Dla celów tego wpisu na blogu (więcej na temat różnych typów utrwalaczy…), skupimy się głównie na zastosowaniu paraformaldehydu/formaldehydu, powszechnie określanego jako PFA, który jest najczęściej stosowanym utrwalaczem w cytometrii przepływowej. PFA odnosi się do stałej, polimerowej formy formaldehydu (i rozpuszcza się do monomerycznego formaldehydu w roztworze wodnym), więc to, co jest zwykle określane kanonicznie jako „utrwalanie PFA” jest w rzeczywistości użyciem monomerycznego roztworu formaldehydu. W tym przypadku, PFA i formaldehyd są synonimami i są wymienne.
Roztwór o stężeniu od 1-4% PFA jest zwykle używany do utrwalania próbek do cytometrii przepływowej. W przypadku sanityzacji próbek zakaźnych, stężenie tak niskie jak 0,37% może skutecznie dezynfekować próbki od pacjentów zakażonych HIV1. Inkubacja przez 45-60 minut z 1% PFA i 15-20 minut z 4% PFA (np. buforem firmy BioLegend) jest wystarczająca do pełnego utrwalenia komórek, a komórki mogą być wykorzystane do dalszego przetwarzania (permeabilizacja dla celów wewnątrzkomórkowych) lub przechowywane do przyszłych analiz na tym etapie.
Podczas rutynowej procedury barwienia w cytometrii przepływowej, która obejmuje barwienie markerów powierzchniowych, istnieje kilka etapów, w których można zdecydować się na utrwalenie próbek – utrwalenie po barwieniu markerów powierzchniowych lub utrwalenie przed.
W niektórych przypadkach decyzja o tym, kiedy można utrwalić jest… stała. Na przykład, jeśli analizujemy fosfo-cele, wiązanie niektórych antygenów powierzchniowych przez przeciwciała może zmienić wewnątrzkomórkowe szlaki sygnalizacyjne wkrótce po kontakcie, prowadząc do artefaktów w wynikach fosforylacji. W takim przypadku należy utrwalić komórki przed dodaniem przeciwciał powierzchniowych (dlatego zalecany przez nas protokół użycia buforu True-Phos™ Perm Buffer do analizy wewnątrzkomórkowych celów fosforylacji jest tak skonstruowany, że etap utrwalania poprzedza inne procedury). Każda z tych metod ma swoje zalety i wady, ale oto kilka rzeczy, na które należy zwracać uwagę w każdym przypadku.