostępnych testów.97 Nie jest jeszcze jasne, czy jest to spowodowane zakłóceniem aktywności enzymu przez przeciwciała niewykrywalne przez dostępne testy, opornością VWF na rozszczepienie (np. z powodu modyfikacji oksydacyjnej),53 czy innymi przyczynami. Mimo to prawdopodobnie wielu pacjentów z tej kategorii nadal będzie odnosiło korzyści z terapii wymianą osocza.98 Należy również podkreślić, że niedobór ADAMTS13 nie jest ani czuły, ani swoisty (aktywność ADAMTS13 jest zmniejszona w wielu innych zaburzeniach)99 dla postawienia rozpoznania nabytej TTP.

Pręgi ULVWF są zdolne do odłączania się od komórek śródbłonka przy braku aktywności ADAMTS13, ulegając mechanicznemu zerwaniu wraz ze wzrostem napięcia generowanego przez naprężenia ścinające płynu w miarę przylegania i agregacji płytek krwi.59 Oderwane łańcuchy ULVWF-płytkowe mogą okluzywać kolejne mikronaczynia, przyczyniając się do niedokrwienia narządów.

Aktywność ADAMTS13 we krwi jest prawie zawsze nieobecna lub poważnie zmniejszona u pacjentów z rodzinną TTP,12,100,101 w konsekwencji homozygotycznych lub złożonych heterozygotycznych mutacji genu ADAMTS13.18,24,95,102,103 Mutacje w rodzinnej TTP zostały wykryte w całym genie w regionach kodujących różne domeny (patrz ryc. 24.2). W przypadku ciężkiego wrodzonego niedoboru aktywności ADAMTS13 epizody TTP rozpoczynają się zwykle w okresie niemowlęcym lub dziecięcym. U niektórych pacjentów jawne epizody TTP nie pojawiają się jednak przez wiele lat (np. podczas pierwszej ciąży),102 jeśli w ogóle występują. Ta ostatnia obserwacja sugeruje, że u niektórych pacjentów pozostaje resztkowa aktywność ADAMTS13, a ostre epizody TTP są wywoływane, gdy uwalnianie ULVWF z komórek śródbłonka przekracza ograniczoną zdolność ich przetwarzania przez ADAMTS13. Jednym z przypadków, w których może się to regularnie zdarzać, jest ciąża: Wiadomo, że stężenie VWF wzrasta podczas ciąży.104-106 Zgodnie z tym poglądem u kobiet z wrodzoną TTP często rozpoznaje się ją podczas pierwszej ciąży.29 U niemowląt z noworodkowym początkiem wrodzonej TTP i mniej niż 5% aktywnością ADAMTS13 przemijająca lub postępująca niewydolność nerek jest często istotnym elementem zaburzenia.107 Pacjenci ci klinicznie przypominają dwóch pacjentów opisanych w 1960 r. przez Schulmana i współpracowników108 oraz w 1978 r. przez Upshaw109; w związku z tym ta podgrupa dziecięca jest czasami określana jako posiadająca „zespół Upshaw-Schulmana.”

U wielu pacjentów z nabytą TTP aktywność ADAMTS13 w osoczu jest nieobecna lub znacznie zmniejszona podczas ostrych epizodów, a następnie wzrasta w miarę powrotu do zdrowia, zarówno w przypadku pojedynczych, jak i nawracających epizodów.13-15 Autoprzeciwciała IgG, które hamują aktywność ADAMTS13 w osoczu można wykryć u 44% do 94% tych pacjentów.13-15,102,110,111 Wyniki te sugerują obecność przejściowego lub okresowo nawracającego defektu w regulacji immunologicznej u wielu pacjentów, którzy mają nabytą idiopatyczną TTP związaną z niedoborem ADAMTS13. Przeciwciała hamujące osoczowy ADAMTS13 zidentyfikowano również u kilku pacjentów z TTP związaną z tiklopidyną lub klopidogrelem.34,112 Nie wiadomo jeszcze, czy przemijający poważny defekt wytwarzania lub przeżycia ADAMTS13 występuje u pacjentów z nabytą TTP, u których nie stwierdza się wykrywalnych autoprzeciwciał przeciwko temu enzymowi. Alternatywnie, niewykrycie autoprzeciwciał hamujących u niektórych pacjentów może odzwierciedlać ograniczoną czułość obecnie stosowanych systemów testowych. Nieinhibicyjne autoprzeciwciała, które mogłyby się wiązać i potencjalnie pośredniczyć w immunologicznym usuwaniu ADAMTS13, nie są wykrywane przez obecny system testowy.

W jednym z badań oceniano epitopy ADAMTS13 rozpoznawane przez poliklonalne autoprzeciwciała u 25 pacjentów z nabytą TTP,113 stwierdzając, że cele przeciwciał niezmiennie obejmowały sekwencję domeny bogatej w cysteinę/spacer (CS); u 3 pacjentów był to jedyny region, na który skierowane były przeciwciała. Pozostałe 22 autoprzeciwciała reagowały z sekwencją domeny CS oraz domenami CUB (64%), sekwencją metaloprotezy/dezintegryny/pierwszej domeny trombospondyny-1 (MDT) (56%) lub regionem zawierającym drugie do ósmego powtórzenia trombospondyny-1 (T2-8, 28%) (patrz ryc. 24.2). Region propeptydowy był również identyfikowany przez 20% autoprzeciwciał,113 co wskazuje, że usunięcie propeptydu nie jest wymagane do wydzielania aktywnego enzymu.114 Autoprzeciwciała hamują aktywność ADAMTS13 lub zmniejszają jego przeżywalność. W innym badaniu obejmującym siedmiu pacjentów Luken i wsp.115 zidentyfikowali autoprzeciwciała ADAMTS13 u sześciu pacjentów, które wiązały się wyłącznie w obrębie domeny dystansowej (S); u siódmego pacjenta przeciwciała wiązały się zarówno z domeną S, jak i z powtórzeniami T2-8. Za pomocą mutagenezy badacze ci ustalili, że regiony Thr572-Asn579 i Val657-Gly666 w domenie dystansowej ADAMTS13 są wspólnymi epitopami dla wiązania autoprzeciwciał.116 Gdy Arg660, Tyr661 lub Tyr665 zastąpiono alaniną, wiązanie autoprzeciwciał pochodzących od sześciu pacjentów z TTP zostało wyeliminowane.117

Autoprzeciwciała przeciwko ADAMTS13 u pacjentów z nabytą TTP należą głównie do klasy IgG,118 chociaż wykryto również przeciwciała klasy IgM i IgA.119 Klonowanie i sekwencjonowanie przeciwciał monoklonalnych pochodzących od pacjentów z nabytą TTP wykazuje, że istnieje preferencyjne wbudowywanie segmentu genu łańcucha ciężkiego VH1-69 do regionu zmiennego immunoglobulin.120,121 Preferencja ta sugeruje, że region CDR2 lub CDR3 regionu VH1-69 może przyczyniać się do specyficzności dla epitopu na domenie dystansowej ADAMTS13. W analizie dystrybucji podtypów przeciwciał u 58 pacjentów z ostrą nabytą TTP wykryto przeciwciała należące do wszystkich podtypów IgG.118 Najbardziej rozpowszechnionym podtypem była IgG4, obecna u 90% pacjentów, sama lub w połączeniu z innymi podtypami IgG.

Produkcja autoprzeciwciał ADAMTS13 jest prawie na pewno uwarunkowana genetycznie. Fakt ten podkreśla odkrycie u sióstr bliźniaczek nabytej TTP spowodowanej autoprzeciwciałami ADAMTS13.122 Nawroty występują u 23% do 44% pacjentów z nabytą TTP,102,110,123,124 często w ciągu pierwszego roku po pierwszym epizodzie.102 Nawroty są najczęstsze wśród pacjentów z najniższymi poziomami aktywności ADAMTS13 (<10%).

Ciąża i okres poporodowy stanowią szczególne wyzwanie w odniesieniu do TTP. Po pierwsze, stan przedrzucawkowy i zespół HELLP (hemoliza, podwyższone enzymy wątrobowe, mała liczba płytek krwi) mają wiele cech klinicznych, które pokrywają się z TTP i mogą mieć pewne wspólne cechy patofizjologiczne, takie jak układowa dysfunkcja śródbłonka i białkomocz (patrz rozdział 32).125 Zespół HELLP może być szczególnie trudny do odróżnienia od TTP, ponieważ również objawia się mikroangiopatyczną niedokrwistością hemolityczną, podwyższonym stężeniem LDH i małopłytkowością (choć zwykle nie tak ciężką jak w TTP).126 TTP w ciąży może być związana z autoprzeciwciałami przeciwko ADAMTS13, a choroba zwykle ujawnia się w okresie okołoporodowym lub po porodzie.127 Szacunkowe oceny ryzyka nawrotu choroby w kolejnych ciążach są bardzo zróżnicowane i wynoszą od 26% do 73% na ciążę.102

Aktywność ADAMTS13 w osoczu u zdrowych dorosłych wynosi od około 50% do 178% normalnego osocza przy użyciu obecnie dostępnych testów statycznych. Zmniejszoną aktywność ADAMTS13 stwierdzono również w chorobach wątroby, rozsianych nowotworach złośliwych,128 układowych zespołach zapalnych, takich jak te wywołane przez endotoksynę,129 ostrym zapaleniu trzustki,130 ciężkiej sepsie i wstrząsie septycznym,131 DIC wywołanym przez sepsę,132 i zaburzeniach czynności narządów wywołanych przez sepsę.133-135 Ponadto niskie poziomy ADAMTS13 można stwierdzić w ciąży i u noworodków.136 Z wyjątkiem kobiet w okresie okołoporodowym, u których rozwija się jawna TTP,102,110 aktywność ADAMTS13 obserwowana u pacjentów z tymi stanami nie jest zmniejszona do skrajnie niskich wartości (<5% normy) występujących u większości pacjentów z rodzinną lub nabytą TTP.

Atesty ADAMTS13

Atesty ADAMTS13 określają aktywność proteolityczną, poziom antygenu i poziom autoprzeciwciał anty-ADAMTS13. Wczesne oznaczenia aktywności ADAMTS13 opierały się na degradacji oczyszczonych multimerów VWF w obecności czynników denaturujących i ilościowym oznaczaniu produktów rozpadu metodą immunoblottingu,74,75 wiązania resztkowego kolagenu,137 lub zmniejszonej agregacji płytek indukowanej ristocetyną.138 Chociaż oznaczenia te są czułe, ich wykonanie jest kłopotliwe i czasochłonne oraz wymaga użycia środków denaturujących. Badania te zostały wyparte po tym, jak badania rekombinowanych fragmentów VWF ujawniły minimalne sekwencje niezbędne do pomiarów aktywności. Kokame i wsp. dokonali częściowej delecji domeny A2 VWF i zidentyfikowali minimalny peptyd składający się z 73 aminokwasów (VWF73, Asp1596-Arg1668), który był wydajnie rozszczepiany przez ADAMTS13 przy braku denaturantów w warunkach statycznych.88 Następnie opracowano kilka testów opartych na rozszczepianiu peptydów obejmujących VWF73, takich jak przeniesienie energii rezonansu fluorescencji (FRET),97 wiązanie HRP z VWF78,139 ELISA,140 immunoblotting,141 i spektrometria mas142.

W 2008 roku przeprowadzono drugie międzynarodowe badanie w ramach współpracy w celu porównania wydajności ośmiu funkcjonalnych i trzech antygenowych testów dla ADAMTS13.143 Porównanie tych metod wykazało, że testy rozszczepienia oparte na zmodyfikowanych peptydach VWF jako substratach oferowały wysoką dokładność i odtwarzalność oraz niską wariancję i zmienność między metodami. Oznaczenie FRET-VWF73 jest od tego czasu szeroko stosowane do ilościowego oznaczania aktywności ADAMTS13 w próbkach pobranych od pacjentów. Chociaż badanie oparte na metodzie FRET jest łatwe do wykonania, ma ono kilka ograniczeń. Po pierwsze, rozszczepienie FRET-VWF73 przy użyciu osocza z cytrynianem jako źródła ADAMTS13 powinno być przeprowadzane w temperaturze poniżej 33°C, ponieważ znacząca nieodwracalna inaktywacja ADAMTS13 przez chelatowanie wapnia za pomocą cytrynianu występuje w temperaturze 37°C. Po drugie, optymalne wykrywanie sygnału fluorescencji wymaga przeprowadzenia rozszczepienia substratu FRET-VWF73 w pH 6,1, co zmniejsza szybkość rozszczepienia. Po trzecie, w tym suboptymalnym pH, niektóre hamujące autoprzeciwciała nie tworzą stabilnych kompleksów z ADAMTS13, a te przeciwciała pozostają niewykryte w badaniach inhibicji. Po czwarte, znaczne zakłócenia sygnału fluorescencji przez hemoglobinę i bilirubinę występują z powodu nakładania się widm. Opracowano ulepszony substrat peptydowy oparty na metodzie FRET, FRETS-rVWF71. Aktywność ADAMTS13 w surowicy i osoczu z cytrynianem lub heparynizowanym może być mierzona z tym ulepszonym substratem przy fizjologicznym pH, sile jonowej i stężeniu wapnia, bez zakłóceń ze strony endogennych multimerów VWF, bilirubiny lub hemoglobiny w osoczu.78 Innym ograniczeniem tych testów aktywności opartych na peptydach jest to, że nie ocenia się zdolności ADAMTS13 do rozszczepiania multimerycznego VWF pod wpływem naprężeń ścinających. Chociaż wykazano, że naprężenia ścinające wytwarzane przez ciągłe worteksowanie promują rozszczepianie multimerów VWF,144 kwantyfikacja produktów rozszczepienia za pomocą immunoblottingu jest czasochłonna. Dostępne są co najmniej cztery komercyjne zestawy do pomiaru aktywności ADAMTS13 oparte na opisanych metodach. Zestawy te nie zostały jednak ocenione w bezpośrednich badaniach porównawczych i standaryzacyjnych.

Stężenia antygenu ADAMTS13 zostały określone ilościowo za pomocą przeciwciał monoklonalnych i poliklonalnych.145,146 Wpływ truncacji, mutacji i autoprzeciwciał na dokładność i czułość tych testów nie jest jasny. Dostępnych jest pięć komercyjnych zestawów testowych do pomiaru stężenia antygenu ADAMTS13, ale nie przeprowadzono walidacji i porównania z innymi testami.

W 2015 roku ustanowiono pierwszy międzynarodowy standard dla ADAMTS13 i przetestowano go w 32 laboratoriach z 14 krajów pod kątem aktywności ADAMTS13 i stężenia antygenu w stosunku do lokalnych standardów.147 Ten standard osocza, oznaczony WHO IS (12/252), uzyskano z połączonego osocza od 38 normalnych zdrowych dawców. Badanie to wykazało konsensusową średnią wartość 0,91 jednostek/mL aktywności ADAMTS13 dla tego osocza z międzylaboratoryjną zmiennością 12,4% i 0,92 jednostek/mL antygenu ADAMTS13 z międzylaboratoryjną zmiennością 16,3%. Duża zmienność międzylaboratoryjna nie wynikała głównie z użycia różnych lokalnych standardów, ale z różnic metodologicznych między laboratoriami.

Badania autoprzeciwciał anty-ADAMTS13 są zwykle wykonywane przez mieszanie inaktywowanego termicznie osocza pacjenta ze znaną ilością zebranego normalnego osocza i pomiar resztkowej aktywności ADAMTS13. Przeciwciała nieneutralizujące wykrywa się metodą immunoblottingu.148

Ale jak dotąd nie zidentyfikowano żadnego inhibitora swoistego dla ADAMTS13 bez przeciwciał, kilka białek i peptydów może hamować rozszczepianie VWF przez ADAMTS13 w specjalnych warunkach. Należą do nich hemoglobina, IL-6, trombospondyna-1 i α-defensyny neutrofilów. We wszystkich przypadkach czynniki hamujące najwyraźniej wiążą się z substratem, VWF, uniemożliwiając rozszczepienie VWF przez ADAMTS13. Wykazano, że hemoglobina działa w ten sposób, wiążąc prążki VWF na powierzchni śródbłonka pod wpływem przepływu i kompetycyjnie blokując rozszczepienie przez ADAMTS13.149 Mechanizm ten może przyczyniać się do powikłań naczyniowo-rozkurczowych u pacjentów z chorobą sierpowatokrwinkową ze znaczną hemolizą i dodatkowo komplikować TTP, gdy wskaźniki hemolizy są wysokie. Wysokie stężenia IL-6 (50 i 100 ng/mL) również hamują mediowane przez ADAMTS13 rozszczepianie śródbłonkowych łańcuchów ULVWF pod wpływem przepływu in vitro,50 sugerując, że mechanizm ten może przyczyniać się do zakrzepicy podczas burzy cytokinowej150 lub zespołu uwalniania cytokin.151 Trombospondyna-1, białko obficie występujące w α-granulach płytek krwi, które jest uwalniane do krążenia po aktywacji płytek, wiąże się z regionami A2-A3 VWF, kompetycyjnie blokując i hamując rozszczepianie przez ADAMTS13 in vitro.152 Ta prozakrzepowa właściwość trombospondin-1 jest zgodna z wadliwą rekrutacją płytek do aktywowanego lub uszkodzonego śródbłonka i zwiększoną embolizacją skrzeplin płytkowych obserwowaną u myszy pozbawionych trombospondin-1.153 Peptydy ludzkich neutrofilów, znane jako α-defensyny, uwalniane z aktywowanych neutrofilów, mogą wiązać się z domeną A2 VWF i kompetycyjnie blokować rozszczepienie mediowane przez ADAMTS13.154 Stężenia α-defensyn wzrastają nawet siedmiokrotnie w osoczu pacjentów z nabytą TTP.

.