8.3 Testy chemiczne
Wizualizacja składników PHGs na płytkach TLC jest możliwa przy użyciu ogólnych odczynników do fenoli; chlorku żelaza, waniliny i kwasu solnego (dają gamę różowych kolorów z pochodnymi rezorcynolu lub floroglucynolu), lub przy użyciu bardziej specyficznych testów z 2,4-dinitrofenylohydrazyną (wykrywa aldehydy). Odczynnik Folina-Ciocalteu’a jest również przydatny do wykrywania fenoli z jądrami katecholowymi lub hirochinonowymi (niebieskie plamy pojawiają się natychmiast po spryskaniu płytki TLC) lub innych fenoli, które wykazują niebieskie lub szare plamy, gdy płytka jest dymiona parami amoniaku. Odczynnik Gibbsa (2% chloroimid 2,6-dichlorochinonu w chloroformie), a następnie oparowanie płytki 2M NH4OH daje różnorodne kolory (np. jest w stanie odróżnić kwas wanilinowy – różowy i kwas izowanilinowy – niebieski). Pochodne kwasu cynamonowego dają charakterystyczną jasnoniebieską fluorescencję podczas badania w UV (366 nm). Izomery cis i trans kwasów cynamonowych są prezentowane na płytkach TLC, gdy ekstrakt jest chromatografowany w rozpuszczalnikach wodnych w dwóch kierunkach (2D-TLC). Często stosowane są metody spektrofotometryczne do szacowania zawartości fenoli, np. metoda z odczynnikiem Arnowa lub wspomniany wcześniej odczynnik Folina-Ciocalteu .
Niektóre testy jakościowe wskazują na obecność kumaryn w ekstraktach roślinnych, np, test pierścienia laktonowego (kumaryny hydrolizowane przez rozcieńczone zasady tworzą żółty roztwór soli kwasu O-kumarowego, który może być odwrócony po zakwaszeniu lub nasyceniu CO2); lub test sprzęgania azowego (czerwony kolor rozwija się w wyniku reakcji z diazotującym kwasem sulfanilowym w roztworze alkalicznym). Kumaryny są łatwo wykrywane w świetle UV (365 nm), ponieważ dają charakterystyczną kolorową fluorescencję (z wyjątkiem prostej niepodstawionej kumaryny, która nie wykazuje fluorescencji). Są one wykrywane przez ich niebieskie, fioletowe, brązowe, zielone lub żółte kolory. 10% roztwór KOH w metanolu lub 20% roztwór chlorku antymonu w chloroformie może zintensyfikować barwę. Hydroksykumaryny nie wykazują batochromowych przesunięć spektralnych w roztworze alkalicznym. W analizie HPLC z detekcją diodową różne widma UV kumaryn umożliwiają szybką identyfikację związków .
Chromony reagują w roztworach alkalicznych dając O-hydroksy-β-diketony bez regeneracji pierścienia γ-pironu, a także związki barwne ze stężonym kwasem i stężoną zasadą. Chromony są również widoczne w świetle UV (niebieska, żółta, zielonkawo-żółta, brązowa fluorescencja przy 365 nm).
Występowanie aktywnego pierścienia fenylowego (chromoforu) we flawonoidach sprawia, że są one łatwe do wykrycia w świetle UV. Ich widma UV są szczególnie pouczające, dostarczając informacji strukturalnych, które mogą rozróżnić rodzaj fenolu i wzór utleniania. Możliwe są różne reakcje chemiczne poprzez spryskiwanie chromatogramów TLC, np. wizualizacja w obecności oparów amoniaku (chalkony i aurony zmieniają barwę odpowiednio na pomarańczową i czerwoną) lub spryskiwanie Naturstoff Reagenz A (1% roztwór estru 2-aminoetanolu i kwasu difenyloborowego) i nadpylanie 5% metanolowym roztworem glikolu polietylenowego 4000 (PEG 4000), co zwiększa czułość tej reakcji. Po derywatyzacji związki można było obserwować w świetle UV (fluorescencja od jasnożółtej do zielonej). Inne testy obejmują spryskiwanie chlorkiem żelazowym, diazotowanym kwasem sulfanilowym (oba są reakcjami dla fenoli), oraz specyficzną reakcję; cyjanidyny z proszkiem magnezowym w obecności kwasu solnego (wskazuje na obecność flawanonów i dihydroflawanoli) . Do ilościowej oceny kolorymetrycznej flawonoidów stosuje się reakcję z chlorkiem glinu (AlCl3) (absorbancja mierzona przy 425 nm). Flawonoidy rozpuszczone w roztworach alkalicznych dają intensywnie żółtą barwę, która zmniejsza się po dodaniu kwasu. Widma UV związków flawonoidowych wykazują dwa główne pasma (maksima absorbancji): pasmo I przy wyższej długości fali (przypisane cynamonowej części struktury flawonoidu) i pasmo II przy niższej długości fali (przypisane części benzoilowej). Pasmo I jest zwykle przy 304-350 nm dla flawonów (H przy C-3 w pierścieniu C), przy 352-385 nm dla flawonoli (grupa OH przy C-3) i przy 328-357 nm dla 3-podstawionych flawonoli (O-podstawienie przy C-3). Pasmo II dla większości struktur znajduje się przy ok. 250-280 nm. Dodatkowa grupa fenolowa (-OH) w pierścieniu A powoduje przesunięcie batochromowe (przesunięcie ku dłuższym falom) w paśmie II, a dodatkowa grupa -OH w pierścieniu B generuje podobny efekt w paśmie I .
Większość antrachinonów lub ich glikozydów tworzy żółte lub pomarańczowo-czerwone kryształy i może wykazywać fluorescencję zależną od pH . Główną reakcją barwną jest test Bornträgera, który wykonuje się przez rozpuszczenie chinonu w alkalicznym środowisku wodnym. Reakcja barwna waha się od pomarańczowo-czerwonej do purpurowo-fioletowej (w zależności od struktury i podstawników chinonu). Antrachinony dają w tej reakcji czerwone zabarwienie. Dla 1,8-dihydrochinonów stosuje się również reakcję z octanem magnezu. Antrachinony mogą być wykryte na płytkach TLC po spryskaniu ich 10% metanolowym roztworem KOH. Pierwotne żółte lub żółto-brązowe kolory zmieniają się na czerwone, fioletowe, zielone lub purpurowe. Sproszkowany rabarbar może być badany w świetle UV w celu wykrycia obecności rapontycyny (glikozyd stilbenoidowy, który jest toksyczny). W oryginalnym rabarbarze (Rheum palmatum) pojawia się czerwono-brązowa fluorescencja, ale nie widać błyszczących niebiesko-fioletowych plam (jak w przypadku rabarbaru rapontyjskiego-Rheum rhaponticum).
Jak wspomniano wcześniej saponiny są związkami powierzchniowo czynnymi (modyfikującymi napięcie powierzchniowe) i mają właściwości emulgujące. W celu szybkiego sprawdzenia jakościowego, czy roślina posiada SPG, powszechnie stosuje się test spieniania poprzez wytrząsanie materiału roślinnego z wodą. Saponiny mają właściwości permeabilizujące membrany. Niskie stężenia saponin są w stanie zniszczyć błony erytrocytów (co może wytrącić cholesterol, który istnieje w błonach czerwonych krwinek), powodując hemolizę krwi in vitro. Zdolność ta doprowadziła do powszechnego stosowania hemolizy (indeks hemolityczny-IH) jako metody określania aktywności biologicznej. IH definiuje się jako ilość 2% izotonicznej zawiesiny krwi bydlęcej (w mL), która ulega hemolizie pod wpływem 1 g badanego materiału roślinnego (lub badanego ekstraktu). Jako odniesienie stosowano mieszaninę saponin Gypsophila paniculata (IH=30.000) lub Saponin Album (Merck) (IH=15.000). Jak opisali Hostettmann i Marston, aktywność hemolityczna saponozydów różni się znacznie w zależności od struktury części glikozydowej. Saponiny monodesmozydowe (z wyjątkiem acylglikozydów i glicyryzyny) są silnie hemolityczne. Żadna reakcja barwna nie jest szczególnie specyficzna dla SPG. Dostępna jest jednak reakcja Liebermana (z bezwodnikiem octowym w obecności kwasu siarkowego), w której kolory różnią się w zależności od rodzaju aglikonu (triterpenowy – różowy do czerwonego – lub steroidowy – niebiesko-zielony) .
Reakcje chemiczne mające na celu identyfikację CRGs w materiale roślinnym mogą być spowodowane aglikonami lub cukrami. Test Liebermanna i Salkoviskiego wskazuje na cząsteczkę steroidową, dlatego nie jest specyficzny dla CRGs. Testy Kellera Kilianiego i Ksantydrola, oba wskazują na deoksycukry (digitoksozę lub cymarozę). Reakcja Kedde lub Baljet jest bardziej specyficzna, ponieważ jest związana z obecnością α,β-nienasyconego pierścienia laktonowego. Możliwa jest również reakcja fluorescencyjna CRGs, np. grupa hydroksylowa digoksyny przy C-14 i C-16 eliminuje wodę za pomocą H2SO4 z wytworzeniem dwóch dodatkowych wiązań podwójnych. W ten sposób powstaje układ sprzężony (z wiązaniem podwójnym w pierścieniu laktonowym), który powoduje fluorescencję digoksyny w świetle UV. Reakcja Jensena (po spryskaniu kwasem trójchlorooctowym w etanolu) jest wykorzystywana do wizualizacji CRGs na chromatogramach TLC .
Bezpośredni pomiar całkowitego HCN poprzez hydrolizę kwasową glikozydów cyjanogennych obecnych w żywności, jak również rozkład pośrednich cyjanohydryn do HCN ma tę zaletę, że może być stosowany do wszystkich rodzajów próbek, chociaż nie wszystkie potencjalne HCN glikozydów cyjanogennych są prawdopodobnie dostępne in vivo. Wizualizacja obecności tych związków w roślinach jest możliwa na bibule filtracyjnej nasączonej odczynnikami, takimi jak kwas pikrynowy/węglan sodu lub benzydyna/octan cytrynowy. Odczynniki te są w stanie dać barwne reakcje z HCN uwalnianym z rozdrobnionych tkanek roślinnych. Zaimpregnowany papierek umieszcza się w probówce nad rozdrobnionym materiałem roślinnym i pozostawia do inkubacji w temperaturze 40°C przez 2 godziny. Zmiana koloru z żółtego na czerwono-brązowy wskazuje na enzymatyczne uwalnianie HCN. Papier pikrynowy nie jest całkowicie specyficzny dla cyjanogenu (lotne izotiocyjaniany z gatunków Brassica również reagują w tej reakcji). Dlatego stosuje się również inny test z użyciem mieszaniny (1:1) świeżo przygotowanych roztworów 1% 4,4-tetrametylodwuaminy difenyloaminy w chloroformie (w/v) i 1% octanu etylu miedzi w chloroformie (w/v). Reakcja barwna zmienia się z bladej niebiesko-zielonej na jasnozieloną. Inna możliwa metoda wymaga destylacji tkanki roślinnej w kwaśnej wodzie i miareczkowania uwolnionego HCN azotanem srebra. Metody chromatograficzne, takie jak HPLC/MS lub GC/MS pochodnych trimetylosililu są skuteczne w analizie poszczególnych glikozydów cyjanogennych lub cyjanohydryn i zapewniają charakterystykę chemiczną, jak również kwantyfikację związków.
Ze względu na różnorodność produktów powstających w roślinach z glukozynolanów (w zależności od struktury aglikonu) ocena izotiocyjanianów metodą spektrofotometryczną (gdzie produkty barwne 1,3-benzoditiol-2-tiony powstają w wyniku kondensacji izotiocyjanianu z 1,2-benzenoditiolem) może być niewystarczająca do określenia zawartości glukozynolanów w roślinach .