Medycyna laboratoryjna poczyniła znaczne postępy w ciągu ostatnich dwóch dekad. Testy wiremii ewoluowały od zagnieżdżonych testów PCR do amplifikacji wspomaganej transkrypcją do real-time PCR i nadal ewoluują dzięki metodom takim jak cyfrowa PCR. Ten postęp zaowocował bardziej czułymi testami wiremii o szerszym zakresie dynamicznym, co pozwala lekarzom lepiej zrozumieć odpowiedź pacjenta na terapię i postęp choroby.
Jednym z przykładów poprawy zarządzania pacjentem dzięki postępom diagnostyki molekularnej jest zarządzanie pacjentami zakażonymi HIV-1. Zgodnie z aktualnymi wytycznymi dotyczącymi leczenia, sukces leczenia jest definiowany jako stężenie HIV-1 RNA poniżej 75 kopii/ml.1 Definicja niepowodzenia leczenia różni się w zależności od wytycznych globalnych, krajowych i specyficznych dla danego kraju, ale zwykle jest definiowana jako stężenie HIV-1 RNA pomiędzy 50-1000 kopii/ml.1-3
Te wartości graniczne leczenia znajdują się na dolnym końcu zakresu dynamicznego testów PCR w czasie rzeczywistym, gdzie precyzja i odtwarzalność mogą być kwestionowane. Czynniki, które mogą wpływać na wydajność testów wirusologicznych to: platforma automatyczna, chemia ekstrakcji kwasów nukleinowych, wybór i projektowanie primerów/sond PCR, warunki amplifikacji PCR i strategia kalibracji testów. W tym miejscu dokonamy przeglądu różnych podejść projektowych i ich potencjalnego wpływu na wydajność testów i wyniki kliniczne. (Rysunek 1)
Proces ekstrakcji
Przy wyborze chemii ekstrakcyjnej należy dokładnie rozważyć typ próbki i analitu. Na przykład, w przypadku HIV-1, Department of Health and Human Services (DHHS) zaleca, aby HIV-1 RNA był używany jako marker wiremii HIV-1.1
Różnica pomiędzy HIV-1 RNA i prowirusowym DNA jest ważna, ponieważ ten ostatni nie jest markerem aktywnej replikacji wirusowej, ale raczej utajonego uwalniania rezerwuaru z wirusa, który został już zintegrowany z komórkami. Chemia ekstrakcyjna, która oczyszcza zarówno HIV-1 RNA jak i prowirusowe DNA nie zapewniłaby lekarzowi dokładnego przedstawienia prawdziwej replikacji wirusowej; dlatego, w przypadku tego wirusa, tylko chemia ekstrakcyjna, która specyficznie oczyszcza HIV-1 RNA powinna być używana w celu wykluczenia prowirusowego DNA z dalszego oznaczania ilościowego.
Alternatywnie, stosowanie chemii ekstrakcyjnej całkowitego kwasu nukleinowego (TNA) do ilościowego oznaczania HIV-1 mogłoby potencjalnie prowadzić do wyników fałszywie dodatnich lub niedokładnego oznaczania ilościowego, co miałoby niekorzystny wpływ na postępowanie z pacjentem. Chemia ekstrakcyjna TNA może być wykorzystywana do trudniejszych typów próbek, takich jak mocz lub stolec, lub do testów, które muszą wykrywać oba cele RNA/DNA.
Wybór celu
Wyjątkowa różnorodność wirusów występujących wśród szczepów HIV, HBV i HCV jest niezwykle istotna dla zapewnienia, że testy diagnostyki molekularnej (MDx) dają prawidłowy wynik niezależnie od szczepu(ów) obecnego(ych) w próbce.
Aby rozwiązać ten problem, optymalny projekt testu powinien rozpocząć się od wyboru primera/sondy docelowej w genetycznie konserwatywnym regionie, gdzie różnorodność wirusów będzie miała najmniejszy potencjalny wpływ. Genetycznie konserwatywne regiony mogą być określone tylko przez porównanie sekwencji z różnych szczepów wirusowych.
Projekt sondy i warunki cykliczności PCR
Oprócz wyboru regionu docelowego, projekt sondy i warunki cykliczności PCR są krytyczne, gdy szukamy sposobu na zapewnienie dokładnej ilościowej oceny wiremii. Projekt sondy musi być tolerancyjny dla naturalnie występujących polimorfizmów, a co za tym idzie, potencjalnych niedopasowań, które mogą wystąpić w danym regionie docelowym. Z czasem technologia sond ewoluowała, podobnie jak metodologia PCR. Szerszy zakres zastosowań MDx oparty na technologii PCR, wykraczający poza kwantyfikację wirusów, wymaga zastosowania różnych konstrukcji sond. Sondy wiążące drobne rowki są zwykle używane do genotypowania i wykrywania polimorfizmu pojedynczych nukleotydów.
Sondy TaqMan są często używane w testach, gdzie regiony docelowe mają wysoki stopień konserwacji. Częściowo dwuniciowe sondy, które lepiej tolerują wysoki poziom heterogeniczności genetycznej, głównie ze względu na długość sondy i warunki wiązania, są wykorzystywane w obszarach, gdzie występuje wysoki stopień heterogeniczności.5
Oprócz konstrukcji sondy, warunki cykli są często przedmiotem optymalizacji projektu, w celu osiągnięcia wymogu wydajności (np. tolerancji potencjalnych niedopasowań). Dopasowane fazowo cykle są jednym z podejść, które obejmuje cykle w niższej temperaturze w celu zmniejszenia początkowej surowości, po których następują cykle w wysokiej temperaturze w celu zachowania specyficzności. Podejście to łagodzi niekorzystny wpływ potencjalnych niedopasowań primerów na kwantyfikację próbki. W przypadku gdy trudno jest uniknąć znaczącego wpływu rzadkich polimorfizmów, wykrywanie drugiego celu może zostać włączone do projektu analizy. Gdy różnorodność sekwencji wpływa na wykrywanie jednego regionu genomu wirusowego, wykrywanie drugiego regionu zapewnia uzyskanie dokładnego wyniku. Biorąc pod uwagę złożoność testów molekularnych i wysoki poziom różnorodności wirusów, przy projektowaniu testów molekularnych należy rozważyć kompleksowe podejście wykorzystujące globalny nadzór i projektowanie sond specyficznych dla danego celu. Samo zaadaptowanie jednej strategii, takiej jak dual-target, może dać fałszywe poczucie bezpieczeństwa.
Strategia kalibracji
Strategia kalibracji jest integralnym składnikiem projektowania testów molekularnych i jest krytyczna dla zapewnienia odtwarzalności w szerokim zakresie dynamicznym. Większość ilościowych metodologii zarządzania terapią wykorzystuje obecnie zewnętrzną krzywą kalibracyjną do określenia stężenia analitu.
W tych testach, sygnał analitu w próbce pacjenta jest porównywany z zestawem próbek o znanym stężeniu i prosta regresja liniowa (y=mx+b) jest używana do obliczenia wiremii. To podejście zazwyczaj wykorzystuje kalibratory, które są przetwarzane jako próbki pacjenta przez cały proces, pozwalając na kalibrację zarówno odczynników do ekstrakcji i amplifikacji, jak i instrumentów.
Alternatywnie, kalibratory, które nie są przetwarzane przez ekstrakcję mogą być użyte, jednakże to podejście niesie ryzyko, że różnica w odzysku lub zmiana w składzie odczynnika nie będzie uwzględniona, potencjalnie prowadząc do różnic w kwantyfikacji.
Inną, rzadziej stosowaną strategią jest wewnętrzny wzorzec ilościowy. To zastosowanie wykorzystuje wielomianową linię regresji 3 rzędu (y = ax3 + bx2 + cx + d) w całym zakresie liniowym z dopuszczalną maksymalną różnicą od liniowości. Poprzednie badania sugerowały, że dopuszczalna różnica od liniowości dla niektórych testów wynosiła ± 0,2 Log10.6 Ta dopuszczalna różnica od liniowości i podejście kalibracyjne również wyjaśniają stronniczość często obserwowaną pomiędzy metodologiami, jak również większą niedokładność przy niskim końcu zakresu dynamicznego, gdzie często podejmowane są decyzje kliniczne.
Wniosek
Dokładne i precyzyjne wyniki testów molekularnych są krytyczne dla odpowiedniego zarządzania terapią. Niedokładne wyniki wiremii mogą prowadzić do nieodpowiedniego postępowania, a pacjent może być pozostawiony na terapii, która zawodzi. Taka błędna diagnoza ma znacznie szersze implikacje niż tylko zarządzanie pojedynczym pacjentem, ponieważ może również prowadzić do zwiększenia transmisji opornego szczepu wirusa. Z perspektywy zarządzania terapią, wirus z mutacjami związanymi z opornością jest trudniejszy do leczenia przy użyciu węższych opcji terapeutycznych. Ponadto, wyniki fałszywie dodatnie mogą zwiększać niepotrzebne koszty powtórnych badań lub droższych badań oporności, jak również niepokój pacjenta i lekarza.
- Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in Adults and Adolescents with HIV opracowane przez Department of Health and Human Services. https://aidsinfo.nih.gov/guidelines). Dostęp wrzesień 2019.
- European AIDS Clinical Society (EACS). EACS Guidelines Version 9.1 October 2018.
- National Department of Health, South Africa, kwiecień 2015, dostęp 2 sierpnia 2017: https://aidsfree.usaid.gov/sites/default/files/tx_south-africa_pmtct_2015.pdf.
- Brennan CA, Bodelle P, Coffey R, et al. HIV global surveillance: foundation for retroviral discovery and assay development. Journal of medical virology. 2006;78 Suppl 1:S24-29.
- Luk KC, Devare SG, Hackett JR, Jr. Partially double-stranded linear DNA probes: novel design for sensitive detection of genetically polymorphic targets. Journal of Virological Methods. 2007;144(1-2):1-11.
- Vermehren J, Colucci G, Gohl P, et al. Development of a second version of the Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan hepatitis C virus quantitative test with improved genotype inclusivity. Journal of Clinical Microbiology. 2011;49(9):3309-3315.
Podziękowania: Autor chciałby wyrazić uznanie i podziękować Mary Rodgers i Shihai Huang za recenzję tego artykułu.