Alai

Fibroblasty RTT wykazują wadliwą aktywację autofagii w warunkach głodzenia

W celu weryfikacji hipotezy dotyczącej wadliwej autofagii u pacjentów z RTT, przeanalizowaliśmy aktywację autofagii w warunkach głodzenia w pierwotnych fibroblastach skóry wyizolowanych od pacjentów z RTT (n = 4) i osób zdrowych (n = 4)17,19.

W pierwszej kolejności określiliśmy żywotność w czasie zdrowych i RTT fibroblastów hodowanych w pożywce głodowej zarówno za pomocą testu MTT, jak i testu wykluczenia błękitu trypanu. W odniesieniu do żywotności fibroblastów RTT hodowanych w podłożu standardowym, żywotność fibroblastów RTT zmniejszyła się po 4 h głodzenia (20 ± 3,3% umierających komórek, p < 0,05); odsetek ten znacznie wzrósł po 6-8 h głodzenia (60 ± 5,1% umierających komórek, p < 0,05) (ryc. 1a). I odwrotnie, zdrowe fibroblasty były nadal w pełni żywotne po 4 h głodzenia z bardzo niskim spadkiem żywotności po 6-8 h (10 ± 1,2% umierających komórek, p < 0,01) w odniesieniu do żywotności fibroblastów hodowanych w podłożu standardowym (ryc. 1a). Tak więc z bezpośredniego porównania żywotności obu linii komórkowych w każdym punkcie czasowym wynikało, że żywotność fibroblastów RTT była poważnie zagrożona począwszy od czasu 4 h (patrz szczegóły w legendzie ryciny, p < 0,05). Ponadto, analiza Western blotting (WB) podkreśliła, że w fibroblastach RTT, które były głodzone przez 4 h, pasmo odpowiadające fragmentowi p25 polimerazy poli (ADP-rybozy)1 (PARP) było znacznie zwiększone (96 ± 4%, p < 0,001) w odniesieniu do słabej detekcji w czasie 0. Fragment ten jest uwalniany przez zależną od kaspazy degradację białka podczas wczesnej fazy indukcji apoptozy (Rys. 1b)35. Fragment p25 był prawie niewykrywalny w zdrowych fibroblastach w tych samych warunkach eksperymentalnych.

Dane te potwierdziły, że fibroblasty RTT nie tolerowały wzrostu w głodowym medium i szybko ulegały apoptozie. Dlatego dalej badaliśmy przepływ autofagiczny poprzez monitorowanie klirensu markera LC3B-II w obecności i przy braku inhibitora lizosomu, takiego jak chlorochina (CQ)24,25,26,27,28,29,30.

Po wykluczeniu efektu cytotoksycznego związanego z CQ (Supplementary Fig. S1), fibroblasty zdrowe i RTT hodowano w podłożu spoczynkowym lub głodowym przez 2 h w obecności lub nieobecności 20 µM CQ w celu ilościowego oznaczenia stosunku LC3B-II/GAPDH metodą WB (Fig. 2a). Wzorzec stosunku LC3B-II/GAPDH (lub jakiejkolwiek innej kontroli wewnętrznej, która nie jest modulowana przez autofagię) w warunkach aktywacji autofagii oraz w obecności i w nieobecności CQ (lub jakiegokolwiek innego inhibitora lizosomalnego) jest uważany za ważną strategię monitorowania strumienia autofagii.

W zdrowych fibroblastach, hodowanych w standardowej pożywce, LC3B-I był wyraźnie wykrywany immunologicznie, podczas gdy LC3B-II był słaby. Stosunek LC3BII/GAPDH w zdrowych fibroblastach hodowanych w podłożu standardowym przy braku i w obecności CQ był porównywalny (Rys. 2a, lewy panel). Obserwacja ta sugeruje, że podstawowa autofagia była prawie niewykrywalna w zdrowych fibroblastach (ryc. 2a, lewy panel).

Gdy te komórki hodowano w pożywce głodowej i przy braku CQ przez 2 h, stosunek LC3B-II/GAPDH wzrósł (60 ± 4.8%, p < 0,05) w porównaniu ze stosunkiem zdrowych fibroblastów hodowanych w standardowej pożywce przy braku lub w obecności CQ (która była, jak wcześniej wspomniano, identyczna) (ryc. 2a, lewy i prawy panel). Takie zachowanie rzeczywiście wskazuje, że LC3-I faktycznie ulega lipidacji, tworząc LC3B-II, który jest wczesnym markerem aktywacji autofagii24,25,26,27,28,29,30. W celu sprawdzenia obecności tej aktywacji autofagii, hodowaliśmy komórki w pożywce głodowej w obecności CQ przez 2 h i wykazywały one dalszy wzrost stosunku LC3B-II/GAPDH (94 ± 5,5%, p < 0,001) w odniesieniu do zdrowych fibroblastów hodowanych w standardowej pożywce (ryc. 2a, lewy i prawy panel).

Ponadto, różnica pomiędzy stosunkiem LC3B-II/GAPDH zdrowych fibroblastów hodowanych w pożywce głodowej w nieobecności i w obecności CQ była statystycznie istotna (p < 0,05, Rys. 2a, lewy panel)

Tak więc, zgodnie ze standardową interpretacją wzorca LC3B-II przez analizę WB, ogólny wynik wskazuje, że przy braku składników odżywczych zdrowe fibroblasty stymulują tworzenie autofagosomów, które ulegają akumulacji w obecności CQ. Takie zachowanie jest zgodne z normalnym przepływem autofagicznym24,25,26,27,28,29,30. Co ciekawe, w przypadku fibroblastów RTT hodowanych w standardowym podłożu, podczas gdy LC3B-I był wyraźnie wykrywany immunologicznie, LC3B-II był bardzo słaby w komórkach zarówno w nieobecności, jak i w obecności CQ (Rys. 2a, lewy panel). W warunkach głodzenia i przy braku CQ, pojawienie się słabego pasma odpowiadającego LC3B-II w fibroblastach RTT tylko po długiej ekspozycji filtra sugerowało, że nastąpiła przynajmniej minimalna lipidacja LC3B-I (Rys. 2a, lewy panel). Stąd stosunek LC3B-II/GAPDH między fibroblastami RTT hodowanymi w pożywce głodowej w nieobecności CQ był zwiększony (93 ± 5,5%, p < 0,001) w odniesieniu do stosunku do fibroblastów RTT hodowanych w standardowej pożywce w nieobecności CQ (ryc. 2a, prawy panel).

Jednakże podanie CQ fibroblastom RTT hodowanym w podłożu głodowym nie spowodowało dalszego wzrostu stosunku LC3B-II/GAPDH, który był zwiększony (95 ± 3,5%, p < 0,001) w porównaniu z komórkami hodowanymi w podłożu standardowym w nieobecności CQ, ale nie był znacząco zwiększony w odniesieniu do stosunku LC3B-II/GAPDH fibroblastów RTT hodowanych w podłożu głodowym w nieobecności CQ (ryc. 2a, lewy panel). To odkrycie sugerowało, że w komórkach RTT nie dochodzi do akumulacji autofagosomów, a analiza WB wspierała blok, na pewnym poziomie, w strumieniu autofagii24,25,26,27,28,29,30,31.

Aby dodatkowo wzmocnić naszą hipotezę dotyczącą możliwego wadliwego strumienia autofagii, sprawdziliśmy degradację dwóch uznanych substratów reporterowych autofagii w zdrowych i RTT fibroblastach głodzonych przez 2 i 4 h w nieobecności CQ, a mianowicie: (i) białko p62/SQSMT1, które wspomaga usuwanie poli-ubiquitynowanych agregatów białkowych i samo jest degradowane przez hydrolazy lizosomalne36; (ii) proteasom 20 S, który jest szybko degradowany w warunkach głodzenia37,38. W odniesieniu do poziomu podstawowego tych dwóch białek (tj. Czas 0), w zdrowych fibroblastach obserwowano spadek w czasie stosunku p62/tubulina (44 ± 10% po 4 h, p < 0,001) i stosunku PSMA-3/GAPDH (tj. Podjednostka α7 proteasomu 20 S) (45 ± 3,1% po 2 h, 11 ± 5,2% po 4 h, w obu przypadkach p < 0,001) (ryc. 2b, górny panel).

W przypadku fibroblastów RTT spadek stosunku p62/tubulina w czasie nie był statystycznie istotny nawet po 4 h (89 ± 9%), natomiast spadek stosunku PSMA3/GAPDH w 2 h (81 ± 4,4%, p < 0,05) i 4 h (78 ± 5,1%, p < 0,05) był istotnie różny, jeśli porównać go z poziomem bazowym białka (tj. czasem 0) (ryc. 2b, panel dolny). Jednak różnice między grupami zdrowymi i RTT były istotne statystycznie w przypadku stosunku p62/tubulina tylko w 4 h (p < 0,05), podczas gdy stosunek PSMA3/GAPDH był istotnie różny między grupami eksperymentalnymi zarówno w 2 h (p < 0.05) i 4 h (p < 0,001) (Fig. 2b, dolny panel).

Co ciekawe, wzory β-tubuliny i GAPDH, używane jako kontrole wewnętrzne odpowiednio dla barwienia p62 i barwienia PSMA3, były niezmienione w ciągu 4 h głodzenia w zdrowych fibroblastach. Jednakże, intensywność pasma β-tubuliny, jak również pasma GAPDH, zmniejszyła się znacząco w fibroblastach RTT głodzonych przez 4 h w porównaniu z tym, co obserwowano w czasie 0 lub 2 h dla tych komórek (Rys. 2b, wyższy panel). Ta redukcja była prawdopodobnie spowodowana mniejszą liczbą żywych fibroblastów RTT zebranych w tym punkcie czasowym (zgodnie ze słabą żywotnością fibroblastów RTT po 4 h głodzenia, opisaną na Figurze 1a), a nie spowodowana spadkiem regulacji β-tubuliny w czasie. W sumie stwierdzono, że fibroblasty RTT nie degradowały wydajnie tych substratów reporterowych autofagii, wspierając hipotezę o wadliwej autofagii.

Aby rzucić dalsze światło na cechy tego bloku, przeprowadziliśmy analizę immunofluorescencyjną z użyciem przeciwciała LC3B. Analizowaliśmy fibroblasty zdrowe i RTT hodowane w standardowej pożywce przy braku CQ (stan spoczynku) oraz w pożywce głodowej przez 2 h w obecności lub braku 20 µM CQ (ryc. 2c). Zgodnie z wolnym tempem metabolizmu komórek pierwotnych, stwierdziliśmy, że spoczynkowe fibroblasty zdrowe i RTT wykazywały słabe i rozproszone zabarwienie LC3B+ z niskim odsetkiem komórek wykazujących więcej niż 10 kropek (tj. autofagosomów) (odpowiednio 8 ± 5% i 1 ± 0,5%), wskazując, że metodą immunofluorescencji podstawowa autofagia była słabo wykrywalna, zgodnie z danymi przedstawionymi na Rys. 2a.

W odniesieniu do komórek hodowanych w podłożu standardowym, odsetek zdrowych fibroblastów hodowanych w podłożu głodowym (w nieobecności CQ) wykazujących co najmniej 10 autofagosomów LC3B+ był wyraźnie zwiększony (82 ± 10%, p < 0,005), podczas gdy fibroblasty RTT hodowane w podłożu głodowym wykazywały niewielki wzrost (17 ± 8%, p < 0,001). W rzeczywistości odsetek zdrowych fibroblastów hodowanych w pożywce głodowej wykazujących co najmniej 10 autofagosomów był istotnie wyższy niż fibroblastów RTT hodowanych w tych samych warunkach doświadczalnych (p < 0,005). Autofagosomy lokalizowały się głównie w rejonie okołojądrowym. W obecności CQ obserwowano ponadto oczekiwane rozproszone i intensywne barwienie LC3B+, chociaż w tym przypadku rozproszone barwienie nie pozwalało na precyzyjne ilościowe określenie liczby kropek.

Administracja CQ była nieskuteczna w fibroblastach RTT, wyraźnie wskazując na poważnie upośledzoną biogenezę autofagosomów (ryc. 2c).

Zważywszy na znaczenie domniemanego upośledzenia biogenezy autofagosomów, przyjęto dodatkowe podejście w celu potwierdzenia tej obserwacji. Zarówno zdrowe, jak i RTT fibroblasty, głodzone przez 2 h w nieobecności CQ, barwiono specyficznym barwnikiem (Cyto-ID) dla błony autofagosomalnej i analizowano metodą immunofluorescencji. Nawet w tym przypadku, podczas gdy w zdrowych fibroblastach faktycznie wykryto kilka autofagosomów, w fibroblastach RTT zaobserwowano jedynie ograniczoną liczbę małych i izolowanych pęcherzyków (Supplementary Fig. S2). Różnica w odsetku komórek wykazujących co najmniej 5 kropek Cyto-ID pozytywnych pomiędzy fibroblastami zdrowymi i RTT była znacząco znacząca (odpowiednio 80 ± 4% vs 8 ± 6%, p < 0,001). Dlatego też ogólna analiza dostarczyła dowodów na to, że w pierwotnych fibroblastach RTT dochodzi do defektu biogenezy autofagosomów.

Dojrzałe RBC pacjentów z RTT niosących mutację R255X MeCP2 zachowują mitochondria

Następnie staraliśmy się ustalić, czy dodatkowe oznaki wadliwej autofagii można zaobserwować ex vivo u pacjentów z RTT. Ze względu na fakt, że usuwanie mitochondriów jest klasycznym mechanizmem opartym na autofagii występującym w krążących retikulocytach na końcowym etapie dojrzewania do RBC32,33,34 rozszerzyliśmy nasze badanie również na ludzkie RBC ex vivo, aby sprawdzić, czy mitochondria są zatrzymywane w tych komórkach.

I tak, RBC od pacjentów RTT (n = 15) i od zdrowych dawców (n = 11) analizowano za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Badanie TEM wykazało obecność struktur przypominających mitochondria (SRM) w RBC o dwuwklęsłym kształcie wyizolowanych od większości pacjentów z RTT (11 z 15). Wśród tych 11 pacjentów z RTT, trzech z nich wykazywało najbardziej nasiloną kohortę objawów, a także wysoką częstość występowania RBC (20 ± 4%) (ryc. 3a-h). Zgodnie z oczekiwaniami, SRM były niewykrywalne w zdrowych RBC (ryc. 3I). Różnice między osobami zdrowymi a osobami z RTT były istotne statystycznie (p < 0,0004; ryc. 3, dolny panel).

Niemniej jednak nasilenie objawów było oparte na ocenie klinicznej i odpowiednio, ci trzej pacjenci z najcięższymi objawami wszyscy nosili mutację R255X genu MeCP2, która wiąże się z ciężkim rokowaniem39.

W konsekwencji i biorąc pod uwagę fakt, że nie mieliśmy możliwości włączenia do badania większej liczby osób posiadających inne mutacje, które charakteryzują się niską lub zerową częstością występowania RBC zawierających mitochondria, skupiliśmy naszą uwagę na analizie tych trzech pacjentów. Analiza TEM udokumentowała, w tych trzech wyżej wymienionych przypadkach, obecność struktur przypominających nienaruszone lub częściowo strawione mitochondria (gęstych elektronowo lub świecących), które miały normalny lub hantlowaty (wydłużony) kształt i były na ogół małe z niewyraźnymi cristae (ryc. 3a-h). W rzeczywistości, wielkość i ogólny kształt tych struktur okazały się być zgodne z mitochondriami zatrzymanymi w dojrzałych RBC w nie-RTT modelach myszy z defektem makroautofagii (tj. myszy Ulk1-/-) lub mitofagii (tj. myszy Nix-/-) opisanych przez innych autorów32,33. Co ciekawe, obserwowane przez nas zmiany morfologiczne mitochondriów, takie jak zmniejszony wymiar, wydłużona (tj. w kształcie hantli) struktura i, w szczególności, obecność słabo widocznych cristae, zostały już opisane w mięśniach i w móżdżku pacjentów z RTT20,21. Aby potwierdzić mitochondrialną tożsamość SRM, wybarwiliśmy RBC od zdrowych dawców i tych pacjentów RTT z ciężkimi objawami za pomocą przeciwciała anty-COX-IV (oksydaza cytochromu c). Statystycznie istotna liczba RBC od trzech pacjentów z RTT w porównaniu z RBC osób zdrowych (odpowiednio 35 ± 5% vs 0,2 ± 0,01%, p < 0,005) wykazywała COX-IV+ wzór kropkowany, co sugerowało zatrzymanie mitochondriów (ryc. 4). Średnią zawartość mitochondriów w komórce obliczono na 1,2 ± 0,2 organelli na RBC u pacjentów z RTT i 0,002 ± 0,0002 u osób zdrowych (p < 0,005) (ryc. 4). Różnice w odsetku RBC wykazujących obecność mitochondriów pomiędzy badaniami TEM i IF można tłumaczyć faktem, że możliwość wykrycia organelli w TEM jest ściśle uzależniona od cienkiego przekroju komórki, co może utrudniać ich obecność, podczas gdy podejście IF nie jest w ten sposób ograniczone.

Aby dodatkowo potwierdzić te wyniki, przeprowadziliśmy analizę cytofluorymetryczną RBC zarówno zdrowych osób, jak i trzech pacjentów RTT, używając przeciwciał anty-CD71 (receptor transferyny) i anty-COX-IV. Częstość występowania pozytywnej reakcji na CD71, marker niedojrzałych RBC, nie różniła się istotnie u osób zdrowych i pacjentów z RTT (1,34 ± 0,13% vs 1,03 ± 0,3%; Supplementary Fig. S3). Należy podkreślić, że pacjenci z RTT objęci badaniem wykazywali prawidłowe parametry hematologiczne i chociaż indeks retikulocytarny był, przynajmniej u kilku osób, niższy niż stwierdzany u osób zdrowych, to ogólne różnice między obiema grupami pacjentów nie były istotne statystycznie (tab. 1). Odwrotnie, w zdrowych RBC obserwowano bardzo słabą populację COX-IV+, podczas gdy w RTT RBC wykryto większą częstość komórek COX-IV+ (0,056 ± 0,004% vs 1,15 ± 0,19%, odpowiednio, p < 0,01). Wyniki te zostały dodatkowo potwierdzone przy użyciu barwienia Mitotracker Green (MT) (Supplementary Fig. S3), które udokumentowało wzrost liczby MT+ RBCs u jednego pacjenta z RTT (noszącego mutację R255X MeCP2) vs jednego zdrowego pacjenta (0,37% vs 0,16%), podobnie jak to obserwowano przy użyciu przeciwciała COX-IV opisanego wcześniej.

W celu dalszej walidacji tożsamości SRM, równą liczbę RBC poddano lizie i analizie metodą WB w warunkach denaturujących i redukujących. Filtry barwiono przeciwciałami przeciwko sirtuinie-3, de-acetylazie specyficznie wyrażonej w macierzy mitochondrialnej40. Sirtuina3 została wybrana jako marker mitochondrialny w tym podejściu, ponieważ, w przeciwieństwie do COX-IV i innych markerów mitochondrialnych, jej masa cząsteczkowa nie pokrywa się z masą cząsteczkową łańcuchów hemoglobiny lub oligomerów hemoglobiny we wzorze elektroforetycznym. U trzech badanych pacjentów z RTT zaobserwowano statystycznie istotny wzrost stosunku sirtuiny-3 / GAPDH dla każdego pacjenta w odniesieniu do tego samego stosunku w lizatach ze zdrowych RBC (p < 0. 001) (Supplementary Fig. S4).

Tych trzech pacjentów, wszyscy noszący mutację MeCP2 (tj. R255X), wykazywali najgorszy fenotyp, z bardzo wysokim odsetkiem RBC wykazujących co najmniej 1 mitochondrię. Jednak bardzo ograniczona liczba pacjentów, jaką dysponowaliśmy, utrudniała wyciągnięcie jakichkolwiek istotnych statystycznie wniosków dotyczących możliwości istnienia związku między ciężkością choroby a stopniem retencji mitochondriów wewnątrz dojrzałych RBC. Inną kwestią, która wydaje się być warta wspomnienia, jest to, że retencja mitochondriów wewnątrz dojrzałych RBC w cytowanych wcześniej modelach myszy Ulk1-/- i Nix-/- prowadziła do niedokrwistości lub innych patologii krwi prawdopodobnie uwarunkowanych zwiększonym klirensem tych nieprawidłowych erytrocytów przez makrofagi śledziony32,33. U pacjentów z RTT włączonych do tego badania zarejestrowano tylko bardzo ograniczony i nieistotny statystycznie spadek wartości hematologicznych, a oni wydawali się nie być anemiczni lub cierpieć z powodu innych patologii krwi. Rozbieżność pomiędzy naszymi wynikami a wynikami uzyskanymi na modelach mysich może wynikać z faktu, że knock-down genów makroautofagii lub mitofagii (tj. odpowiednio u myszy Ulk1-/- i Nix-/-) indukuje bardzo wysoki odsetek RBC zawierających mitochondria i zatrzymanie kilku organelli wewnątrz RBC, co jest znacznie poważniejszym defektem w porównaniu z tym udokumentowanym u pacjentów z RTT32,33. Chociaż zaobserwowaliśmy znacząco wysoką liczbę RBC zawierających mitochondria u pacjentów będących nosicielami mutacji R255X (ryc. 4), liczba organelli w każdej komórce była bardzo niska w RTT RBC (ryc. 4). Może to być niewystarczające do wywołania istotnych zmian morfologicznych i funkcjonalnych w RBC. Warto zaznaczyć, że chociaż retencja mitochondriów wewnątrz RBC może być przynajmniej jednym z czynników determinujących poważną nierównowagę redoks obserwowaną w RTT RBC w połączeniu z istotną zmianą stanu energetycznego i metabolizmu (tj, ATP/ADP i stosunek NADH/NAD), ostatnie badania donoszą, że kinetyka wiązania tlenu do hemoglobiny i dyfuzji tlenu prawie pokrywa się z kinetyką zdrowych pacjentów16,17,23,41.

Pozorna rozbieżność między naszymi wynikami a wynikami uzyskanymi z modeli mysich może również znaleźć wyjaśnienie w fakcie, że zespół RTT jest zaburzeniem sprzężonym z chromosomem X, które dotyka prawie wyłącznie płeć żeńską, a inaktywacja jednej z dwóch kopii chromosomu X (XCI) jest zjawiskiem losowym występującym podczas embriogenezy, co zostało szeroko udokumentowane42,43. Tak więc w przypadku zespołu RTT należałoby się spodziewać, że losowy XCI spowoduje w komórkach somatycznych mozaicyzm, w którym połowa komórek będzie wyrażała allel typu dzikiego, a pozostała połowa zmutowany allel genu MeCP2. Co ciekawe, możliwość, że przynajmniej niektóre mutacje MeCP2 mogą być związane z nielosowym XCI w tkance neuronalnej jest zgodna ze zmiennością fenotypową pacjentów z RTT (a także znanych przypadków RTT), cechą, która została obszernie udokumentowana42,43. Teoretycznie, jeśli połowa progenitorów hematologicznych w szpiku kostnym zachowuje chromosom X zawierający mutację MeCP2, tylko połowa krążących dojrzałych RBC będzie nosić patologiczny allel, ograniczając w ten sposób liczbę krążących RBC zawierających mitochondria. Niemniej jednak, zwiększoną częstość występowania nielosowego XCI na korzyść allelu typu dzikiego zaobserwowano w krążących leukocytach u sporadycznych pacjentów z RTT42,43. W odniesieniu do tego punktu bardzo trudne byłoby ustalenie, czy pacjenci, którzy wykazują lub nie niską liczbę RBC zawierających mitochondria, wykazują również mniej znaczące upośledzenie mitofagii lub nielosowe XCI, co prowadziłoby do pozytywnej selekcji progenitorów hematologicznych noszących allel typu dzikiego MeCP2.

Stąd, biorąc pod uwagę złożoność patologii RTT, wolimy twierdzić, że pacjenci RTT, wraz z pacjentami dotkniętymi zespołem Pearsona, mogą reprezentować pierwsze przypadki retencji mitochondriów w ludzkich dojrzałych RBC44.

Dowody wadliwej autofagii w móżdżku myszy pozbawionych Mecp2

Zważywszy, że RTT jest zaburzeniem neurorozwojowym, w celu dalszego poparcia naszych wyników, które wskazują na ogólnoustrojową wadliwą autofagię, przeprowadziliśmy analizy immunohistochemiczne dla p62 i ubikwityny w móżdżku (tj. narządzie, w którym mitochondria są przechowywane w komórkach).21,45 u 9-tygodniowych myszy typu dzikiego oraz 5-tygodniowych (bezobjawowych) i 9-tygodniowych (objawowych) myszy Mecp2 -/y. W każdym stanie doświadczalnym przeprowadzono analizę immunohistochemiczną p62 i ubikwityny w móżdżku (tj. narządzie, w którym obserwowano zmiany w mitochondriach i inne poważne nieprawidłowości histologiczne). Dla każdego warunku eksperymentalnego analizowano organy wyizolowane od trzech zwierząt. W porównaniu z wt, móżdżek RTT wykazywał wzrost intensywności barwienia p62 (ryc. 5a) i Ub (ryc. 5b) we wszystkich warstwach (tj. w ziarnistościach, warstwie Purkinjego i korowej), który był liniowy wraz z wiekiem zwierząt. Ponadto, nadbarwione struktury przypominały agregaty wewnątrzkomórkowe. Według półilościowej oceny intensywności barwienia p62/SQSTM1 i Ub, różnice pomiędzy móżdżkiem zwierząt 5-tygodniowych vs zdrowych oraz zwierząt 9-tygodniowych vs 5-tygodniowych były istotne statystycznie (p < 0.05).

Różnica histologiczna między zwierzętami bezobjawowymi i objawowymi sugeruje, że zmiana autofagii może być nieobecna lub słaba przy urodzeniu, podczas gdy stopniowo nasila się w pierwszych tygodniach życia (i być może wtedy, gdy aktywność MeCP2 osiąga szczyt), dając początek objawom.

.