Alai

Krótka historia T. reesei

Najstarsze praktyki biotechnologiczne z wykorzystaniem grzybów do produkcji piwa, wina i sera mogą sięgać kilku tysiącleci wstecz, tj. do samych początków cywilizacji piśmienniczej. Dla porównania, odkrycie nitkowatej mezofilnej ascomycete Trichoderma reesei (potem Trichoderma viride) dla jej zdumiewającego potencjału do produkcji zewnątrzkomórkowych celulaz miało miejsce nieco ponad 70 lat temu. Początkowo potencjał destrukcyjny oryginalnej Trichoderma sp. wyizolowanej z gnijącego sprzętu armii amerykańskiej na Wyspach Salomona podczas II Wojny Światowej był postrzegany raczej jako problematyczny. Niemniej jednak, nie minęło wiele czasu, zanim naukowcy z Natick Army Research Laboratories prowadzeni przez Mary Mandels i Elwyna T. Reese, badacz nadający imię, starali się przekształcić ten problematyczny potencjał w celowe produkty. W badaniach przesiewowych 14,000 pleśni z Quartermaster Collection Trichoderma sp. QM6a wykazała wyjątkową zdolność do degradacji naturalnej krystalicznej celulozy. Oznaczenie „QM6a” dla ostatniego pozostałego oryginalnego izolatu Trichoderma, które identyfikowało go jako szóstą z sześciu kultur grzyba przechowywanych w Quartermaster Collection w Natick, pozostało. Ten szczególny szczep jest nie tylko uważany za szczep wzorcowy T. reesei, ale jest również szczepem, z którego pochodzą wszystkie mutanty stosowane obecnie w przemyśle.

Wówczas i obecnie, badania nad T. reesei były napędzane ideą, że jego wydzielane celulazy mogą mieć zmieniający grę wpływ na 200-letnią walkę o ekonomiczną produkcję paliw z odnawialnej, lignocelulozowej biomasy. Od tego czasu badania nad T. reesei stały się pionierską koncepcją enzymatycznego scukrzania celulozy poprzez synergiczne połączenie różnych aktywności celulaz i stworzyły podstawy dla naszego obecnego zrozumienia regulacji zaangażowanych enzymów. Jego główna celobiohydrolaza CBH1 (CEL7a) była również pierwszą sklonowaną eukariotyczną celulazą i pierwszą celulazą, której struktura została rozwiązana. Ważnym krokiem w kierunku przemysłowego zastosowania celulaz T. reesei było opracowanie w latach 70-tych XX wieku wydajnych procedur mutagenezy i badań przesiewowych szczepów. W kolejnych dwóch dekadach miano białka zewnątrzkomórkowego produkowanego przez oryginalny szczep QM6a można było zwiększyć nawet 20-krotnie dzięki programom mutagenezy na Uniwersytecie Natick i Rutgers. Te ostatnie zakończyły się wyizolowaniem szczepu RUT-C30 (gdzie „RUT” oznacza Rutgers). Chociaż złoty standard dla produkcji celulozy w przemyśle został zgłoszony jako wyższy niż 100 g/L, szczep ten nadal jest prototypowym hiperproducentem celulozy dostępnym w domenie publicznej z mianami białka zewnątrzkomórkowego osiągającymi 30 g/L na substracie indukującym celulazę – laktozie .

Początkowo jednak opracowano inne komercyjne zastosowania celulaz, ponieważ stało się jasne, że wydajne i kompletne scukrzanie biomasy lignocelulozowej do cukrów fermentowalnych wymaga o wiele więcej aktywności enzymatycznych niż początkowo przewidywano. Również i w tym przypadku badania prowadzone z udziałem T. reesei przyczyniły się do powstania nowych podstaw w enzymologii degradacji celulozy i hemicelulozy. Dzięki szybkiej mikroskopii sił atomowych udało się również zwizualizować degradację celulozy, pokazując, jak główna celobiohydrolaza CBH1/CEL7A przesuwa się jednokierunkowo wzdłuż powierzchni celulozy. Na początku lat 90-tych dostępne stały się techniki transformacji ułatwiające inżynierię genetyczną T. reesei. W ciągu następnej dekady technologie te odegrały kluczową rolę w uzyskaniu nowego wglądu w regulację enzymów i w zmianę profilu enzymatycznego wydzielanego przez grzyba. W tym czasie T. reesei był również jednym z pierwszych gospodarzy dla ekspresji białek ssaków, czego przykładem jest ekspresja cielęcej chymozyny pod wpływem sygnałów ekspresji cbh1 (cel7a) .

Pod koniec lat 90-tych Kuhls i wsp. odkryli, że Hypocrea jecorina jest w rzeczywistości formą płciową T. reesei, co jest powodem, dla którego w wielu późniejszych publikacjach używano H. jecorina jako nazwy gatunkowej zamiast T. reesei. Bardziej szczegółowe badania nad rozwojem płciowym doprowadziły do hipotezy, że szczep QM6a jest w rzeczywistości żeńsko sterylny, co następnie można było powiązać z mutacją w genie ham5 kodującym rusztowanie MAP-kinazy .

Przełom tysiącleci, który dla genetyki może być postrzegany jako zwrot od badania izolowanych genów i szlaków w kierunku badania całych genomów, był świadkiem pojawienia się T. reesei w tak zwanej Erze Genomowej. Pierwszym globalnym podejściem do badania ekspresji genów T. reesei było badanie transkryptomiczne przeprowadzone w 2003 roku przez Foremana i wsp. , którzy skonstruowali mikromacierze DNA oparte na cDNA odpowiadające ponad 5000 różnych transkryptów genomu T. reesei. Pięć lat później, sekwencjonowanie genomu i analiza oryginalnego izolatu T. reesei QM6a stworzyły podstawy do zastosowania na szeroką skalę badań genomu. W kolejnych latach, porównawcza analiza genomowa wielu szczepów hiper- i nieprodukujących celulozy doprowadziła do odkrycia potencjalnych nowych czynników zaangażowanych w hiperprodukcję celulozy, takich jak transport nukleocytoplazmatyczny, wakuolarny handel białkami i obrót mRNA. W analizach porównawczych wykorzystano fakt, że wszystkie szczepy T. reesei stosowane w badaniach naukowych i przemyśle pochodzą od szczepu QM6a. Sześćdziesiąt pięć lat po pierwszych badaniach Elwyna Reese’a nad degradacją celulozy przez T. reesei, zainstalowana na całym świecie zdolność produkcyjna biopaliw celulozowych wynosi obecnie 480,5 milionów litrów rocznie (MMLY) etanolu, z czego 380,5 MMLY (lub około 80%) produkuje się przy użyciu preparatów enzymatycznych T. reesei, takich jak Accellerase i Cellic (Rys. 1a). Bez wątpienia wysiłek ten wymagał dopracowania podstawowej technologii na kilku poziomach, w tym inżynierii procesu i obróbki wstępnej substratów. Mimo to, produkcja i optymalizacja preparatów enzymatycznych dla etapu scukrzania biomasy była i pozostaje jednym z kluczowych czynników decydujących o kosztach procesu produkcji etanolu z celulozy. Co więcej, produkcja enzymów z wykorzystaniem T. reesei nie ogranicza się jedynie do produkcji enzymów biorafineryjnych. W rzeczywistości, około 11% wszystkich preparatów enzymów technicznych zarejestrowanych przez Association of Manufacturers and Formulators of Enzyme Products jest produkowanych z wykorzystaniem T. reesei jako gospodarza ekspresyjnego (Rys. 1b, c). Wreszcie, T. reesei nadal utrzymuje swoje znaczenie w badaniach naukowych, czego przykładem jest ponad 100 artykułów badawczych dotyczących grzyba lub jego enzymów publikowanych każdego roku (Rys. 1d).

The T. reesei biomass enzyme mix: new insights and limitations

W naturze dekonstrukcja lignocelulozy rzadko jest realizowana przez pojedynczy organizm. Jest on raczej osiągany poprzez sekwencyjną kolejność i wspólny wysiłek kilku organizmów, które produkują wiele enzymów węglowodanowo-czynnych (CAZymes) do degradacji różnych polimerów. Nie jest więc zaskoczeniem, że wydzielana mieszanina celulaz T. reesei musiała zostać znacząco dostosowana, aby dostarczyć konkurencyjną cenowo formułę enzymatyczną do całkowitego scukrzania lignocelulozy. Wcześnie badacze zdali sobie sprawę, że preparaty T. reesei nie posiadają wystarczającej aktywności β-glukozydazy, ponieważ większość aktywności jest związana ze ścianą komórkową grzyba. W konsekwencji, zwiększona aktywność β-glukozydazy poprawia degradację celulozy, ponieważ przeciwdziała hamowaniu produktu przez celobiozę, która z kolei jest uwalniana przez wspólne działanie endoglukanaz i celobiohydrolaz. Ten mechanizm sprzężenia zwrotnego w przeciwnym razie poważnie spowalnia scukrzanie celulozy. Podobnie, pochodzące z hemicelulozy ksylo- i mannooligosacharydy hamują działanie celobiohydrolaz T. reesei, co silnie wskazuje, że wystarczająca aktywność β-ksylozydazy i β-mannozydazy jest wymagana do efektywnej degradacji lignocelulozy. W 2003 r. Foreman i wsp. opisali dwa białka, które są współindukowane z głównymi celulazami i nazwali je białkami indukowanymi celulozą 1 i 2 (CIP1 i CIP2). Okazało się, że są one ważne dla efektywnej degradacji lignocelulozy. Najnowsze wyniki badań wskazują, że CIP1 wykazuje strukturalne podobieństwo do liazy, chociaż nie udało się wykazać aktywności liazy, oraz że CIP2 jest glukuronoylesterazą z rodziny CE15. Innym ważnym białkiem wydzielanym jest spollenina SWO1, która zawiera moduł wiążący węglowodany (CBM) połączony z domeną podobną do ekspansyny. Pomimo działania niszczącego celulozę, SWO1 synergistycznie zwiększa aktywność endoksylanazy, a nie endoglukanazy czy celobiohydrolazy, podczas enzymatycznej hydrolizy wstępnie przetworzonych resztek kukurydzy. Jednym z proponowanych sposobów działania jest to, że czyni on część ksylanową lignocelulozy bardziej dostępną dla degradacji przez ksylanazy i w ten sposób pośrednio wspiera działanie celulaz. Prawdopodobnie największą rewolucją w ostatnich latach w degradacji celulozy było odkrycie litycznych monooksygenaz polisacharydowych (LPMO). Enzymy te wprowadziły nowy, oksydacyjny mechanizm do degradacji polisacharydów. W degradacji celulozy zakłada się, że LPMO działają na powierzchni krystalicznych włókien celulozy, czyniąc je w ten sposób bardziej dostępnymi dla celulaz. Co ciekawe, enzymy te mogą pobierać potrzebne do tego procesu elektrony z ligniny ściany komórkowej rośliny poprzez przenoszenie elektronów na duże odległości, zwracając tym samym mechanizmy obronne rośliny przeciwko nim. Alternatywnie, oksydoreduktazy GMC lub dehydrogenazy celobiozowe mogą działać jako donory elektronów. To odkrycie mogłoby dobrze wyjaśnić, w jaki sposób T. reesei napędza swoje LPMO, ponieważ wcześniej wykazano, że kilka takich oksydoreduktaz GMC jest rzeczywiście indukowanych przez słomę pszenną. Jednakże ten mechanizm utleniania nie jest bynajmniej ograniczony do depolimeryzacji celulozy. Pierwotnie wykazano, że LPMO odgrywają również rolę w degradacji ksyloglukanu i amylozy. W bazie danych CAZy enzymy należące do tej grupy zostały przeklasyfikowane na „aktywności pomocnicze” (AA) w przeciwieństwie do ich wcześniejszej klasyfikacji jako hydrolazy glikozydowe (np. GH61) i znajdują się w rodzinach AA 9-11 i 13. Jak wspomniano wcześniej, aktywności hemicelulolityczne są ważne dla pełnego scukrzania lignocelulozy (omówione przez Harrisa i in.). Różne ilości poszczególnych aktywności są wymagane w zależności od typów hemicelulozy obecnych w podłożu. Warto zatem zauważyć, że repertuar enzymatyczny T. reesei ma pewne wyraźne ograniczenia w odniesieniu do niektórych typów wiązań specyficznych dla hemicelulozy. Jedną z takich brakujących aktywności jest α-ksylozydaza. Dodanie α-ksylozydazy do komercyjnego preparatu enzymatycznego T. reesei zwiększyło uwalnianie ksylozy i glukozy z poddanej obróbce wstępnej kukurydzy. Podobnie, dodanie celulazy z rodziny GH 5 o aktywności wobec glukomannanu i ksylanu znacząco poprawiło działanie syntetycznego preparatu enzymatycznego T. reesei. Inne aktywności, które są nieobecne lub bardzo ograniczone w mieszaninie celulaz T. reesei obejmują endo-arabinazę i kilka aktywności pektynazy. Uzupełnienie komercyjnych mieszanek celulazowych o te aktywności enzymatyczne w konsekwencji poprawiło proces scukrzania różnych substratów. Innym pytaniem, na które nie udzielono jeszcze odpowiedzi, jest funkcja in vivo wydzielanych oksydaz wielomiedziowych podobnych do lakazy, zakodowanych w genomie T. reesei.

Ulepszanie T. reesei jako gospodarza produkującego białka

Zważywszy na fakt, że celulazy i większość innych enzymów degradujących lignocelulozę są wyrażane w sposób skoordynowany i warunkowy, ich regulacja transkrypcyjna stanowi logiczny cel inżynierii mającej na celu poprawę produkcji celulozy przez grzyba. Jednym z głównych regulatorów jest czynnik transkrypcyjny CRE1, pośredniczący w represji katabolitów węglowych typu C2H2. CRE1 wyłącza transkrypcję swoich genów docelowych, gdy obecne są bardziej korzystne źródła węgla, takie jak glukoza. Jego obcięcie jest jedną z głównych przyczyn poprawy produkcji celulozy osiągniętej przez losowe programy mutagenezy T. reesei QM6a prowadzące do szczepu RUT-C30, który wykazuje zarówno wyższy poziom bazowy, jak i indukowany produkcji celulozy. Podobnie, zastąpienie motywów wiążących CRE1 w regionie promotorowym głównej celobiohydrolazy cel7a motywami znanego aktywatora celulazy zmniejsza represję katabolitu węglowego i zwiększa transkrypcję cel7a w warunkach aktywacji i represji. Ponadto, transkrypcja celulazy, ksylanazy i szeregu innych genów kodujących enzymy biorące udział w degradacji lignocelulozy ściśle zależy od aktywatora transkrypcyjnego Zn(II)2Cys6 typu XYR1. Pozostaje to w sprzeczno¶ci z innymi grzybami, w tym Sordariomycetes Neurospora crassa i Fusarium fujikuroi, u których ortolog XYR1 wył±cznie moduluje ekspresję genów ksylanazy. Stwierdzono, że mutacja prowadząca do skróconej formy XYR1 jest przyczyną celulazo-ujemnego fenotypu szczepu QM9136, pochodzącego z programu mutagenezy w Natick. Odpowiednio, mutanty produkujące nadmierną ilość celulozy mają podwyższony poziom mRNA dla aktywatorów transkrypcji xyr1. Udowodniono również, że nadekspresja XYR1 prowadzi do zwiększonej ekspresji celulaz i znosi ich represję kataboliczną w obecności glukozy. Ponadto, mutacja punktowa w przypuszczalnym regionie regulatorowym XYR1 prowadzi do podobnego rozregulowania ekspresji. Oprócz XYR1 i CRE1, trzy czynniki transkrypcyjne ACE1, ACE2 i ACE3 regulują ekspresję celulozy i ksylanazy u T. reesei. Podobnie jak CRE1, ACE1 jest represorem z palcem cynkowym C2H2, a jego delecja poprawia produkcję zarówno celulaz, jak i ksylanaz. ACE2 i ACE3, podobnie jak XYR1, są aktywatorami transkrypcji typu Zn(II)2Cys6 . W przypadku braku ace2, transkrypcja celulaz i ksylanaz jest odpowiednio zredukowana, chociaż indukcja celulaz przez soforozę pozostaje najwyraźniej nienaruszona. Delecja ace3 całkowicie znosi transkrypcję celulaz, ale tylko zmniejsza transkrypcję ksylanaz. Podczas gdy nadekspresja ACE2 nie była jeszcze próbowana, nadekspresja ACE3 prowadzi do zwiększenia aktywności obu typów enzymów, podobnie jak nadekspresja sześciu innych, dotychczas niescharakteryzowanych regulatorów. Należą do nich dwa kolejne czynniki transkrypcyjne typu Zn(II)2Cys6, a także dwa białka WD40, białko bromodomenowe oraz acetylotransferaza związana z gcn5. Wszystkie trzy z aktywatorów transkrypcyjnych Zn(II)2Cys6 (XYR1, ACE2 i ACE3) przypominają dobrze scharakteryzowane białko Gal4 z S. cerevisiae. Wiadomo, że Gal4 rekrutuje kompleks Gcn5 zawierający SAGA i w ten sposób promuje transkrypcję docelowych genów poprzez acetylację histonów i tworzenie euchromatyny. Ortolog Gcn5 u T. reesei jest niezbędny do ekspresji celulozy i bierze udział w acetylacji histonów w promotorze cbh1. W ostatnich latach wyłonił się obraz, który wskazuje, że transkrypcja celulaz i pokrewnych CAZymów u grzybów jest regulowana przez kombinację wielu czynników transkrypcyjnych stanowiących złożoną sieć transkrypcyjno-regulacyjną, na którą wpływają przeciwdziałające sobie aktywatory i represory. U Penicillium oxalicum, na przykład, dwadzieścia czynników transkrypcyjnych moduluje aktywację lub represję genów celulaz. Spośród nich ClrB został zidentyfikowany jako kluczowy integrator wszystkich pozostałych regulatorów z ich genami docelowymi. Homologi tych regulatorów występują u T. reesei, ale biorąc pod uwagę różnorodność adaptacji w regulacji ściany komórkowej roślin, oczekuje się, że inne i odmienne regulatory również będą odgrywać znaczącą rolę. Innym kluczowym graczem w regulacji celulazy jest ortolog T. reesei enigmatycznego Aspergillus LaeA, który jest zaangażowany w regulację grup genów metabolitów wtórnych u różnych grzybów. Podczas gdy delecja tej putatywnej metylotransferazy białkowej prowadzi do silnego wyciszenia różnych genów celulazy i innych genów CAZyme, jej nadekspresja może silnie promować ich ekspresję. Podobne efekty stwierdzono dla białka LAE1 oddziałującego z białkiem VEL1 kompleksu VELVET .

Większość z wyżej wymienionych badań dostarcza fundamentalnego wglądu w regulację powstawania celulozy. Ponieważ większość z tych badań przeprowadzono albo w oryginalnym izolacie T. reesei QM6a, albo w umiarkowanie nadprodukcyjnym szczepie QM9414, pozostaje niejasne, czy i w jakim stopniu efekty te mogą być realizowane w szczepach hiperprodukcyjnych. W tych szczepach procesy takie jak translacja, sekrecja i obrót wydzielanych enzymów, a nie transkrypcja, mogą ograniczać dalszy wzrost produkcji celulazy. Interesujące będzie sprawdzenie, czy kilka z opisanych sposobów na poprawę ekspresji genów celulazowych można połączyć i jak takie szczepy radzą sobie w porównaniu z hiperproducentami uzyskanymi w wyniku losowej mutagenezy.

Proste zwiększenie transkrypcji interesującego nas genu nie zawsze prowadzi do poprawy tworzenia produktu, zwłaszcza w przypadku białek nie-grzybowych. Jedną z udanych strategii obejścia niskiego poziomu tworzenia produktów jest podejście genu fuzyjnego, który oprócz regionu promotora i terminatora genu o wysokiej ekspresji wykorzystuje również kodowane białko jako czynnik wzmacniający ekspresję. W przypadku T. reesei jest to celobiohydrolaza kodująca cel7A, która jest najsilniej ekspresjonowanym białkiem w warunkach indukujących powstawanie celulozy. Uważa się, że te fuzje genów ogólnie zwiększają stabilność mRNA, import do ER i przejście przez szlak sekrecyjny. W tym celu często wykorzystuje się modułową strukturę CEL7A składającą się z modułu katalitycznego, łącznika i CBM, zastępując w ten sposób C-końcowy CBM przez interesujący nas gen. Obecnie dostępne są warianty tego podejścia do fuzji genów, które kierują białko do ER w celu prawidłowego składania, tworzenia mostków disiarczkowych i glikozylacji, ale następnie dążą do wewnątrzkomórkowej akumulacji białka, aby uniknąć degradacji pożądanego produktu przez proteazy zewnątrzkomórkowe. Jedna z takich strategii wykorzystuje hydrofobiny z dołączonym sygnałem retencji ER jako nośniki. Te białka fuzyjne samoistnie łączą się w struktury podobne do miceli i mogą być oczyszczane przy użyciu wodnego systemu dwufazowego opartego na surfaktantach. Kolejna strategia kierowania białek do ER wykorzystuje peptyd γ-zeinowy (ZERA) pochodzący z białka spichrzowego kukurydzy. Analogicznie, te samoskładające się białka fuzyjne tworzą ciała białkowe otoczone błoną ER, która chroni je przed proteolizą. Rozwój grzybów jako wydajnych gospodarzy produkcyjnych dla białek ssaków wymaga również inaktywacji często spotykanych proteaz w pożywce fermentacyjnej. W systematycznych badaniach zidentyfikowano różne wydzielane proteazy związane z degradacją biofarmaceutyków, w tym przeciwciał, interferonu α 2b i insulinopodobnego czynnika wzrostu, a kilka z nich inaktywowano. Doprowadziło to nie tylko do drastycznego zmniejszenia aktywności proteaz, ale również do silnego zwiększenia stabilności wszystkich trzech rekombinowanych białek, przy czym przeciwciało wykazywało najbardziej wyraźny efekt. Chociaż inżynieria wzoru N-glikozylacji w celu produkcji białek terapeutycznych o wysokiej wartości była już wcześniej próbowana, stworzenie autentycznego ludzkiego wzoru glikozylacji w grzybowym gospodarzu ekspresyjnym nie wydaje się obecnie wykonalne. Jest zatem wątpliwe, czy takie biofarmaceutyki będą w przyszłości produkowane przez fabryki komórek grzybowych, zwłaszcza biorąc pod uwagę szybki rozwój komórek CHO .

Wspomniane wyżej hydrofobiny są kolejną grupą białek, którym poświęcono wiele uwagi ze względu na ich właściwości powierzchniowo-czynne . Te małe, zewnątrzkomórkowe białka samoorganizują się w warstwy białkowe na powierzchniach hydrofobowych/hydrofilowych dzięki swoim właściwościom amfifilowym i sprawiają, że powierzchnie hydrofobowe stają się zwilżalne, a powierzchnie hydrofilowe hydrofobowe. Mają one szeroki potencjał w zastosowaniach spożywczych i medycznych do dyspersji materiałów hydrofobowych, stabilizacji pianek lub kierowania różnych cząsteczek na powierzchnie. Cerato-plataniny to kolejna grupa małych, wydzielanych białek z czterema konserwowanymi cysteinami. Wiążą się one z chityną i oligosacharydami N-acetyloglukozaminy i posiadają właściwości samoskładania się na interfejsach hydrofobowych/hydrofilowych. W przeciwieństwie do hydrofobin, cerato-plataniny zwiększają raczej właściwości polarności/apolarności powierzchni. CBM występującym w różnych CAZymach przypisuje się również funkcję ukierunkowującą. Mogą one poprawiać aktywność hydrolityczną domeny katalitycznej, do której są przyłączone i prowadzić do bardziej korzystnego optimum pH i temperatury. Ich właściwości wiązania węglowodanów mogą być ponadto wykorzystane do oczyszczania białek fuzyjnych z powinowactwa przy użyciu np. kolumn celulozowych. The broad range of other applications of recombinant CBMs has recently been reviewed elsewhere .

Trichoderma reesei for consolidated bioprocessing and whole cell catalysis

Consolidated bioprocessing (CBP) is classically understood as the integration of the cellulolytic enzyme production, enzymatic hydrolysis and fermentation steps of a cellulosic ethanol production process into a single unit operation. Dlatego pożądany byłby pojedynczy organizm o dobrych właściwościach celulolitycznych i wydajnej ścieżce fermentacji etanolowej. Niemniej jednak, wykorzystanie konsorcjów mikrobiologicznych również cieszy się pewnym zainteresowaniem. Niestety, obecnie nie jest dostępny żaden pojedynczy organizm, który spełniałby oba wymagania (Rys. 2). W związku z tym podjęto wysiłki w celu stworzenia organizmów etanogennych, które stałyby się celulolityczne lub organizmów celulolitycznych, które stałyby się etanogenne. W kontekście pierwszego scenariusza, T. reesei często służył jako dawca genów CAZyme, szczególnie dla cel5a i cel7b kodujących dwie z jego endoglukanaz oraz dla dwóch celobiohydrolaz cel6a i cel7a (Tabela 1). We wszystkich opublikowanych badaniach stosunkowo niska zdolność wydzielnicza S. cerevisiae ograniczała konwersję substratów przez wydzielane lub zakotwiczone w błonie heterologiczne CAZymy. W związku z tym, uzyskanie wysokiej wydajności etanolu z realistycznych substratów celulozowych wymagało suplementacji komercyjnymi koktajlami enzymatycznymi T. reesei. Niemniej jednak, podczas gdy wysiłki zmierzające do poprawy zdolności wydzielania i prezentowania na powierzchni zmodyfikowanych szczepów S. cerevisiae są obecnie w toku, obecnie dostępne szczepy zawierające celulazę już teraz mogą potencjalnie doprowadzić do znacznej redukcji wymaganego obciążenia enzymatycznego w procesie scukrzania biomasy. W kontekście drugiego scenariusza, T. reesei sam w sobie stanowi obiecujący organizm docelowy. Ale chociaż grzyb ten posiada naturalną zdolność do metabolizowania wszystkich cukrów związanych z biomasą i przekształcania ich w etanol, wydajność jest niska, a kwas octowy powstaje jako niepożądany produkt uboczny. Z drugiej strony, reżimy fermentacyjne na dużą skalę dla T. reesei są dobrze opracowane ze względu na jego szerokie zastosowanie w komercyjnej produkcji enzymów, a narzędzia molekularne do jego inżynierii genetycznej są również bardzo dobrze rozwinięte. Jednym z największych wyzwań związanych z wykorzystaniem T. reesei jako organizmu CBP jest fakt, że niektóre z jego genów celulaz i genów glikolitycznych są represjonowane przez niedotlenienie, co jest niezbędne do produkcji etanolu. Dodatkowo, represja transkrypcyjna celulaz w obecności etanolu stanowi kolejne wyzwanie do pokonania. Jednakże, szczep RUT-C30 wytwarzający hiperprodukcję celulaz wykazuje wyższą tolerancję na etanol w porównaniu do szczepu QM9414 z linii Natick i dlatego stanowi doskonałą platformę do rozwoju T. reesei jako organizmu CBP, zwłaszcza, że jest on również pozbawiony katabolitu węgla. Ponadto, w obecności lignocelulozowej pulpy, RUT-C30 wykazuje morfologię zbliżoną do granulatu podczas wczesnych etapów fermentacji, co można osiągnąć w sposób niezależny od wzrostu poprzez dodanie środka powierzchniowo czynnego Triton X-100, a następnie prowadzi do wyższej produkcji enzymów. Jest to ważne, ponieważ słaba mieszalność i niska maksymalna gęstość komórek jako konsekwencja wzrostu nitkowatego utrudniały do tej pory wykorzystanie T. reesei jako organizmu CBP. Mówiąc bardziej ogólnie, skonsolidowane bioprocesy mogą być również stosowane do opisania innych zintegrowanych procesów, w których substratem nie jest koniecznie biomasa lignocelulozowa, ale inny biopolimer, taki jak chityna lub skrobia, a produktem nie jest etanol, ale dowolny inny metabolit . W tym celu, wiele ostatnich badań miało na celu nadprodukcję różnych metabolitów poprzez inżynierię T. reesei (Tabela 2). Jednakże wydajność, którą udało się osiągnąć była w większości przypadków daleka od komercyjnej, stąd wymagała dalszej optymalizacji.

Narzędzia do projektowania i inżynierii komórek

Podczas gdy dwa obszerne przeglądy molekularnych narzędzi T. reesei i innych gatunków Trichoderma zostały wydane niedawno, chcemy je zaktualizować o najnowsze osiągnięcia w tej dziedzinie. Ukierunkowana inżynieria szczepów w celu poprawy produkcji celulozy lub inżynierii metabolicznej wymaga skutecznych metod wprowadzania ukierunkowanych zmian genetycznych do organizmu. Ogólnie niska wydajność ukierunkowania genów przez długi czas stanowiła główne wyzwanie dla uzyskania rozsądnej liczby transformantów poprzez homologiczną integrację delecji lub kasety ekspresyjnej. Problem ten został rozwiązany głównie poprzez inaktywację komponentów szlaku NHEJ (non-homologous end joining) naprawy DNA, takich jak tku70 lub tmus53 . Szczepy pozbawione tku70 wykazują lepsze ukierunkowanie genów, chociaż wydajność homologicznej integracji w tych szczepach nadal może się różnić w zależności od ukierunkowanego locus, a zatem może spaść do 30%. W oparciu o tę poprawę, opracowano szereg nowych metod wprowadzania kaset ekspresyjnych w określonym regionie genomu, unikając w ten sposób efektów plejotropowych spowodowanych ich przypadkową integracją. Używając tła tku70 Jorgensen i wsp. opracowali platformę ekspresyjną, która wykorzystuje łatwe do przesiewania locus ade2 jako preferowane miejsce integracji. Po integracji kasety ekspresyjnej do tego locus, ade2 jest niszczone, a powstałe transformanty rozwijają wyraźną czerwoną pigmentację. W innym badaniu, loci pyr4 i asl1 zostały wybrane w celu stworzenia szczepu z auksotrofią urydyny i l-argininy, co pozwala na integrację w tych miejscach. Ouaedraogo i wsp. zastosowali inną strategię i dokonali ekspresji meganukleazy I-SceI z S. cerevisiae w T. reesei. I-SceI generuje sztuczne pęknięcia podwójnej nici w miejscu rozpoznawania I-SceI, które zostało wcześniej wprowadzone do predefiniowanego locus i poprawiło zarówno wydajność transformacji, jak i integracji homologicznej. W kolejnym badaniu, pośredniczone przez I-SceI przerwanie podwójnej nici zostało połączone z delecją tku70. W tym przypadku niezdolność do naprawy przerwania podwójnej nici poprzez NHEJ sprzyja integracji kasety, prowadząc do wydajności rekombinacji homologicznej sięgającej 100%. Rewolucja w inżynierii genetycznej lub edycji genomu została wprowadzona wraz z systemem CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 . Podkreślając zarówno potrzebę takiej technologii, jak i jej rosnące znaczenie jako producenta enzymów, system ten został po raz pierwszy przetestowany dla grzybów strzępkowych w T. reesei . Wprowadza on specyficzne pęknięcia podwójnej nici DNA w celu stymulowania ukierunkowania genów i zależy wyłącznie od nukleazy Cas9 (związanej z CRISPR), która wykorzystuje pojedynczy chimeryczny RNA prowadzący do ukierunkowania. Dokładne ukierunkowanie tego RNA-guided Cas9 do określonej sekwencji DNA jest osiągane przez sekwencję protospacerową przewodniego RNA poprzez proste parowanie zasad. Używając 200 bp up- i downstream flanking regions dla konstrukcji delecji genów, można było osiągnąć częstość HR wyższą niż 90%. Podwójne delecje i potrójne delecje wystąpiły z częstotliwością odpowiednio 45 i 4 %, po pojedynczej rundzie transformacji. Podczas gdy w tym badaniu RNA przewodnie transkrybowane in vitro było kotransformowane z kasetą delecyjną do T. reesei wykazującego ekspresję Cas9, Nødvig i wsp. wykorzystali dwie flankujące sekwencje rybozymów do uwolnienia RNA przewodniego z większego transkryptu, który również koduje enzym Cas9 u różnych Aspergilli. Innym istotnym narzędziem niezbędnym zarówno w rekombinowanej ekspresji białek, jak i w inżynierii szczepów są promotory, które umożliwiają ekspresję genów w kontrolowany sposób. Chociaż dostępnych jest wiele indukowalnych i represyjnych promotorów z różnymi regionami promotorowymi celulaz, mają one zwykle wady, ponieważ ich ekspresja jest związana z metabolizmem gospodarza, a aktywatory mogą być ograniczone ze względu na efekty miareczkowania promotora. Przydatną alternatywą jest zestaw genów T. reesei represyjnych wobec l-metioniny, o różnej podstawowej sile ekspresji. Wykazano, że jeden z tych promotorów może napędzać represyjną ekspresję różnych genów reporterowych na kilku źródłach węgla, w tym na słomie pszennej. W podobnym badaniu promotor genu permeazy miedziowej T. reesei został użyty do kontroli ekspresji głównego regulatora celulozy i hemicelulaz xyr1 w nieobecności miedzi. Jednak biorąc pod uwagę fakt, że enzymy zawierające miedź z rodziny AA 9 są ważnymi składnikami mieszaniny celulaz T. reesei, wątpliwe jest, czy ten system może być zastosowany w scenariuszu produkcji celulozy.

Poza tymi ekscytującymi narzędziami molekularnymi, niektóre starsze sztuczki z genetyki klasycznej są teraz również dostępne. Rozwój szczepów T. reesei był przez długi czas utrudniony przez fakt, że uważano, iż grzyb ten jest bezpłciowy, co uniemożliwiało krzyżowanie szczepów. Kamieniem milowym w tym względzie było odkrycie, że QM6a posiada locus typu kojarzenia MAT1-2 i może być łatwo krzyżowany z niektórymi izolatami typu dzikiego MAT1-1 T. reesei. Kiedy jednak locus MAT1-2 QM6a zastąpiono jego odpowiednikiem MAT1-1, w konfrontacji z oryginalnym szczepem MAT1-2 QM6a nie powstawały żadne stromaty. W konsekwencji, niemożliwe było wykorzystanie kojarzenia do inżynierii szczepów w różnych akademickich i przemysłowych szczepach T. reesei pochodzących z QM6a. Stosując biologiczne podejście systemowe, zidentyfikowano brakujący gen odpowiedzialny za żeńską sterylność jako ham5 . W N. crassa, ham-5 koduje białko, które służy jako rusztowanie dla kinaz MAP podczas fuzji komórek. Reintrodukcja funkcjonalnego ham5 przywraca tworzenie zarodków u szczepu QM6a i umożliwia przywrócenie płodności żeńskiej u innych szczepów pochodzących z tła QM6a. Odkrycie to jest szczególnie ważne, ponieważ krzyżowanie z wyżej wymienionymi izolatami H. jecorina może prowadzić do powstania segmentalnie aneuploidalnych potomków. Dysponując tym narzędziem, stworzono podstawy do identyfikacji istotnych mutacji prowadzących np. do nadprodukcji celulozy. Jest to o tyle istotne, że tradycyjne metody komplementacji, mające na celu identyfikację genu(ów) powodującego zmutowane fenotypy, okazały się w dużej mierze nieskuteczne w przypadku gatunków takich jak T. reesei. I chociaż sekwencjonowanie o wysokiej wydajności i porównawcza analiza genomu mogą łatwo zidentyfikować mutacje w linii szczepu QM6a hiper- i null-producentów celulozy, tylko w kilku przypadkach doprowadziło to już do powiązania mutacji z konkretnym fenotypem. Jednak w przypadkach, gdy znaleziono dużą liczbę mutacji lub mutacje dotyczyły genów o nieznanej funkcji, analiza sekwencji porównawczych nie ujawniła natury pożądanych genów docelowych. Dlatego też kilku badaczy z powodzeniem zastosowało analizę segregacji zbiorczej w połączeniu z sekwencjonowaniem następnej generacji w celu identyfikacji istotnych mutacji. W tym podejściu, mutant jest krzyżowany ze szczepem referencyjnym, a genomowe DNA segregantów wykazujących pożądany fenotyp jest łączone i sekwencjonowane. Porównanie genomowe tej puli sekwencjonowanego DNA z genomami szczepów rodzicielskich może następnie ujawnić zachowane mutacje istotne dla fenotypu. Mutacje, które nie są związane z fenotypem będą niedostatecznie reprezentowane. Chociaż nie można oczekiwać, że to podejście doprowadzi do identyfikacji pojedynczej mutacji, ponieważ mutacje bliskie istotnej mutacji zazwyczaj współregenerują się, liczba celów dla dalszych badań jest znacznie zmniejszona.