4.2.1.2 Visible Spectrometric Methods
CBZ i PHT są dwoma AED, które są stosowane jednocześnie. W niniejszej pracy opisano metodę kalibracji PLS do jednoczesnego spektrofotometrycznego oznaczania CBZ i PHT w osoczu. Wzorcowe dwuskładnikowe mieszaniny CBZ i PHT zostały rozdzielone przez zastosowanie PLS-1 do ich widm UV. Następnie przygotowano dwuskładnikowe roztwory wzorcowe, które wprowadzono do osocza, a po ekstrakcji leków, odpowiadające im widma UV analizowano za pomocą regresji PLS w celu obliczenia stężenia leków w nieznanym osoczu. W celu znalezienia optymalnej liczby zmiennych utajonych przy użyciu PRESS zastosowano procedurę walidacji krzyżowej typu leave-one-out. Zastosowano również metodę HPLC do jednoczesnego oznaczania dwóch leków w osoczu i w metanolu. Średni odzysk uzyskany metodą PLS wynosił 98,4 i 98,2 dla CBZ i PHT, a metodą HPLC odpowiednio 100,1 i 101,7. Chociaż metoda HPLC wykazała lepszą wydajność niż PLS, stwierdzono, że wyniki uzyskane metodą PLS były porównywalne z wynikami uzyskanymi metodą HPLC.
Dwie metody spektrofotometryczne zostały zaproponowane do oznaczania OXC luzem i w postaciach dawek przy użyciu odczynnika fenolowego Folina-Ciocalteu (FCP) i chlorowodorku hydrazyny 3-metylo-2-benzotiazolinonu (MBTH) jako odczynników. Pierwsza metoda polega na dodaniu odczynnika FCP do OXC w środowisku alkalicznym, a następnie pomiarze absorbancji przy długości fali 760 nm (metoda A), a druga na dodaniu stałej objętości MBTH po potraktowaniu OXC chlorkiem żelaza i pomiarze absorbancji przy długości fali 456 nm (metoda B). W obu metodach ilość powstałego chromogenu odpowiada ilości OXC, a zmierzona absorbancja wzrasta liniowo wraz ze stężeniem OXC, co potwierdzają współczynniki korelacji 0,9985 i 0,9984 odpowiednio dla metody A i B. Układy spełniają prawo Beera dla stężeń 5-30 i 10-50 μg/mL, odpowiednio dla metod A i B. Obliczono, że pozorna molowa absorpcyjność wynosi 8,06 × 103 i 3,126 × 103 L/mol/cm, odpowiednio dla metod A i B. Obliczono, że LOD i LOQ wynoszą 1,6 i 5 μg/mL dla metody A oraz 3 i 10 μg/mL dla metody B. Stwierdzono, że niedokładności między- i śróddzienne metody mieszczą się w zakresie 1,1-1,7% i 0,9-1,1% dla metody A oraz 1,1-1,9% i 0,6-0,9% dla metody B. Dokładność mieściła się w zakresie 98,9-99,7% i 99,3-100,1% odpowiednio dla metod A i B. Nie zaobserwowano interferencji z powszechnie stosowanymi farmaceutycznymi substancjami pomocniczymi. Metody te zostały z powodzeniem zastosowane do oznaczania OXC w preparatach tabletkowych. CBZ ulega enzymatycznej biotransformacji poprzez epoksydację z wytworzeniem swojego metabolitu, CBZ-E. Zaproponowano prostą metodę spektrofotometryczną wspomaganą chemometrycznie do jednoczesnego oznaczania CBZ i CBZ-E w osoczu. W celu wyodrębnienia analitów z osocza zastosowano procedurę ekstrakcji cieczowej, a widma absorbancji UV uzyskanych roztworów poddano regresji PLS. Optymalna liczba zmiennych latentnych PLS została wybrana na podstawie wartości PRESS z walidacji krzyżowej typu leave-one-out. Dla porównania zastosowano również metodę HPLC. Odpowiednie średnie odzyski dla analizy CBZ i CBZ-E w mieszaninach syntetycznych wynosiły 102,57 (± 0,25)% i 103,00 (± 0,09)% dla PLS oraz 99,40 (± 0,15)% i 102,20 (± 0,02)%. Stężenia CBZ i CBZ-E oznaczono również u pięciu pacjentów metodą PLS i HPLC. Wyniki wykazały, że dane uzyskane metodą PLS były porównywalne z danymi uzyskanymi metodą HPLC .
Opracowano selektywną i czułą metodę oznaczania leków przeciwdrgawkowych wigabatryny (I) (CAS 60643-86-9) i gabapentyny (II) (CAS 60142-96-3). Metoda oparta jest na kondensacji leków poprzez ich grupy aminowe z acetyloacetonem i formaldehydem zgodnie z reakcją Hantzscha, dając silnie fluorescencyjne pochodne dihydropirydyny. Kolor żółto-pomarańczowy był również mierzony spektrofotometrycznie przy 410 i 415 nm, odpowiednio dla I i II. Wykresy absorbancja-stężenie były prostoliniowe w zakresie 10-70 i 20-140 μg/mL, odpowiednio dla I i II. Wykresy zależności stężenia od fluorescencji były liniowe w zakresie 0,5-10 i 2,5-20 μg/mL, a minimalne granice wykrywalności (S/N = 2) wynosiły 0,05 μg/mL (~ 2,1 × 10- 8 mol/L) i 0,1 μg/mL (~ 5,8 × 10- 7 mol/L), odpowiednio dla I i II. Metodę spektrofotometryczną zastosowano do oznaczania I i II w tabletkach. Procentowe wartości odzysku ± SD (n = 6) wynosiły odpowiednio 99,45 ± 0,13 i 98,05 ± 0,53. Metoda spektrofluorymetryczna została z powodzeniem zastosowana do oznaczania I i II w zanieczyszczonym moczu i osoczu ludzkim. Procentowy odzysk ± SD (n = 5) wynosił 98,77 ± 0,29 i 98,39 ± 0,53 dla moczu oraz 99,32 ± 0,74 i 98,90 ± 0,96 dla osocza, odpowiednio dla I i II. Nie stwierdzono interferencji z podawanymi jednocześnie lekami: kwasem walproinowym (CAS 99-66-1), difenylohydantoiną (CAS 57-41-0), fenobarbitalem (CAS 50-06-6), karbamazepiną (CAS 298-46-4), klonazepamem (CAS 1622-61-3), klobazamem (CAS 22316-47-8) czy cymetydyną (CAS 51481-61-9). Przedstawiono propozycję przebiegu reakcji. Omówiono zalety proponowanych metod w porównaniu z istniejącymi metodami.
Spektrofotometr w bliskiej podczerwieni (IR), optyka integrująca i superkomputer równoległo-wektorowy zostały wykorzystane do opracowania modelu matematycznego, który przewiduje szybkość rozpuszczania poszczególnych nienaruszonych tabletek na podstawie widm w bliskiej podczerwieni (r2 = 0,985). Każda tabletka może być analizowana w sposób nieniszczący przez spektrofotometr w czasie krótszym niż 1 min. Model pozwala na wykorzystanie setek długości fal bliskiej podczerwieni do określenia szybkości rozpuszczania, co prowadzi do zwiększenia dokładności. 0,5-ml próbka surowicy, zawierająca różne AED, pojedynczo lub w połączeniu, została zalkalizowana, pokryta izooktanem i poddana działaniu pary wodnej w obecności KMnO4. Widma produktów utleniania w warstwie organicznej rejestrowano w zakresie UV. Utlenione fenobarbiton i prymidon nie wykazują piku absorpcji; diazepam delta-max przy 228 nm; fenytoina przy 247 nm; a karbamazepina przy 247 i 372 nm. W związku z tym fenobarbiton i diazepam nie przeszkadzają w oznaczaniu ilościowym fenytoiny, ale karbamazepina tak. Udział karbamazepiny przy 247 nm został obliczony na podstawie absorpcji przy 372 nm i stosunku jej molowych współczynników ekstynkcji przy tych dwóch długościach fali. Zostało to odjęte od całkowitych wartości A247, aby uzyskać rzeczywiste wartości spowodowane fenytoiną. W ten sposób opracowano metodę jednoczesnej analizy karbamazepiny i fenytoiny w jednej próbce .
Karbamazepina i 5,5-difenylohydantoina są jednocześnie ekstrahowane ze 100 do 200 μL krwi za pomocą 1,2-dichloroetanu. 5,5-difenylohydantoina jest usuwana przez jednoetapowe przemywanie alkaliczne. Dichloroetan jest dalej przemywany kwasem, a następnie odparowywany do sucha. 5,5-difenylohydantoina jest oznaczana w przemywie alkalicznym za pomocą procedury benzofenonowej; karbamazepina jest oznaczana w wysuszonej pozostałości za pomocą procedury 9-metyloakrydyny opisanej wcześniej. Połączona metoda jest szybka, wiarygodna i ma próg wykrywalności mniejszy niż 0,1 mg/100 mL dla każdego leku .
Opisano spektrofotometryczną procedurę UV do mikrodeterminacji karbamazepiny we krwi, która jest oparta na oryginalnej metodzie 9-metyloakrydynowej zaproponowanej przez K.H. Beyer, K. Klinge, Arzneim. Forsch. 19 (1969) 1759-1760). Karbamazepina jest ekstrahowana z krwi za pomocą dichlorometanu, który jest następnie przemywany zasadą i kwasem. Podzielna część ekstrahenta jest odparowywana do sucha, a pozostałość ogrzewana krótko z kwasem chlorowodorowym w temperaturze 150°C. Po usunięciu niespecyficznych zakłóceń za pomocą n-heptanu, absorbancję produktu rearanżacji katalizowanej kwasem (9-metyloakrydyny) oznacza się przy 258 nm. Otrzymana w ten sposób procedura jest szybka, wiarygodna, czuła i specyficzna. Wymaga 100-200 μL próbki do pojedynczego oznaczenia, a próg wykrywalności wynosi mniej niż 0,1 mg/100 mL. Stwierdzono, że metoda ta jest odpowiednia do rutynowego stosowania klinicznego .
Opisano specyficzną metodę bezpośredniej chromatografii gazowej do oznaczania karbamazepiny i, półilościowo, 10,11-epoksykarbamazepiny w surowicy. Średni odzysk karbamazepiny wynosi 98%, a błąd dwukrotnego oznaczenia wynosi ± 4%. Metoda jest porównywana z klasyczną metodą spektrofotometryczną Herrmanna. W materiale 103 pacjentów średnie stężenie karbamazepiny w surowicy wynosiło 25,5 ± 12,8 μmol/L metodą GLC i 23,0 ± 12,6 μmol/L metodą spektrofotometryczną. Różnica ta była wysoce istotna. Objętość próbki krwi wynosi 1/10 objętości wymaganej w spektrofotometrii .
.