Alai

Rak głowy i szyi jest siódmym najczęstszym typem raka pod względem zachorowalności i śmiertelności, z 890 000 nowych przypadków i 450 000 zgonów na całym świecie w 2018 roku . Leczenie pozostaje wyzwaniem z obecnymi terapiami skutkującymi pięcioletnimi wskaźnikami przeżycia poniżej 50% dla pacjentów z miejscowo zaawansowaną chorobą . Oporność na leki i toksyczność ograniczają skuteczność chemioterapeutyków, takich jak cis- lub karboplatyna, 5-fluorouracil i taksany. Wprowadzenie leków celowanych, takich jak cetuximab, nivolumab czy pembrolizumab, poprawiło wyniki leczenia, ale nie rozwiązało problemu pierwotnej lub nabytej oporności na leczenie u większości chorych. Tylko bardzo niewiele biomarkerów jest obecnie stosowanych w praktyce klinicznej lub zostało poddanych walidacji do rutynowego stosowania. Wiarygodne modele przedkliniczne są zatem niezbędne do lepszego zrozumienia mechanizmów molekularnych związanych z opornością na leczenie i progresją HNSCC oraz do opracowania bardziej skutecznych strategii terapeutycznych.

Immortalizowane linie komórkowe pochodzące z guzów HNSCC stanowią cenne narzędzie do analizy funkcjonalnej oporności na leczenie. Badania przesiewowe leków w monowarstwowych hodowlach komórkowych pozostają powszechnym podejściem do identyfikacji nowych środków terapeutycznych. Jednakże, hodowle trójwymiarowe (3D), które lepiej odzwierciedlają architekturę tkanki nowotworowej i środowisko komórkowe, mogą być lepsze w przewidywaniu skuteczności leków u pacjentów. Rzeczywiście, w badaniach wykorzystujących hodowle komórkowe 3D wykazano duże różnice we wrażliwości na promieniowanie i leki, podobne do tych, jakie stwierdzono w przypadku guzów in vivo. Nawet jeśli hodowle 3D są przydatne do badania interakcji pomiędzy różnymi populacjami komórek, nie odtwarzają one w pełni złożoności HNSCC. Tak więc, rozwój nowych terapii może ostatecznie wymagać klinicznie istotnych modeli zwierzęcych HNSCC, które dokładnie reprezentują zmiany komórkowe i molekularne związane z inicjacją i progresją ludzkiego nowotworu. W związku z tym do badań nad HNSCC wprowadzono modele HNSCC indukowane karcynogenami, zwierzęta transgeniczne oraz modele ksenograftów przeszczepialnych. W niniejszym artykule opisano najczęściej stosowane przedkliniczne modele HNSCC (schematycznie przedstawione na ryc. 1) oraz przedstawiono ich zalety i ograniczenia. Omawiamy również nowe podejścia do wyboru spersonalizowanego leczenia w oparciu o te modele.

Modele ex vivo

Immortalizowane linie komórkowe HNSCC

Czterdzieści lat temu zgłoszono pierwsze protokoły hodowli ex vivo komórek HNSCC. Po rozwiązaniu wcześniejszych problemów, takich jak przerost fibroblastów i zależność od warstw odżywczych, dzięki tym protokołom udało się stworzyć linie komórkowe HNSCC. Od tego czasu techniki hodowlane zostały udoskonalone, a różne linie komórkowe HNSCC rosnące stabilnie przez wiele pasaży zostały wygenerowane. Szczegółowy opis wszystkich dostępnych linii komórkowych HNSCC wykraczałby poza ramy niniejszego opracowania. Chcielibyśmy zatem odesłać czytelnika do dwóch wcześniejszych artykułów przeglądowych. Ponieważ unieśmiertelnione linie komórkowe HNSCC mogą być łatwo utrzymywane i rozszerzane, były one szeroko wykorzystywane do badania zmian genetycznych i biologicznych odpowiedzi na chemiczne i genetyczne perturbacje, do identyfikacji potencjalnych celów molekularnych oraz do rozwoju nowych małych cząsteczek i terapii biologicznych. Ostatnio pojawiły się dowody na to, że te linie komórkowe mogą być również wykorzystywane do badania heterogenności wewnątrzkomórkowej i ewolucji klonalnej zachodzącej pod presją terapii. Dane z takich kompleksowych badań molekularnych i funkcjonalnych w tych modelach zostały zebrane w bibliotekach takich jak Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE), reprezentujących cenne repozytorium ludzkiej różnorodności nowotworowej .

Chociaż linie komórkowe HNSCC hodowane w dwuwymiarowych (2D) monowarstwowych kulturach nadal są ważnymi modelami w poszukiwaniu nowych metod terapeutycznych dla tej choroby, generalnie cierpią z powodu niezdolności do odzwierciedlenia charakteru histologicznego, trójwymiarowej (3D) architektury oraz różnic strukturalnych i funkcjonalnych guza in vivo. Te ograniczenia znacząco wpływają na wartość informacyjną badań in vitro oceniających skuteczność ustalonych i nowych metod leczenia HNSCC w hodowlach jednowarstwowych. Istotnie, odnotowano znaczące różnice we wrażliwości hodowli 2D w porównaniu do 3D linii komórkowych HNSCC na promieniowanie i leczenie farmakologiczne, np. cisplatyną, cetuximabem i inhibitorem mTOR AZD8055 . Porównawcza analiza molekularna komórek rosnących w hodowlach 2D versus 3D dostarczyła możliwych wyjaśnień mniejszej wrażliwości komórek w hodowlach 3D, takich jak ekspresja i aktywacja genów związanych z naprawą DNA oraz zwiększony poziom ekspresji genów związanych z przejściem nabłonkowo-mezenchymalnym i macierzystością w warunkach 3D.

Niestabilność genetyczna i występowanie selekcji klonalnej podczas hodowli in vitro są kolejnymi potencjalnymi ograniczeniami nowotworowych linii komórkowych i mogą wyjaśniać, dlaczego wyniki badań z udziałem linii komórkowych są często trudne do odtworzenia. Rzeczywiście, kompleksowa analiza szczepów z powszechnie używanych linii komórkowych raka piersi MCF7 i raka płuc A549 ujawniła rozległą zmienność genomową między szczepami, która była związana z różnicami w biologicznie znaczących właściwościach komórkowych. Co ważne, kiedy szczepy były testowane przeciwko 321 związkom przeciwnowotworowym, zaobserwowano znacząco różne odpowiedzi na leki, z co najmniej 75% związków silnie hamujących niektóre szczepy, ale całkowicie nieaktywnych w innych. Badanie to wyraźnie podkreśla pilną potrzebę udoskonalonych modeli ex vivo w celu wsparcia maksymalnie powtarzalnych badań nad rakiem.

Zaawansowane modele ex vivo HNSCC

Köpf-Maier i współpracownicy jako pierwsi stworzyli metodę, która pozwoliła ludzkim komórkom raka z różnych jednostek histologicznych, w tym raka płaskonabłonkowego (SCC) gardła, zreorganizować się in vitro do „struktur organoidowych”. Wykazali, że te organoidalne kultury zachowały krytyczne właściwości stanu in vivo, takie jak architektura 3D, wzrost heterogenicznych typów komórek z pojedynczego raka i morfologiczne zróżnicowanie w stosunkowo prostych warunkach eksperymentalnych. W kolejnym badaniu ta sama grupa wykazała, że te organoidalne kultury mogą być wykorzystywane do testowania leków, a uzyskane w nich dane dotyczące odpowiedzi były zgodne z odpowiedzią pacjentów na terapię. Autorzy byli pierwszymi, którzy zaproponowali kultury organoidów jako spersonalizowaną platformę testowania leków in vitro, pozwalającą na przewidywanie indywidualnej chemowrażliwości raków w ciągu kilku dni.

Od tego czasu techniki hodowli tkanek in vitro w 3D jako struktur organotypowych zostały udoskonalone. Protokoły zostały opracowane w celu ustanowienia organoidów z dorosłych i embrionalnych komórek macierzystych, które są w stanie samoorganizować się w struktury 3D, które odzwierciedlają tkankę pochodzenia (dla przeglądu zobacz Clevers, 2016 ). Pierwsze hodowle organoidów pochodzących z dorosłych komórek macierzystych zostały utworzone z komórek macierzystych jelita myszy, które zostały umieszczone w warunkach naśladujących niszę komórek macierzystych jelita . Wykazano, że warunkowe przeprogramowanie wywołane przez dodanie R-spondin-1, naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) i Noggin do pożywki hodowlanej oraz osadzenie komórek w ekstrakcie z błon podstawnych dostarczającym macierzy zewnątrzkomórkowej, stymuluje dorosłe komórki macierzyste do samoodnowy, proliferacji i tworzenia zróżnicowanego potomstwa, przypominającego nabłonek jelitowy . Technika ta, początkowo opracowana do badania zainfekowanej, zapalnej i nowotworowej tkanki ludzkiego przewodu pokarmowego, została wykorzystana nie tylko do tworzenia kultur organoidalnych z różnych ludzkich normalnych tkanek, ale także z tkanki nowotworowej pochodzącej od pacjenta. Badania te znacznie powiększyły i poprawiły zestaw dostępnych modeli nowotworów.

Ostatnio, wczesne ustalenia Köpf-Maier i współpracowników dotyczące kultur organoidalnych HNSCC będących odpowiednią platformą do testowania leków in vitro zostały potwierdzone przez kilka niezależnych badań. Chociaż odnotowano znaczne różnice we wskaźnikach sukcesu w tworzeniu pierwotnych, długo rosnących kultur organoidów od pacjentów z HNSCC (30% versus 65%), wszystkie dotychczasowe badania zgodnie opisały, że organoidy zachowują wiele właściwości pierwotnego guza, w tym heterogenność wewnątrzgruczołową, profil mutacji i wzorce ekspresji białek. Ponadto wykazano, że organoidy zachowały swój potencjał nowotworowy po ksenotransplantacji. Stwierdzono, że odpowiedzi na leczenie lekami in vivo były podobne do IC50 obliczonych z organoidów za pomocą testów wrażliwości na leki in vitro. Ponadto dane dotyczące radiosensytywności z badań organoidów korelowały z odpowiedzią kliniczną u pacjentów. Co ważne, nie tylko efekty związane z leczeniem w guzach, ale także niepożądane efekty uboczne terapii w normalnej tkance mogą być badane w modelach organoidów. Na przykład, organoidy ślinianek pochodzące od pacjentów były wykorzystywane do badania molekularnych podstaw hiposuplementacji, częstego poważnego efektu ubocznego promieniowania. Kolejne badanie zidentyfikowało pierwotne hodowle komórek 2D z guzów pacjentów z HNSCC jako dodatkowy cenny model ex vivo HNSCC. Tutaj, zindywidualizowane badania przesiewowe na dużą skalę terapii przeciwnowotworowych odtworzyły leki wykazujące aktywność przeciwnowotworową w dopasowanych modelach PDX (patient-derived xenograft), dostarczając w ten sposób dodatkowych dowodów na to, że pierwotne hodowle HNSCC mogą być wykorzystywane do wspierania podejmowania decyzji terapeutycznych w rutynowych warunkach klinicznych.

Organoidalne hodowle ludzkich normalnych, dysplastycznych i złośliwych tkanek języka zostały również wykorzystane do odtworzenia głównych etapów nowotworzenia języka. Analizy histomorfometryczne, immunohistochemiczne i mikroskopii elektronowej w trójwymiarowych ko-kulturach pochodzących z języka pierwotnych keratynocytów i fibroblastów w macierzy kolagenowej wykazały, że wzrost warstwowy, proliferacja komórek i różnicowanie były porównywalne między ko-kulturami i ich odpowiednimi tkankami rodzimymi, jednak różniły się znacznie w kulturach hodowanych bez fibroblastów. Wyniki te potwierdzają wcześniejsze badania wskazujące na istotną rolę fibroblastów związanych z nowotworem w patogenezie HNSCC. Dane te wraz z obszerną literaturą na temat promującego nowotwór wpływu mikrośrodowiska guza (TME) silnie przemawiają za stosowaniem w przyszłości bardziej zaawansowanych modeli przedklinicznych, zawierających wszystkie główne komponenty TME. Obecnie dostępne są nowe protokoły do generowania organoidów zawierających oprócz komórek zrębu także komórki odpornościowe pacjenta. Tak więc, chociaż hodowle organoidów mają pewne ograniczenia, takie jak konieczność poświęcenia znacznej ilości czasu i środków oraz włączenie nieokreślonych czynników zewnętrznych, które mogą wpływać na wynik eksperymentów (Tabela 1), kultury te mogą stanowić odpowiednie modele do rozwoju i optymalizacji przyszłych strategii leczenia, w tym leków immunoonkologicznych.

Modele zwierzęce

Zwierzęce modele raka jamy ustnej indukowane kancerogenami

Większość ludzkich SCC jest indukowana przez przewlekłą ekspozycję na kancerogeny. Początkowo eksperymentalne metody chemicznego wywoływania nowotworów złośliwych jamy ustnej zawsze kończyły się niepowodzeniem, ponieważ błona śluzowa jamy ustnej była bardziej odporna na działanie chemikaliów niż skóra. W końcu, stosując 9, 10 dimetylo-1, 2, benzantracen (DMBA), udało się z powodzeniem wywołać HNSCC w woreczku policzkowym chomika jako modelu zwierzęcym. Podobnie jak u pacjentów, karcynogeneza błony śluzowej przebiegała w czterech kolejnych etapach: hiperplazji, hiperplazji atypowej, raka in situ i raka kolczystokomórkowego. Jednak rozróżnienie pomiędzy zmianami nabłonka spowodowanymi bezpośrednim kontaktem z kancerogenem a prawdziwą transformacją przednowotworową było trudne, ponieważ w guzach policzków indukowanych DMBA zmiany były przemijające i odwracalne. Ponadto, guzy indukowane DMBA nie posiadały wielu histologicznych cech zróżnicowanego HNSCC i nie przypominały wczesnych zmian u ludzi. Co ważniejsze, guzy występowały w kieszonce policzkowej chomika, która reprezentuje obszar o obniżonej odporności nieobecny u ludzi, więc model ten nie naśladował dobrze ludzkiego HNSCC. Chociaż DMBA był następnie szeroko stosowany w modelach raka jamy ustnej chomika i szczura, okazało się, że trudno jest wywołać raka jamy ustnej za pomocą DMBA u myszy. Tlenek 4-nitrochinoliny (4-NQO), rozpuszczalna w wodzie pochodna chinolonu, został następnie wprowadzony jako silny czynnik indukujący nowotwory jamy ustnej. Podawanie 4-NQO z wodą pitną lub jego miejscowe stosowanie powodowało liczne zmiany dysplastyczne, przednowotworowe i nowotworowe po długotrwałym leczeniu zarówno w modelu szczurzym, jak i mysim, a zmiany te ściśle przypominały transformację nowotworową jamy ustnej u ludzi. Po kilku modyfikacjach model ten został znormalizowany przez Tang et al. , którzy wykazali, że podawanie 4-NQO do wody pitnej myszy C57BL/6 przez 16 tygodni sprzyja karcynogenezie jamy ustnej z dużą częstością.

Poprzez odtworzenie sekwencji zdarzeń i typu zmian obserwowanych podczas karcynogenezy u ludzi, opisane powyżej modele zwierzęce indukowane karcynogenami stanowią doskonały system in vivo do badania kluczowych zdarzeń sterujących karcynogenezą jamy ustnej. Modele te były również szeroko wykorzystywane do opracowywania strategii chemoprewencji nowotworów, podczas gdy mniejsza liczba badań wykorzystała te modele zwierzęce do oceny skuteczności leków w leczeniu ustalonych guzów. Jednym z głównych ograniczeń jako platformy do badań przesiewowych nad lekami jest wydłużony czas potrzebny do zakończenia oceny efektów działania badanego związku (Tabela 1). Większość modeli zwierzęcych HNSCC wymaga do 40 tygodni, aby rozwinąć pełnoobjawowy rak, a nawet dłużej, jeśli punktem końcowym badania są przerzuty. W tym kontekście, ostatnie doniesienie Wang i współpracowników oferuje potencjalne skróty poprzez wykorzystanie xenograftów guza języka pochodzących z linii komórkowej 4NQO jako alternatywnego, bardziej celowego modelu myszy syngenicznej. Główną zaletą modelu zwierzęcego indukowanego 4NQO jest jego przydatność do badania wpływu czynników rakotwórczych i genetycznych w nowotworzeniu, szczególnie w środowisku immunokompetentnym. Stanowi on zatem odpowiednią platformę do przyspieszenia rozwoju schematów immunoterapeutycznych w HNSCC. Model ten został również z powodzeniem wykorzystany do badania roli komórek macierzystych nowotworu w oporności na leczenie, nawrotach i przerzutach. Jego potencjał do opracowywania nowych strategii terapeutycznych ukierunkowanych nie tylko na proliferacyjną masę guza, ale także na względnie spokojną subpopulację macierzystych komórek nowotworowych został ustalony.

Genetycznie modyfikowane modele mysie

Podczas gdy uszkodzenia DNA przez substancje chemiczne pojawiają się losowo, zgodnie z teorią ewolucji nowotworów, po losowym nabyciu mutacji w całym genomie następuje selekcja klonów posiadających zmiany genetyczne, które ułatwiają przeżycie i proliferację komórek. Badania profilowania molekularnego pozwoliły na zidentyfikowanie kilku potencjalnych genów regulatorowych, które przyczyniają się do rozwoju nowotworu w HNSCC. Jednakże, te badania molekularne nie dostarczyły bezpośrednich dowodów na przyczynowość lub szczegółowy wgląd w mechanizmy biologiczne, dzięki którym te geny napędzają rozwój nowotworu. Chociaż modele zwierzęce indukowane przez kancerogeny mogą dokładnie odtworzyć heterogenny krajobraz zmian genomowych w ludzkich guzach pierwotnych, tylko część z tych mutacji napędza nowotworzenie poprzez wpływ na onkogeny lub geny supresorowe nowotworów, ale wiele mutacji jest pasażerami bez wyraźnego udziału w rozwoju nowotworu. Badania te nie ujawniają również, czy mutacje kierujące są niezbędne do utrzymania guza i dlatego mogą być w ograniczonym stopniu przydatne do projektowania skutecznych strategii terapeutycznych. W przeciwieństwie do tego, przedkliniczne systemy modelowe, takie jak genetycznie modyfikowane modele myszy (GEMMs) zapewniają podejście eksperymentalne, w którym biologiczne efekty specyficznych mutacji mogą być szczegółowo badane w kontrolowanym tle genetycznym. W kolejnych rozdziałach opisujemy kluczowe ustalenia z poprzednich badań opartych na GEMMs w HNSCC.

Do tej pory opisano niewiele GEMMs związanych ze spontanicznym powstawaniem HNSCC przy braku przewlekłej ekspozycji na kancerogen (Tabela 2). Genetycznie zmodyfikowany mysi model raka jamy ustnej został po raz pierwszy wprowadzony przez Schreibera i współpracowników . Po skrzyżowaniu myszy transgenicznych dla genu v-Ha-ras z myszami transgenicznymi, które były nosicielami E6/E7 wirusa brodawczaka ludzkiego (HPV)-16, zaobserwowano rozwój guzów w jamie ustnej, uchu i oku rozpoczynający się w wieku około 3 miesięcy. Do 6 miesiąca 100% zwierząt bi-transgenicznych miało rozwinięte guzy jamy ustnej, podczas gdy częstość występowania w każdej z dwóch grup single-transgenicznych wynosiła 0%. Warunek wstępny drugiego trafienia genetycznego dla nowotworzenia został również zgłoszony dla modelu transgenicznego K-rasG12D, w którym indukowana tamoksyfenem rekombinaza Cre pod kontrolą promotora keratyny-14 (K14) została wykorzystana do ukierunkowania endogennego locus K-ras. W modelu z pojedynczym transgenem, po 1 miesiącu leczenia tamoksyfenem obserwowano jedynie duże brodawczaki w jamie ustnej i hiperplazje na języku. Jednakże, jeśli myszy krzyżowano z myszami p53 floxed conditional knockout, 100% myszy mieszanych rozwijało raka języka już po 2 tygodniach od indukcji tamoksyfenem. Oprócz ekspresji onkogenów wirusowych E6/E7 i utraty TP53, homozygotyczna delecja czynnika transkrypcyjnego krüppel-like-factor 4 (KLF4) i heterozygotyczna delecja SMAD4 zostały zidentyfikowane jako drugie trafienia genetyczne, które w połączeniu z onkogenną mutacją sterującą promują powstawanie nowotworów jamy ustnej z dużą częstością (Tabela 2).

Pomimo rekapitulacji progresji HNSCC, przydatność wyżej opisanych modeli HNSCC jako platformy do badań nad nowymi metodami leczenia ukierunkowanego molekularnie pozostaje wątpliwa, biorąc pod uwagę, że mutacje genetyczne napędzające nowotworzenie u tych zwierząt nie występują lub występują rzadko u pacjentów z HNSCC. W sumie mutacje HRAS i KRAS wykryto jedynie u 6 i 0,2% chorych na HNSCC, a homozygotyczną delecję KLF4 i SMAD4 odpowiednio u 0 i 4% przypadków. Co więcej, w kohorcie The Cancer Genome Atlas (TCGA) HNSCC nie zidentyfikowano przypadków posiadających jeden z genotypów GEMM opisanych powyżej. GEMM spontanicznego HNSCC, bardziej zbliżonym do molekularnych cech ludzkiej choroby, może być model pojedynczego zdelecjonowanego genu SMAD4 w nabłonku głowy i szyi (HN-Smad4del/del) opisany przez Bornsteina i współpracowników. Rzeczywiście, chociaż homozygotyczna delecja jest rzadka, heterozygotyczna utrata SMAD4 jest wykrywana w 30-35% pierwotnych HNSCC, co wiąże się z obniżeniem poziomu ekspresji Smad4. Ostatnio odnotowano znaczną heterogenność utraty SMAD4 w pierwotnych guzach HNSCC. Co ciekawe, w hodowlach ex vivo pochodzących z PDX, subpopulacja komórek wykazujących heterozygotyczną utratę SMAD4 poprzez delecję lub zmniejszoną ekspresję przewyższała komórki z dzikim genotypem SMAD4 z guza macierzystego, sugerując przewagę przeżycia komórek z niedoborem Smad4. W dalszym wsparciu przydatności tego pojedynczego wybrakowanego GEMM, HNSCC z myszy HN-Smad4del/del wykazywał zwiększoną niestabilność genomową, która korelowała z obniżoną ekspresją i funkcją genów kodujących białka w szlaku naprawy DNA niedokrwistości Fanconiego/BRCA, również związanym z podatnością na HNSCC u ludzi. Ponadto, zarówno prawidłowa tkanka głowy i szyi, jak i HNSCC pochodzące od myszy HN-Smad4del/del wykazywały nasilony stan zapalny, który również został powiązany z patogenezą u ludzi, gdzie bakterie jamy ustnej i mediatory zapalne związane z chorobami przyzębia mogą być współczynnikami w inicjacji i promocji SCC jamy ustnej .

Od czasu oryginalnego raportu w 2009 roku, model HN-Smad4del/del był używany do szczegółowej analizy procesów molekularnych zaangażowanych w nowotworzenie HNSCC. Według naszej wiedzy, nie został on jeszcze wykorzystany do opracowania nowych strategii terapeutycznych. Ograniczenie to można tłumaczyć medianą czasu rozwoju nowotworu w tym modelu wynoszącą 40 tygodni, co jest ograniczeniem podobnym do zwierzęcych modeli raka jamy ustnej indukowanych karcynogenami (Tabela 2). Integracja leczenia rakotwórczego w celu przyspieszenia tworzenia się guza w GEMMs z pojedynczym transgenem może zatem stanowić właściwy sposób rozwiązania tego ograniczenia, jak już z powodzeniem wykazano w badaniach GEMMs posiadających delecję w genie supresorowym guza (GRHL3 , PTEN ) lub nadekspresję onkogennych mikroRNA (Tabela 1).

Patient-derived xenograft models

Opracowanie i udoskonalenie szczepów myszy o znacznym upośledzeniu odporności znacznie zwiększyło dostępność modeli PDX do badań nad nowotworami. Udane stworzenie modeli PDX HNSCC zostało zgłoszone przez kilka grup badawczych. W naszej własnej serii zaobserwowano ogólny wskaźnik zrostu wynoszący 48%, jednak wskaźniki zrostu wydawały się być bardzo różne w różnych podgrupach pacjentów. Czynniki ograniczające możliwość wszczepienia nie zostały jeszcze jednoznacznie zidentyfikowane. Miejsce wszczepienia i szczepy myszy wydają się wpływać na wskaźnik pobrań. Ponadto, patologiczne czynniki ryzyka, takie jak histologia guza i status HPV są ważnymi czynnikami determinującymi tworzenie PDX. Ogólnie rzecz biorąc, niezróżnicowane guzy HPV-ujemne, wykazujące agresywny wzrost, są bardziej podatne na zrastanie się. W związku z tym, szybkość i kinetyka zrastania się PDX jest związana z niekorzystnym rokowaniem pacjentów. W przeciwieństwie do guzów HPV-negatywnych, guzy HNSCC związane z HPV często nie ulegają zrostowi. Ponieważ guzy te rosną w miejscach związanych z układem immunologicznym, takich jak migdałek podniebienny czy podstawa języka, ich przeszczepianie myszom z niedoborem odporności, u których brak jest kontroli immunologicznej nad komórkami zakażonymi wirusem, niesie ze sobą ryzyko współtransferu komórek B pozytywnych dla wirusa Epsteina-Barr (EBV). W wyniku tego często dochodzi do niekontrolowanej proliferacji komórek B i transformacji do chłoniaka EBV+. Ponieważ tempo proliferacji tych sztucznych chłoniaków jest znacznie wyższe niż proliferacja komórek nowotworowych w przeszczepionych fragmentach tkanki SCC, pierwotne przeszczepy nowotworowe są często przerośnięte. Tak więc, histopatologiczna walidacja PDX przez patologa z certyfikatem zarządu jest niezbędna do potwierdzenia histologii raka płaskonabłonkowego modelu.

Kwestia, jak dobrze PDX przypominają pierwotny guz pacjenta, została podjęta przez wiele grup. Jak wykazano dla innych jednostek nowotworowych, ustalone modele HNSCC u myszy wykazują cechy histopatologiczne podobne do pierwotnego guza pacjenta. Kompleksowa analiza genetyczna guzów pierwotnych i uzyskanych modeli PDX za pomocą sekwencjonowania następnej generacji ujawniła podobne wzorce i częstotliwości alleliczne aberracji molekularnych. Korelacja między profilami mutacyjnymi guzów pierwotnych i modeli pochodnych była znacznie wyższa dla PDX (R = 0,94) w porównaniu z liniami komórkowymi (R = 0,51). Analiza metylomu również wykazała wysoką zgodność między PDX i guzami pacjentów. Rzeczywiście, średnio tylko 2,7% badanych miejsc CpG uległo poważnym zmianom metylacji w wyniku przeszczepienia guzów do myszy. Co więcej, badania ekspresji genów wykazały ogólne pokrewieństwo guzów rodzicielskich z ich PDX, co zostało potwierdzone przez ich wspólne grupowanie w nienadzorowanej hierarchicznej analizie skupień. W przeciwieństwie do rosnącej liczby dowodów na zgodność profili genomu i transkryptomu między PDX i pierwotnymi HNSCC, istnieje tylko kilka danych dotyczących ekspresji białek. Pierwsza wstępna analiza tkanki PDX przy użyciu odwrotnej fazy matrycy białkowej (RPPA) ujawniła profile białkowe porównywalne z danymi TCGA HNSCC dotyczącymi ekspresji białek, co sugeruje podobieństwo między oryginalną tkanką a modelem pochodnym również na tym poziomie.

Kluczową cechą PDX jest zachowanie przedziału stromalnego. Nawet jeśli ludzki zrąb jest zastępowany zrębem mysim w pierwszych pasażach, zintegrowany zrąb pozostaje, co umożliwia ocenę związków skierowanych na ten przedział lub krzyżowanie się przedziału zrębowego z komórkami nowotworowymi. Ponadto, guzy hodowane na myszach budują własne naczynia krwionośne, co daje możliwość oceny sieci angiogennej i interferencji ze związkami skierowanymi na angiogenezę. Po stworzeniu modelu, guzy hodowane u myszy mogą być pobierane, żywotnie zamrażane i w razie potrzeby rozmrażane i ponownie przeszczepiane myszom. Ogólnie rzecz biorąc, PDX można uznać za odpowiednią metodę ekspansji tkanki nowotworowej i obiecujący przedkliniczny system modelowy do badań mechanistycznych i rozwoju strategii terapeutycznych.

Wraz z niedawnym pojawieniem się immunoterapii w algorytmie leczenia wielu typów nowotworów, w tym HNSCC, brak funkcjonalnego środowiska immunologicznego w PDX stał się główną przeszkodą do pokonania. Różne strategie zostały zaproponowane w celu wdrożenia systemu immunologicznego u myszy z niedoborem odporności. W przełomowym badaniu Mosier i współpracowników wykazano, że wstrzyknięcie ludzkich jednojądrowych komórek obwodowych (PBMCs) spowodowało stabilną, długoterminową rekonstytucję funkcjonalnego ludzkiego układu odpornościowego u myszy z ciężkim połączonym niedoborem odporności (SCID). Tak więc, immunoproficientne modele PDX mogą być generowane poprzez transfer PBMC pacjenta do myszy noszących PDX. Jednak w tym podejściu brakuje prawidłowego rozwoju komórek odpornościowych i primingu komórek T, co skutkuje brakiem pewnych linii ludzkich komórek odpornościowych u myszy. Opracowane później bardziej zaawansowane protokoły rekonstytucji immunologicznej opierają się na transferze ludzkich komórek macierzystych CD34+ do myszy NSG, jak również na wszczepianiu ludzkiej płodowej grasicy i tkanki wątrobowej pod torebkę nerki tych myszy. Podejście to doprowadziło do długotrwałego wszczepienia i systemowej rekonstytucji kompletnego ludzkiego układu odpornościowego, w tym wielopostaciowych ludzkich komórek odpornościowych składających się z limfocytów T-, B-, NK-, komórek dendrytycznych i makrofagów. Niestety, metoda ta nie jest możliwa do zastosowania w przypadku dużej liczby PDX ze względu na złożoność modelu. Bardziej obiecująca procedura została zaproponowana w czerniaku, gdzie limfocyty T przenikające przez guz (TILs) wyizolowane z tkanki guza używanej do generowania PDX zostały rozszerzone in vitro przez ludzką interleukinę 2 (IL2) przed wstrzyknięciem do myszy PDX noszących guz .

Potencjał modeli PDX do kierowania leczeniem pacjenta

Wartość PDX do kierowania indywidualną decyzją o leczeniu pacjenta pozostaje do wyjaśnienia. Ogólnie rzecz biorąc, korelacje pacjent-to-PDX w różnych jednostkach nowotworowych porównujące odpowiedzi na leczenie między myszami i pacjentami zostały wykonane przy użyciu retrospektywnych danych o wynikach klinicznych. Według naszej wiedzy, w HNSCC nie przeprowadzono takich porównań na wystarczająco dużej próbie. Przeszkodą dla wiarygodności takiego podejścia jest dawkowanie leku u myszy, które zwykle odzwierciedla maksymalną tolerowaną dawkę, zmienność dawki w obrębie różnych szczepów myszy, a zwłaszcza definicja klinicznie istotnego punktu końcowego. W warunkach klinicznych odpowiedzi nowotworowe są określane przez RECIST. U myszy, bardzo niejednorodny zestaw możliwych punktów końcowych został użyty do określenia skuteczności leczenia pojedynczymi lekami, włączając regresję guza wyrażoną jako względne zahamowanie wzrostu, objętość guza w porównaniu z grupą kontrolną, zahamowanie wzrostu guza i czas do punktu końcowego. Dalsze ogólne ograniczenia modelu to wysoki koszt utworzenia PDX, zróżnicowane wskaźniki wszczepienia i czas od pierwszej transplantacji do uzyskania wyników przesiewowych leczenia. Jak dotąd, w naszej dużej kolekcji prawie 80 modeli PDX HNSCC nie udało nam się ustalić wartości predykcyjnej specyficznych dla leku odpowiedzi guza w modelu ksenograftowym. Niemniej jednak, kilka firm reklamuje PDX jako narzędzie do przewidywania odpowiedzi na leczenie. W 2016 roku firma Champions Oncology rozpoczęła badanie wykonalności (NCT02752932) w celu zbadania wartości predykcyjnej PDX. Niestety, do chwili obecnej nie opublikowano żadnych wyników.

Główną wadą PDX jest wydłużony czas potrzebny na utworzenie i ekspansję modelu w porównaniu z organoidami, co czyni ich przyszłe zastosowanie jako indywidualnej platformy przesiewowej leków w rutynie klinicznej mniej prawdopodobnym. Ponadto, ponowna rekonstytucja składnikami TME pochodzącymi od pacjenta, których brakuje w obu modelach generowanych przez obecne protokoły, powinna być znacznie łatwiejsza do osiągnięcia w organoidach niż w mysich modelach ksenograftowych. Pozwoli to na włączenie terapii przeciwnowotworowych oddziałujących na TME (np. ewerolimus, bewacizumab, przeciwciała anty-PD-1/PD-1 L) do przyszłych badań przesiewowych ex vivo.