Spectroscopic Methods
Absorbance Spectroscopy. W przypadku niektórych testów enzymatycznych, możliwy jest bezpośredni pomiar reagenta lub produktu na podstawie jego właściwości absorpcyjnych Fersht (1999). W reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową (EC 1.1.1.49), jeden z produktów (NADH) absorbuje światło przy długości fali 340 nm, co umożliwia monitorowanie reakcji poprzez śledzenie wzrostu absorbancji przy tej długości fali.
Glukozo-6-fosforan + NAD+ → 6-fosfoglukonian + NADH + H+
W innych przypadkach, reaktor lub produkt jest mierzony pośrednio. W przypadku acetylocholinoesterazy (EC 3.1.1.7), na przykład, acetylo-tiocholina jest używana jako substrat, który uwalnia tiocholinę w kontakcie z enzymem. Tiocholina reaguje z odczynnikiem Ellmana, wytwarzając barwny produkt, co umożliwia monitorowanie reakcji poprzez śledzenie wzrostu absorbancji.
Acetylo-tiocholina + H2O → octan + H+ + tiocholina
Tiocholina + odczynnik Ellmana → barwna pochodna
Atesty sprzężone są czasami stosowane do monitorowania aktywności enzymów. W tym przypadku, interesująca nas reakcja enzymatyczna jest sparowana z drugą reakcją, która jest sprzężona w celu wygodnego pomiaru. Przykładem tego jest test na heksokinazę (EC 2.7.1.1). W tym przypadku, nadmiar dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej i NAD+ jest włączony do mieszaniny testowej i monitorowana jest absorbancja przy 340 nm.
Reakcja I: Glukoza + ATP → glukozo-6-fosforan + ADP
Reakcja II: Glukozo-6-fosforan + NAD+ → 6-fosfoglukonian + NADH + H+
W tym przykładzie reakcja I powinna być ograniczająca szybkość, a stężenie glukozo-6-fosforanu powinno osiągnąć stan ustalony po okresie opóźnienia. Cleland Cleland (1979) sformułował procedurę zapewniającą, że test sprzężony zapewnia dokładny pomiar szybkości reakcji enzymu. Jeśli to możliwe, lepiej jest monitorować reakcję w sposób ciągły. W przypadku analiz opisanych powyżej, spektrofotometr można zaprogramować tak, aby dawał ciągły odczyt w funkcji czasu. W technikach rozdzielania, które mogą obejmować wykorzystanie radioaktywności, elektroforezę lub chromatografię, stosuje się analizy nieciągłe lub punktowe. Po ustaleniu liniowego okresu czasu dla analizy, parametr jest mierzony w pojedynczym punkcie czasowym w liniowym okresie czasu (najlepiej w punkcie czasowym w pobliżu środka fazy liniowej). Szybkość jest następnie określana na podstawie różnicy w sygnale w tym punkcie czasowym oraz w momencie rozpoczęcia reakcji. Należy zachować ostrożność w przypadku oznaczeń punktów końcowych, a przebiegi czasowe powinny być sprawdzane w celu potwierdzenia liniowości. Zmiany w warunkach inkubacji, takie jak temperatura, pH lub stężenie substratu, mogą zmienić liniowość analizy. W przypadku rutynowych oznaczeń enzymatycznych, naczynie reakcyjne zawiera wszystkie składniki oprócz jednego, a reakcja jest inicjowana przez dodanie brakującego składnika (enzymu lub jednego z substratów). Pozostałe składniki powinny być zrównoważone pod względem pH, temperatury i siły jonowej. Reakcja jest zwykle inicjowana przez dodanie niewielkiej objętości stężonego roztworu podstawowego brakującego składnika. Mała objętość zapewnia, że dodatek ten nie zakłóci już ustalonych warunków równowagi. Jeżeli nie jest możliwe dodanie małego składnika, rozdzielone składniki powinny mieć tę samą temperaturę, siłę jonową i p H. Chociaż musi nastąpić całkowite wymieszanie obu składników, należy unikać energicznego wstrząsania, ponieważ może ono spowodować denaturację białka enzymatycznego. Mieszanie może być wykonane przez odwrócenie probówki z dołączonym korkiem lub kuwety z uszczelką z folii Parafilm. Rozcieńczone białka są często mniej stabilne niż białka bardziej stężone, a badania są często wykonywane w obecności białka obojętnego, takiego jak albumina surowicy bydlęcej (0,25 mg/ml), w celu ustabilizowania oczyszczonego enzymu. Należy przeprowadzić eksperymenty w celu upewnienia się, że białko jest obojętne. Ponieważ albumina, na przykład, może wiązać się z substratami hydrofobowymi, nie zawsze może być odpowiednia do tego celu. W przypadku oznaczeń nieciągłych można ustawić timer i pobierać próbki w określonych odstępach czasu po wymieszaniu. W przypadku większości spektrofotometrów detekcja jest inicjowana ręcznie za pomocą panelu instrumentu lub klawiatury komputerowej. Aby dodać składnik do kuwety, potrzeba około 20 sekund na umieszczenie kuwety w spektrofotometrze i rozpoczęcie detekcji przez naciśnięcie klawisza komputerowego. Czas ten zazwyczaj nie ma większego znaczenia, ponieważ dla większości reakcji badanie trwa od 10 do 30 minut. Pomiary kontrolne obejmują próbę ślepą nie zawierającą enzymu oraz próbę ślepą nie zawierającą substratu. Takie kontrole zapewniają, że nie zachodzą przypadkowe reakcje. Szybkość reakcji kontrolnej (ślepej próby bez enzymu) jest odejmowana od szybkości generowanej przez eksperyment w celu uzyskania rzeczywistej szybkości reakcji enzymatycznej. W przypadku wielu oznaczeń konieczne jest wygaszenie lub zatrzymanie reakcji w określonym czasie, aby zapobiec dalszemu wytwarzaniu produktu. Na przykład, próbki mogą być pobierane w odstępach 5-minutowych przez z góry określony okres czasu, a produkt mierzony metodą HPLC.
Każda analiza chromatograficzna może trwać 30 minut. Metody kończące reakcję zwykle obejmują denaturację enzymu przez dodanie kwasu lub zanurzenie we wrzącej łaźni wodnej. Aktywność niektórych metaloenzymów może być tłumiona za pomocą EDTA lub innego chelatora jonów metali. Większość oznaczeń enzymatycznych opiera się na technikach spektroskopowych, z których dwie najczęściej stosowane to absorpcja i fluorescencja Fersht (1999). Długość fali używanej do śledzenia szybkości reakcji powinna być taka, która daje największą różnicę w absorpcji pomiędzy substratem a produktem. Pomiary absorpcji wykonywane są za pomocą standardowego spektrofotometru z próbkami umieszczonymi w specjalistycznych kuwetach. W handlu dostępne są jednorazowe plastikowe kuwety mieszczące próbki o pojemności 1 lub 3 ml. Ich użycie jest ograniczone do zakresu widzialnej długości fali (350-800 nm). Do pomiarów w zakresie długości fali poniżej 350 nm należy stosować kuwety kwarcowe (szkło i plastik pochłaniają światło w zakresie UV). Długość drogi dla kuwet jest podawana przez producenta. Popularne długości ścieżek to 1,00 cm, 0,40 cm i 0,20 cm. Coraz więcej oznaczeń wykonuje się na 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych z plastikowym lub kwarcowym dnem. Stężenie substancji, która absorbuje światło o określonej długości fali można określić na podstawie prawa Beera:
A = εcl,
gdzie A jest absorbancją próbki przy określonej długości fali, c jest stężeniem próbki, l jest długością drogi, a ε jest współczynnikiem ekstynkcji lub molową zdolnością absorpcyjną. ε ma jednostki M-1 cm-1 lub mM-1 cm-1. Jeśli wartość ε jest znana dla danej substancji, możliwe jest obliczenie stężenia tej substancji w roztworze poprzez pomiar jej absorpcji w tym roztworze. Korzystając z prawa Beera, można obliczyć szybkość zmian stężenia w trakcie reakcji. Potencjalny błąd przy stosowaniu pomiarów absorpcji wynika z odstępstwa od prawa Beera, ponieważ obowiązuje ono tylko dla skończonego zakresu wartości absorpcji. Tak więc, ponieważ może ono nie mieć zastosowania przy absorbancji większej niż 1, analizy powinny być zaprojektowane tak, aby wartości doświadczalne były mniejsze od tej wartości. Możliwe jest obejście niektórych z tych problemów poprzez zastosowanie kuwet o krótszych długościach drogi. Próbka o absorbancji 1,00 w kuwecie o długości ścieżki 1,00 cm będzie miała absorbancję 0,20 w kuwecie o długości ścieżki 0,20 cm. Ogólnie rzecz biorąc, praca z absorbancją około 0,5 stanowi kompromis pomiędzy minimalizacją szumu optycznego właściwego dla spektrofotometru a uzyskaniem rozsądnego sygnału do pomiaru. Zmętnienie roztworu może rozpraszać światło i powodować powstanie absorbancji pozornej. Do usunięcia tych cząstek można zastosować filtrację lub wirowanie. Chociaż zmiany w długości ścieżki pozwalają na uniknięcie niektórych odchyleń od liniowości (tj. gdy absorbancja jest tak wysoka, że spektrofotometr nie może dokonać dokładnego pomiaru), często odchylenia te wynikają z oddziaływań międzycząsteczkowych pomiędzy absorbującymi gatunkami. Dimeryzacja (lub tworzenie eksimerów wyższego rzędu) występuje przy wyższych stężeniach gatunków absorbujących. W tych przypadkach, prawo Beera będzie przestrzegane, jeśli stężenie produktu zostanie zmniejszone. Można to osiągnąć poprzez spowolnienie reakcji (poprzez zmniejszenie stężenia enzymu) lub wykonanie pomiarów w krótszym okresie czasu (zanim pojawią się odchylenia od prawa Beera).
.