Alai

Atpaza wakuolarna (V-ATPase) jest wielopodjednostkową pompą protonową napędzaną ATP, która zakwasza pęcherzyki wewnątrzkomórkowe i środowisko zewnątrzkomórkowe, a tym samym jest zaangażowana w wiele funkcji biologicznych. Poprzednie przeglądy elegancko opisały strukturę i funkcję V-ATPazy. Tutaj dokonujemy przeglądu najnowszej literatury odnoszącej się do funkcji V-ATPazy i jej udziału w różnych procesach komórkowych w normalnej fizjologii z naciskiem na nowotwory. Przedstawiamy również szczegółowo regulację Notch i innych szlaków sygnałowych przez V-ATPazę, ujawniając dotychczas mniej znaną funkcję V-ATPazy w sygnalizacji komórkowej.

Izoformy podjednostek

Strukturalnie, V-ATPaza jest obrotowym nanomotorem składającym się z wielu podjednostek, z których każda ma wiele izoform. Podjednostki ułożone są w dwie domeny: peryferyjną domenę V1, odpowiedzialną za hydrolizę ATP oraz integralną domenę błonową VO, która funkcjonuje w translokacji protonów. Struktura V-ATPazy jest bardzo dobrze zachowana we wszystkich komórkach eukariotycznych i jest zaangażowana w różne funkcje u różnych gatunków. U ssaków domena V1 ma osiem różnych podjednostek (A, B, C, D, E, F, G i H), podczas gdy domena VO składa się z sześciu różnych podjednostek (a, c, c’, c”, d, e). Zróżnicowane wymagania dotyczące zakwaszenia w pęcherzykach wewnątrzkomórkowych i środowisku zewnątrzkomórkowym napędzają funkcję i regulację V-ATPazy. Aby zmniejszyć lub zwiększyć wydajność pompy, V-ATPaza kontroluje sprzężenie pomiędzy hydrolizą ATP i pompowaniem protonów. Proces ten jest wywoływany przez podjednostkę 'a’ V-ATPazy. Podobnie, specyficzne dla komórki i przedziału ukierunkowanie V-ATPazy jest również zależne od izoform podjednostki 'a’. VOa jest integralnym białkiem błonowym o masie 100 kDa z N-końcowym ogonem cytozolowym i 9 domenami transmembranowymi. Zidentyfikowano cztery izoformy podjednostki „a” (a1, a2, a3 i a4), które różnią się rozmieszczeniem w pęcherzykach i typach komórek. VOa1 ulega ekspresji na pęcherzykach synaptycznych, a VOa2 na pęcherzykach wewnątrzkomórkowych, takich jak golgi i wczesne endosomy. VOa3 ulega ekspresji na błonie plazmatycznej osteoklastów, podczas gdy VOa4 ulega ekspresji na błonie plazmatycznej komórek śródmiąższowych nerek. Ponadto, N-końcówka podjednostki 'a’ jest ważnym motywem, który wiąże domenę V1 z błoną, a także została uznana za unikalny czujnik pH w lizosomach. Ekspresja i lokalizacja izoformy podjednostki 'a’ jest krytyczna dla funkcjonowania V-ATPazy.

Fizjologiczna funkcja V-ATPazy

V-ATPazy ulegają wszechobecnej ekspresji i pełnią różnorodne funkcje biologiczne w komórkach większości tkanek poprzez zakwaszanie pęcherzykowe, luminalne i zewnątrzkomórkowe. Aby osiągnąć liczne funkcje komórkowe, V-ATPaza ułatwia zlokalizowane stężenie protonów w kwaśnych pęcherzykach szlaków endocytarnych i egzocytarnych.

Kwaszenie pęcherzykowe

Endosomy i lizosomy

V-ATPaza jest najlepiej znana ze swojej roli w zakwaszaniu pęcherzyków wewnątrzkomórkowych, takich jak endosomy i lizosomy. Na powierzchni endosomów, V-ATPaza zakwasza i w ten sposób moduluje ważne procesy komórkowe, takie jak endocytoza receptorów i handel pęcherzykowy. Zakwaszenie endosomów przez V-ATPazę jest kluczowe dla endocytarnej internalizacji kompleksów ligandów receptorowych. Po zainicjowaniu sygnalizacji, niższe pH w endosomach uwalnia ligand i kieruje go z powrotem do błony plazmatycznej. W lizosomach V-ATPazy pomagają w utrzymaniu niskiego pH 4,5 i są ważne dla transportu nowo syntetyzowanych kwaśnych hydrolaz z Golgiego do lizosomów. Ponadto, fagosomy i autofagosomy w makrofagach i komórkach nowotworowych odpowiednio, również zależą od kwaśnego pH utrzymywanego przez V-ATPazy dla aktywności enzymów degradujących w tych przedziałach .

Golgi

Sortowanie egzocytarnych i endocytarnych maszyn zaczyna się w kompleksie Golgiego. Co ważne, większość białek ulega glikozylacji, kluczowej modyfikacji potranslacyjnej w obrębie aparatu Golgiego. Mutacje w podjednostce a2 V-ATPazy powodują cutis laxa, autosomalny recesywny zespół wijącej się skóry, w którym obserwuje się upośledzoną glikozylację białek macierzy pozakomórkowej. Chociaż V-ATPaza została genetycznie skorelowana z defektem glikozylacji, dokładny związek pomiędzy zakwaszeniem golgiego a dojrzewaniem białek nie został zbadany.

Wyspecjalizowane pęcherzyki

V-ATPaza jest głównym białkiem ulegającym ekspresji w wyspecjalizowanych przedziałach określonych typów komórek. Podczas neurotransmisji, V-ATPaza zapewnia kluczową siłę napędową protonów niezbędną do tworzenia pęcherzyków synaptycznych i późniejszego gromadzenia neurotransmiterów. W komórkach trzustki zakwaszenie zależne od V-ATPazy jest ważne dla egzocytozy insuliny. V-ATPaza reguluje również równowagę rozszczepienie-fuzja systemu pęcherzykowego poprzez interakcję z rozpuszczalnym receptorem białka przyłączeniowego NSF (SNARE) i GTPazą.

Kwaszenie hydrauliczne

V-ATPazy zostały początkowo zidentyfikowane na pęcherzykach wewnątrzkomórkowych, ale znaczenie V-ATPaz w błonie plazmatycznej bardzo wzrosło. W komórkach nabłonka kanalika proksymalnego nerki izoforma a4 V-ATPazy utrzymuje równowagę kwasowo-zasadową i zakwaszenie moczu (kwasica ogólnoustrojowa). Podobnie, w komórkach przejrzystych najądrza, V-ATPaza błony plazmatycznej zakwasza przedział luminalny i pomaga w dojrzewaniu i przechowywaniu plemników. W osteoklastach kości, lizosomalna V-ATPaza przenosi się do błony plazmatycznej podczas resorpcji kości w celu zakwaszenia luk. Plazmalemalna V-ATPaza jest kluczowa dla funkcjonowania komórek międzyzębowych ucha, komórek nabłonkowych nosa i wzroku. Dysfunkcja V-ATPazy jest związana z takimi stanami patologicznymi jak kwasica kanalików nerkowych, głuchota, upośledzenie zmysłu węchu i osteoporoza Schemat przedstawiający rolę V-ATPazy w zakwaszaniu pęcherzykowym i luminalnym przedstawiono na ryc. 1.

Rola w nowotworach

Ostatnio, błona plazmatyczna V-ATPazy była szeroko badana w nowotworach, gdzie pomagają one utrzymać zasadowe środowisko wewnątrzkomórkowe sprzyjające wzrostowi i kwaśne środowisko zewnątrzkomórkowe sprzyjające inwazji. W nowotworach wykazano, że ekspresja V-ATPazy jest wyższa w kierunku krawędzi wiodącej proliferujących komórek nowotworowych raka piersi, prostaty, płuc, jajnika, wątroby, trzustki, czerniaka i raka przełyku. W szczególności, komórki raka piersi wyrażają V-ATPazę na błonie plazmatycznej w celu zakwaszenia przestrzeni zewnątrzkomórkowej, a ilościowa ekspresja V-ATPazy koreluje z inwazyjnością i potencjałem przerzutowym linii komórkowej. Dokładny wkład V-ATPazy do rosnącego guza jest osiągany poprzez jej wpływ na molekularne mechanizmy/ścieżki omówione poniżej.

Immunomodulacja

Izoforma a2 wakuolarnej ATPazy (VOa2 lub a2V) ma rolę immunomodulacyjną w ciąży i nowotworach. Badania z udziałem a2V w biologii reprodukcyjnej odkryły nieznaną dotąd rolę tej cząsteczki w normalnym dojrzewaniu i produkcji plemników, a także w implantacji zarodka. W mikrośrodowisku nowotworowym, N-końcowa domena a2V polaryzuje makrofagi do makrofagów związanych z guzem (typ M2) i stymuluje różne podzbiory monocytów poprzez szlak endocytozy. W następstwie tych ustaleń wykazano, że niedobór a2V w komórkach nowotworowych zmienia populację makrofagów rezydujących w mikrośrodowisku guza i wpływa na wzrost guza in vivo. a2V ulega ekspresji na pierwotnych ziarnistościach neutrofilów i pomaga utrzymać pH w ścieżce egzocytarnej podczas aktywacji neutrofilów. Traktowanie ludzkich neutrofili rekombinowanym N-końcowym peptydem a2V (a2NTD) promowało migrację i polaryzację neutrofili. Łącznie, badania te podkreślają immunomodulacyjną rolę V-ATPazy w wywoływaniu silnych odpowiedzi immunologicznych.

Efekt Warburga

Znakiem rozpoznawczym raka jest efekt Warburga, w którym komórki przechodzą z fosforylacji oksydacyjnej na glikolizę tlenową. Kilka badań wskazuje na hipotezę, że komórki nowotworowe zależą od V-ATPazy bardziej niż od jakichkolwiek innych regulatorów pH, takich jak wymienniki Na+H+, transportery wodorowęglanowe i symporterzy protonowo-mleczanowi, aby osiągnąć korzystne zasadowe pH wewnątrzkomórkowe i kwaśne pH zewnątrzkomórkowe. Alkalizacja cytozolu aktywuje glikolizę, jednocześnie hamując fosforylację oksydacyjną. Ponadto niektóre onkogeny związane z glikolizą, takie jak czynnik indukowany hipoksją (HIF-1), są regulowane przez zmianę pH indukowaną przez V-ATPazę.

Kwaśne proteazy

Konsekwencją pozakomórkowego zakwaszenia w guzach jest aktywacja kwaśnych proteinaz, które są enzymami rozszczepiającymi macierz pozakomórkową podczas inwazji guza. Enzymy te należą do klasy kwaśnych proteinaz, takich jak katepsyny, metalo proteinazy macierzy (MMP) oraz żelatynazy i są aktywne w kwaśnym pH. Ponadto, aktywność enzymów wewnątrzkomórkowych, takich jak γ-sekretaza, które są aktywne w kwaśnym pH, jest również wzmocniona przez zwiększoną aktywność V-ATPazy w pęcherzykach. W konsekwencji prowadzi to do dysregulacji szlaków onkogennych, takich jak Notch.

Oporność na leki i inhibitory V-ATPazy

Zmienione pH mikrośrodowiska guza może wpływać na wrażliwość na chemioterapeutyki. Antracykliny i alkaloidy mają pKa od 7 do 8 i są internalizowane do przedziału endosomalnego. Ostatnie dane sugerują, że stosowanie inhibitorów V-ATPazy nie tylko powoduje zmiany cytozolowego pH prowadzące do śmierci komórki, ale także zwiększa wchłanianie leków, co czyni je skutecznym składnikiem kombinatorycznego leczenia nowotworów. W raku jajnika, a2V ulega ekspresji na krawędzi wiodącej komórek nowotworowych i moduluje aktywność MMP9. Ponadto, a2V przyczynia się do oporności na cisplatynę w raku jajnika, a selektywne hamowanie a2V może służyć jako skuteczna strategia leczenia chemioopornego raka jajnika. Inhibitory V-ATPazy, bafilomycyna i konkanamycyna, należą do klasy pleomakrolidów, które celują w sektor VO i skutecznie hamują aktywność V-ATPazy. Ostatnio doniesiono, że Apicularen i archazolidy są silnymi i specyficznymi inhibitorami V-ATPazy. Jednak wszystkie dostępne małocząsteczkowe inhibitory wykazują znaczną toksyczność, biorąc pod uwagę udział V-ATPazy w prawidłowej fizjologii komórek. Dlatego rozwój specyficznych przeciwciał neutralizujących przeciwko izoformie podjednostki „a”, która ma specyficzną dla komórek ekspresję, mógłby być skuteczną alternatywą dla bezpośredniego hamowania V-ATPazy, a także pośredniego rozwiązania problemu oporności na wiele leków dzięki zastosowaniu kombinatorycznemu.

Autofagia

Autofagia jest procesem selektywnej degradacji lub recyklingu ładunków dostarczanych przez autofagosomy do lizosomów. Komórki nowotworowe wykazują zróżnicowaną zależność od autofagii w miarę postępu od guza pierwotnego do wysoce przerzutowego guza litego. Ładunki komórkowe oznaczone do degradacji są dostarczane do lizosomów przez procesy autofagiczne. Aktywność pompy protonowej V-ATPazy jest odpowiedzialna za aktywację lizosomalnych kwaśnych hydrolaz, które degradują ładunek pobierany z autofagosomów. Chociaż badania wskazują na wymóg funkcjonalnej V-ATPazy dla autofagii, a inhibitor V-ATPazy – Bafilomycyna jest stosowany jako klasyczny inhibitor autofagii, dokładna rola V-ATPazy w błonowej dynamice strumienia autofagii nie jest zrozumiała. Ostatnie badania wykazały, że leczenie Bafilomycyną, która hamuje aktywność zarówno V-ATPazy, jak i pompy Ca2+ SERCA, doprowadziło do zablokowania przepływu autofagicznego, podczas gdy lizosomy z niedoborem V-ATPazy były nadal zdolne do łączenia się z autofagosomami. Wyniki te sugerują udział V-ATPazy w degradacji ładunku autofagicznego w lizosomach niż w strumieniu autofagicznym i podkreślają potrzebę opracowania specyficznych inhibitorów i technik manipulacji genami w celu zbadania dokładnej roli V-ATPazy w różnych ważnych procesach komórkowych.

Sygnalizacja

Ścieżka endolizosomalna jest ważna zarówno dla pozytywnej, jak i negatywnej regulacji szlaków sygnałowych. Pierwsze znane doniesienie o zaangażowaniu V-ATPazy w sygnalizację pochodzi z badania pokazującego, że zahamowanie V-ATPazy przez Bafilomycynę wpłynęło na internalizację EGFR. Od tego czasu V-ATPaza została powiązana z transdukcją sygnału związaną z regulacją m-TOR (mammalian Target Of Rapamycin), Wnt, TGF-β i sygnalizacji Notch.

Sygnalizacja Notch

Prawdopodobnie najlepiej zbadaną ścieżką sygnalizacji regulowaną przez V-ATPazę jest Notch. Można to przypisać faktowi, że sygnalizacja Notch zależy od ścieżki endolizosomalnej dla jej aktywacji, utrzymania i degradacji kluczowych mediatorów ścieżki. V-ATPaza utrzymuje komórkową równowagę pH i odgrywa ważną rolę w endocytozie, aktywacji proteaz i degradacji białek. Konkretnie, a2V (podjednostka V-ATPazy – VOa2) została wcześniej zlokalizowana we wczesnych endosomach – miejscu endocytozy receptorów. Po związaniu ligandu, receptor Notch przechodzi drogę endocytarną i jest rozszczepiany przez proteazy w celu aktywacji. Później receptory są degradowane w lizosomach. W Drososphila mutacje w Vps25, składniku maszynerii ESCRT, która reguluje endosomalne sortowanie receptorów sygnalizacyjnych, powodują akumulację receptora Notch w endosomach i nasilają sygnalizację Notch. W badaniu analizującym mutacje Hrs w drosophila, innego składnika ESCRT, Notch gromadzi się w endosomach, ale nie powoduje ektopowej aktywacji sygnalizacji Notcha. Utrata autofagii prowadzi do aktywacji sygnalizacji Notch w komórkach pęcherzykowych jajnika Drosophila w wyniku zaburzenia degradacji Notch. W przeciwieństwie do tych doniesień, niezależne badanie wykazało, że mutacje w Rabconnection-3 zaburzają aktywność pompy protonowej V-ATPazy i gromadzą Notch w późnych endosomach po rozszczepieniu S2, zmniejszając w ten sposób sygnalizację Notch w komórkach Drosophila i ssaków. Po tych odkryciach pojawiły się kolejne doniesienia w Drosophila wskazujące, że poprzez zakwaszenie szlaku endolizosomalnego, V-ATPaza jest wymagana do aktywacji Notch w endosomach, jak również do degradacji Notch w lizosomach. Podczas rozwoju ssaków, ekspresja dominującej ujemnej podjednostki V-ATPazy w prekursorach neuronalnych zmniejszyła sygnalizację Notch i pozbawiła neuronalne komórki macierzyste prowadząc do różnicowania neuronów. Ostatnio, w badaniach astrocytów w siatkówce zmutowanych szczurów Nuc1 wykazano dysregulację sygnalizacji Notch. Zmniejszenie sygnalizacji Notch było spowodowane zmutowaną βA3/A1-krystaliną, która reguluje aktywność V-ATPazy, co prowadzi do upośledzenia zakwaszania endosomalnego i aktywności γ-sekretazy, wpływając tym samym na szybkość przetwarzania receptora Notch. Jest to interesujące odkrycie, biorąc pod uwagę fakt, że rola V-ATPazy w widzeniu jest obecnie wyłaniająca się. Łącznie wyniki te wskazują, że regulacja sygnalizacji Notch przez V-ATPazę może mieć zarówno pozytywne, jak i negatywne skutki w zależności od komórkowej lokalizacji aktywności V-ATPazy (endosomy vs lizosomy) i zależności przetwarzania receptora Notch od ścieżki endosomalnej. Chociaż wzajemne oddziaływanie V-ATPazy i Notcha było badane w kontekście zależnego od V-ATPazy zakwaszenia endolizosomalnego wpływającego na sygnalizację Notcha, ostatnie doniesienie sugeruje, że regulacja może być również odwrotna. Autorzy sugerują, że Presinilin1 (PS1), składnik kompleksu enzymatycznego γ-sekretazy odpowiedzialnego za rozszczepianie receptora Notch i peptydu β-amyloidowego, fizycznie oddziałuje z izoformą VOa1 V-ATPazy i kieruje ją z retikulum endoplazmatycznego do lizosomów. Nasze badania wykazały, że V-ATPaza reguluje sygnalizację Notch w raku piersi i rozwoju gruczołu sutkowego. a2V ulega ekspresji na powierzchni proliferujących komórek nabłonka sutka i komórek potrójnie ujemnego raka piersi (TNBC), co wskazuje na jej rolę w proliferacji komórek podczas normalnego rozwoju i choroby. W TNBC, inhibicja a2V zwiększa sygnalizację Notcha poprzez blokowanie lizosomalnej i autofagicznej degradacji receptora Notcha. Utrata a2V w mysim gruczole mlekowym prowadzi do nieprawidłowej aktywacji Notch i upośledza morfogenezę przewodów, powodując wady laktacji. Sygnalizacja Notch jest aktywowana podczas porodu przedwczesnego indukowanego infekcją PGN + poli (I:C), co prowadzi do nasilenia odpowiedzi prozapalnych, a jej zahamowanie poprawia przeżywalność in-utero żywych płodów. Ponadto w przedwczesnym porodzie indukowanym przez odpowiedź zapalną na iniekcję LPS obserwowano wzrost regulacji czynników zapalnych związanych z Notch i spadek regulacji czynników angiogenezy. W obu modelach porodu przedwczesnego, zarówno w przypadku infekcji, jak i zapalenia, byliśmy w stanie uratować fenotyp poprzez leczenie inhibitorami γ-sekretazy (GSI). To toruje drogę dla ważnego przyszłego kierunku, zwłaszcza, że GSI jest skutecznym inhibitorem sygnalizacji Notch i jest obecnie w fazie badań klinicznych dla kilku nowotworów. Z tym, V-ATPase i Notch crosstalk wyłania się być ważne podczas normalnego rozwoju i chorób takich jak Alzheimers i różnych nowotworów .

Sygnalizacja Wnt

Scieżka sygnalizacji Wnt odgrywa główną rolę w utrzymaniu komórek i tkanek, polarności i różnicowania. U ludzi, dysregulacja sygnalizacji Wnt został implikowany w raka . Klasycznym przykładem dysregulacji sygnalizacji Wnt jest rak jelita grubego, gdzie utrata Adenomatous Polyposis Coli (APC), negatywnego regulatora sygnalizacji Wnt wyzwala tumorigenezę. Podczas sygnalizacji, ligandy Wnt działają na komórki docelowe poprzez wiązanie się z Frizzed, Fz i LRP (low density-lipoprotein,) kompleksem receptorów na powierzchni komórek, co prowadzi do rozpadu kinazy syntazy glikogenu (GSK-3), a następnie uwolnienia β-kateniny. β-katenina jest głównym mediatorem downstream szlaku Wnt, który aktywował docelowe onkogeny Wnt, takie jak c myc i cyklinaD1. Receptor (P) RR, Pro Renin Receptor zwany również ATP6ap2 działa jako cząsteczka adaptorowa pomiędzy V-ATPazą a kompleksem receptorowym Wnt LRP 5/6. U Xenopus i Drosophila wykazano, że V-ATPaza oddziałuje z kompleksem receptorowym LRP 5/6 i zarówno genetyczny knockdown, jak i farmakologiczne hamowanie V-ATPazy zakłócają transdukcję sygnału i znacznie zmniejszają odpowiedź komórkową na sygnalizację Wnt. Ponadto V-ATPaza pośrednio reguluje mediator sygnalizacji Wnt β-kateninę i mediator Notcha NICD poprzez autofagię.

Sygnalizacja TGF-β

Mutacje w genie a2V powodują autosomalny recesywny zespół Cutis Laxa (ACL), w którym pacjenci prezentują zmniejszoną ilość białek macierzy pozakomórkowej, takich jak kolagen, co skutkuje fenotypem pomarszczonej skóry. Wspierając te ustalenia, mechanistyczne badania mutacji odpowiedzialnych za cutis laxa u ludzi zidentyfikowały mutację a2P405L jako niestabilną i wadliwą w handlu golgiami w porównaniu do typu dzikiego. Ponadto, doniesienia wskazują na defekt glikozylacji w ACL, co skutkuje zwiększoną promocją sygnalizacji transformującego czynnika wzrostu-beta (TGF-β) u tych pacjentów z mutacją a2V. V-ATPaza promuje indukowane przez TGF-β przejście nabłonkowo-mezenchymalne komórek nabłonka kanalików proksymalnych szczura. Oprócz wpływu na sygnalizację Notch, inhibicja a2V aktywowała ścieżkę Wnt w TNBC i ścieżkę TGF-β w komórkach nabłonka sutka. To sugeruje, że rola a2V w modulowaniu mediatorów sygnalizacji nie jest wyłączna dla Notch. Ponadto, myszy te wykazywały również zmniejszenie całkowitej ilości kolagenu z powodu upośledzonej glikozylacji.

sygnalizacja mTOR

W sygnalizacji mTOR, serynowo-treoninowa kinaza mTOR i inne składniki kompleksu mTOR 1 (mTORC1) wyczuwają dostępność aminokwasów, stres komórkowy i modulują wzrost.Po stymulacji aminokwasami, V-ATPaza aktywuje aktywność czynnika wymiany guaniny (GEF) Ragulator w kierunku RagA, który z kolei promuje hydrolizę GTP RagC. RagA związany z GTP i RagC obciążony GDP wspólnie rekrutują mTORC1 do powierzchni lizosomalnej. Aktywowany mTORC1 w odpowiedzi na sygnalizację czynnika wzrostu kontroluje regulacyjny przełącznik od śmierci komórki do proliferacji. Ostatnie doniesienie sugeruje udział regulatora pompy protonowej osteoklastu Atp6v1c1 w zwiększaniu wzrostu raka piersi poprzez aktywację ścieżki mTORC1 i przerzutów kostnych poprzez zwiększenie aktywności V-ATPazy .

.