Alai

Abstract

Rheumatoid arthritis (RA) jest chorobą autoimmunologiczną. Jad osy (WV), który jest uważany za tradycyjną medycynę ludową w narodowości Jingpo w Yunnan, Chiny, łagodzi reumatoidalne zapalenie stawów. Obecna praca miała na celu zbadanie wpływu jadu osy na łagodzenie objawów reumatoidalnego zapalenia stawów u szczurów doświadczalnych. Stworzyliśmy model zapalenia stawów indukowanego kolagenem typu II (CII-) u szczurów SD i zbadaliśmy hamowanie zapalenia i odpowiedzi autoimmunologicznej. Działanie przeciwartretyczne WV oceniano na podstawie obrzęku łapy, a także oceniano wynik histopatologiczny i zmiany histopatologiczne uszkodzonej łapy. Działanie przeciwzapalne oceniano na podstawie poziomu IL-6, TNF-α, IL-1β oraz liczby komórek zapalnych we krwi obwodowej. Zmianę proporcji podzbiorów komórek T w śledzionie szczurów wykryto za pomocą cytometrii przepływowej, a jednocześnie oceniano wskaźnik trzewny i poziom immunoglobulin w surowicy. Wyniki sugerowały, że różne dawki WV (0.125, 0.25, i 0.5 mg/kg) znacząco złagodziły obrzęk łap i wynik zapalenia stawów u szczurów CIA w porównaniu z nieleczoną kontrolą (). WV (0,25 i 0,5 mg/kg) złagodził zmiany w tkance maziowej stawów skokowych oraz wyniki histopatologiczne hiperplazji synowiocytów i nacieku komórek zapalnych w porównaniu z grupą otrzymującą lek (). Jeśli chodzi o regulację immunologiczną, 0,5 mg/kg WV obniżyło poziom globuliny immunologicznej w surowicy (), a następnie stwierdziliśmy, że WV (0,5 mg/kg) tłumił odpowiedź immunologiczną komórek Th, podczas gdy funkcje komórek Tc i komórek Treg w komórkach śledziony były znacznie wzmocnione (). Wykazane działanie immunosupresyjne WV było analogiczne do jego hamującego wpływu na poziom IL-1β, TNF-α, IL-8, IL-6, COX-2 i PGE2 w surowicy szczurów. Podsumowując, wyniki te wykazały, że WV wykazują aktywność przeciwartretyczną, co może być związane z ich hamującym wpływem na immunoregulację i działanie przeciwzapalne.

1. Wprowadzenie

Reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) jest przewlekłą chorobą autoimmunologiczną, która może postępować do powikłań ogólnoustrojowych, niepełnosprawności fizycznej, a nawet wczesnej śmierci. Głównymi cechami RZS są hiperplazja komórek błony maziowej, przewlekłe zapalenie błony maziowej oraz niszczenie chrząstki i kości. Ponadto, w procesie patofizjologicznym kluczową rolę odgrywa synergistyczne działanie limfocytów T, limfocytów B oraz cytokin prozapalnych. Kiedy komórki T CD4+ są aktywowane, wytwarzają cytokiny prozapalne, które wzmacniają odpowiedź immunologiczną poprzez stymulację innych komórek jednojądrzastych, fibroblastów maziowych, chondrocytów i osteoklastów. Uwalnianie tych cytokin prozapalnych, zwłaszcza TNF-α, IL-6 i IL-1β, może przyczyniać się do zapalenia błony maziowej .

Obecnie leki stosowane w leczeniu klinicznym RZS koncentrują się przede wszystkim na ograniczaniu mediatorów zapalenia, takich jak niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ), leki przeciwreumatyczne modyfikujące przebieg choroby (DMARD) oraz czynniki biologiczne. Na przykład, analog folianów – metotreksat (MTX), jako lek z grupy NLPZ, został zatwierdzony przez FDA dla RZS w 1988 roku. Ponadto, stał się on najczęściej stosowanym lekiem w leczeniu RZS ze względu na jego aktywność immunosupresyjną, działanie przeciwzapalne i niski koszt. Jednak MTX nie jest idealnym środkiem terapeutycznym ze względu na jego niepożądane działania uboczne na układ nerwowy, pokarmowy i odpornościowy, podobnie jak inne leki. Dlatego też coraz większa liczba osób poszukuje nowych alternatyw, aby rozwiązać problem nieskuteczności i bezpieczeństwa tych leków. W teorii tradycyjnej medycyny chińskiej (TCM), RZS jest uważany za jeden z zespołów bólowych stawów („Bi Zheng” w TCM), prawdopodobnie spowodowanych przez egzogenny wiatr, wilgoć i ciepło lub zimno patogenów . Zastosowanie TCM w zapobieganiu i leczeniu chorób ma kilkusetletnią historię, a jego rosnące znaczenie w leczeniu RZS przypisuje się jego niezwykłej skuteczności, ale mniejszej liczbie skutków ubocznych i kosztów. Terapia jadami, jako podejście medycyny komplementarnej i alternatywnej, była stosowana przez kilka stuleci w leczeniu bólu, zapalenia i zapalenia stawów w medycynie ludowej. Już w okresie Walczących Państw, Wewnętrzny Kanon Żółtego Cesarza („Huangdi Neijing” w języku chińskim) posiada zapis „użądlenie pszczoły jest terapeutyczne pomimo poniesionego ryzyka toksycznego.” Według współczesnych badań medycznych, jad pszczeli (BV) wykazuje działanie przeciwartretyczne, przeciwzapalne i przeciwbólowe, które można przypisać aktywacji centralnego układu hamującego i modulacji układu odpornościowego poprzez wiele mechanizmów . Kilka badań klinicznych wykazało również, że BV może poprawić objawy związane z zapaleniem stawów .

Jad osy zawiera różnorodne biologicznie aktywne składniki, w tym aminy biogenne, substancje o dużej masie cząsteczkowej (takie jak enzymy, alergeny i bioaktywne peptydy) oraz toksyny poliaminowe. Jad osy wykazuje różne efekty farmakologiczne w leczeniu bólu, chorób zapalnych i chorób neurodegeneracyjnych. Vespa magnifica (Smith) jest rodzajem osy społecznej, występującej w Yunnan, w Chinach. W ostatnich latach z jej jadu wyodrębniono wiele związków o działaniu przeciwzakrzepowym, przeciwpłytkowym, przeciwzapalnym i immunosupresyjnym. W oparciu o jego niezwykły efekt na reumatoidalne zapalenie stawów, stało się zwyczajem być szeroko stosowane w Jingpo, chińskiej mniejszości narodowej . Niemniej jednak, o ile nam wiadomo, było tylko kilka raportów na temat działań przeciwreumatycznych jadu osy.

W obecnej pracy, model zapalenia stawów indukowanego kolagenem (CIA) został przyjęty, aby ściśle odwzorować patogenezę RZS. Zmiany w objętości łapy były klasycznie używane do oceny efektów przeciwzapalnych na RZS jak zwykle. Ponadto, ocenialiśmy wpływ WV (jad osy Vespa magnifica) w tym samym modelu. Wreszcie, skuteczność WV na działanie przeciwzapalne i immunomodulacyjne obserwowano za pomocą barwienia H&E tkanki stawowej, cytometrii przepływowej podgrup komórek T w śledzionie, jak również ELISA surowicy IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-8, COX-2, PGE2 i czynników reumatoidalnych (IgG, IgA, i IgM).

2. Materiały i metody

2.1. Zwierzęta doświadczalne

Szczury męskie SD (60 szczurów, 180-220 g) otrzymano z Hunan Slake Jingda Laboratory Animal Co., Ltd. Zwierzęta umieszczono w standardowych klatkach polipropylenowych wyłożonych surową łuską (odnawianą po 48 h). Zwierzętarnia była utrzymywana w cyklu światło/ciemność 12 h, w temperaturze około 22 ± 2°C i wilgotności względnej 60-70%, a zwierzęta miały swobodny dostęp do wody i standardowej karmy. Szczury zostały losowo przydzielone do 8 grup kontrolnych i 52 modelowych, a następnie na adaptację w każdym eksperymencie przeznaczono co najmniej 7 dni. Wszystkie procedury eksperymentalne przeprowadzono zgodnie z przewodnikiem dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych (National Institutes of Health) i zatwierdzono przez Komitet Etyczny Uniwersytetu Dali.

2.2. Model zwierzęcy CIA i protokół leczenia

Szczury zdezynfekowano alkoholem i wstrzyknięto podskórnie w prawy vola pedis, grzbiet i ogon z 1 mg/ml emulgatora CCII (kolagen typu II z kurczaka) do pierwszej immunizacji, który składa się z CCII (C9301, Sigma) emulgowanego 1 : 1 z niepełnym adiuwantem Freunda (F5506, Sigma). Dzień indukcji został wyznaczony jako dzień 0. Dawkę wspomagającą wstrzykiwano ponownie w brzuch, grzbiet i ogon wraz z 1 ml emulgatora CCII w dniu 8. Wstrzyknięta stopa została zdefiniowana jako stopa zapalna, podczas gdy druga stopa bez iniekcji została odnotowana jako stopa wtórna. Następnie szczury z zapaleniem stawów indukowanym kolagenem (CIA) były leczone w dniu 14 i zakończone w dniu 28. Po wystąpieniu CIA, szczury modelowe zostały losowo podzielone na pięć grup w zależności od punktacji klinicznej. Grupa I: grupa modelowa, która otrzymała podskórną iniekcję (1 ml/kg) normalnego roztworu soli fizjologicznej jako nośnika. Grupy II-IV: szczury CIA otrzymały podskórne wstrzyknięcie 0,125, 0,25 i 0,5 mg/kg WV (jad osy, z Vespa magnifica (Smith) w Yunnan, Chiny, liofilizowany proszek z wysięku gruczołów ogonowych osy, rozcieńczony normalną solą fizjologiczną), odpowiednio, jako grupy lecznicze. Grupa V: pozytywna grupa kontrolna otrzymała TwHF (Tripterygium wilfordii Hook F, nr 20181001, Huangshi Feiyun Pharmaceutical Co., Ltd.) w wysokości 9 mg/kg w ten sam sposób. Równocześnie w grupie kontrolnej szczurom normalnym podawano taką samą objętość samej zwykłej soli fizjologicznej. Szczury powyżej wszystkich miały codzienne podawanie przez 14 dni.

2.3. Podstawowa ocena doświadczalnego zapalenia stawów

Ciężkość CIA była okresowo oceniana na podstawie obrzęku łap i punktacji zapalenia stawów. Szczury ważono w dniach 0-28 badania, a grubość i obwód kostek w stopie zapalnej (prawa stopa) i wtórnej (lewa stopa) mierzono oddzielnie za pomocą suwmiarki noniuszowej i taśmy w dniu 0, 14 i 28. Punktacja zapalenia stawów została oceniona na podstawie niezależnych obserwacji trzech badaczy. Każda łapa była oceniana w skali 0-4, co oznacza, że maksymalna łączna ocena dla obu stawów tylnych łap wynosiła 8. Kryteria oceny były następujące: 0 = brak obrzęku lub jakichkolwiek zmian wizualnych; 1 = niewielki obrzęk i ograniczony rumień; 2 = lekki obrzęk i rumień; 3 = oczywisty obrzęk i znaczny rumień; i 4 = ciężki obrzęk i rozległy rumień . W 28. dniu zwierzęta uśmiercono, a następnie pobrano surowicę i wtórne stawy skokowe, które przetworzono do dalszej analizy.

2.4. Histopatology of Ankle Joints

Lewe kończyny tylne bez usuwania sąsiednich tkanek natychmiast przemywano PBS 2-3 razy, utrwalano 10% formaliną przez 48 h i odwapniano 5% kwasem azotowym przez 24 h, aż kora kostna była łatwa do przejechania końcówką igły. Próbki były zatapiane w parafinie i cięte na plastry (5 μm) do rutynowego barwienia hematoksyliną-eozyną (H&E). Zmiany patologiczne w stawach wykrywano za pomocą mikroskopu świetlnego (Olympus, Japonia) i fotografowano. Zdjęcia wykonywano przy powiększeniu 200x. Wykryto również zmiany w zakresie hiperplazji synowiocytów i nacieku komórek zapalnych. Zmiany histopatologiczne oceniano, odpowiednio, według następujących kryteriów: 0 = brak wykrywalnych zmian; 1 = łagodne; 2 = umiarkowane; 3 = ciężkie .

2,5. Analysis of Viscera Index

Rats were sacrificed and complete liver, spleen, and thymus were resected with surrounding adipose tissue and fascia carefully separated. Mokrą masę wątroby, śledziony i grasicy mierzono za pomocą wagi elektronicznej, a indeks trzewi (w tym indeks wątroby, indeks śledziony i indeks grasicy) obliczano według następującego wzoru. Wskaźnik trzewny = masa narządu (mg)/masa ciała (g) × 100%.

2.6. ELISAs of Serum Biochemical Indexes

Surowicę szczurów doświadczalnych pobierano, a stężenia TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, COX-2 i PGE2 wykrywano za pomocą zestawów ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) (Nanjing JianCheng, Chiny) zgodnie z instrukcjami producenta. Zestawy ELISA do wykrywania poziomów ekspresji IgA (ERC015), IgG (ERC016) i IgM (ERC017) zakupiono od NeoBioscience Co., Ltd., Shenzhen, Chiny.

2.7. Flow Cytometry of Arthritis Spleen

Liczbę podzbiorów komórek T wykrywano za pomocą cytometrii przepływowej. Limfocyty pobierano z komórek śledziony szczura, które homogenizowano przepuszczając przez sito nylonowe o średnicy 200 oczek. Komórki filtrowano do buforu PBS zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej. Stężenie komórek dostosowano do około 2 × 106/ml, a następnie dodano 3 ml buforu do lizy krwinek czerwonych (Solarbio, Chiny) w celu rozpuszczenia krwinek czerwonych przez mniej niż 5 minut. Następnie komórki odwirowywano przy 1200 obr/min przez 5 min, przemywano dwukrotnie buforem FBS-PBS, który zawierał 10% płodowej surowicy bydlęcej, a następnie odwirowywano przy 1200 obr/min przez 5 min. Każde 100 μL zawiesiny komórkowej umieszczano w probówkach wirówkowych. Limfocyty poddawano barwieniu za pomocą anty-CD3-FITC (nr 557354; BD, USA), anty-CD4-APC (nr 565432; BD, USA), anty-CD8-PerCP (nr 558824; BD, USA) i anty-CD25-PE (nr 554866; BD, USA). Przeciwciała monoklonalne dodawano do każdej probówki, ponownie mieszano i pozostawiano na lodzie przez 30 minut. Do każdej probówki z próbkami dodawano bufor FBS-PBS (1 ml) i wirowano przy 1200 obr/min przez 5 min, a supernatant odstawiano. Poprzedni etap powtarzano dwukrotnie, tak aby całkowicie wymyć komórki nie wiążące się z przeciwciałami monoklonalnymi. Komórki doświadczalne mieszano z 500 μL buforu FBS-PBS. Stosunki komórek T CD25+/CD4+ i CD4+/CD8+ określano przy użyciu cytometru przepływowego FACS Canto (BD, USA) .

2,8. Analizy statystyczne

Dane poddano analizie statystycznej przy użyciu programu SPSS10.0. Dane przedstawiono w postaci średniej ± odchylenie standardowe średniej (S.D.M). Istotność różnic pomiędzy poszczególnymi grupami analizowano za pomocą jednokierunkowej ANOVA, a następnie testu Tukeya. W szczególności, punktację zapalenia stawów i punktację histopatologiczną analizowano testem sumy rang Wilcoxona. Wartości równe uznano za statystycznie istotne.

3. Wyniki

3.1. WV złagodził objawy zapalenia stawów u szczurów CIA

Objawy zapalenia stawów zostały z powodzeniem wywołane u szczurów przez wstrzyknięcie kolagenu typu II zgodnie z instrukcją, co ucieleśniło się w znaczących makroskopowych oznakach silnego zaczerwienienia i obrzęku w drugorzędowej łapie i stawie skokowym szczurów CIA na Rysunku 1(a), jeśli porównać ze zdrową grupą kontrolną. Grubość i obwód stawu skokowego były widocznie zwiększone w pojazdach w dniu 14 (Figura 1(b)) w porównaniu z tymi w kontrolach; jednakże, były one uderzająco zmniejszone po TwHF i wszystkich grupach leczonych WV w dniu 28 w porównaniu z tymi w grupie modelowej (wszystkie ) (Figura 1(b)). Kiedy zmierzyliśmy grubość i obwód stawów skokowych zarówno w stopie zapalnej jak i w stopie wtórnej, oczywiste ustąpienie obrzęku zostało wykazane na podstawie danych (Figura 1(b)). Wyniki stopnia obrzęku wskazały, że WV może kontrolować obrzęk łapy i złagodzić wtórny stan zapalny na łapie i stawie skokowym, co odpowiada efektowi TwHF.

(a)

(b)

(c)

.
(a)
(b)
(c)

Rycina 1

Wpływ WV na objawy choroby zwyrodnieniowej stawów w każdej z grup. (a) Stopień obrzęku łap we wszystkich grupach. (b) Grubość i obwód stawów skokowych zarówno w stopie zapalnej jak i wtórnie zmienionej we wszystkich grupach. (c) Porównanie wyniku zapalenia stawów wśród wszystkich grup.

Więcej, wynik zapalenia stawów został zmniejszony w różnym stopniu poprzez leczenie WV w zależności od wielkości dawki, jak pokazano na Rysunku 1(c). Wynik zapalenia stawów w grupie pojazdu wynosił 6,5 ± 1,0 w dniu 14 (vs dzień 0, ). W grupie leczonej TwHF w 28. dniu indeks ten był istotnie obniżony i wynosił 2,8 ± 0,8 (vs 14. dzień, ). Podobnie, spadek indeksów przez WV był znaczący i zależny od dawki (3.2 ± 0.6 przy 0.5 mg/kg, 4.3 ± 0.7 przy 0.25 mg/kg, i 5.6 ± 0.7 przy 0.125 mg/kg) (severally vs 14 dni, ). To wskazało, że siła działania WV w dawce 0,5 mg/kg była współmierna do siły działania grupy leczonej TwHF.

3.2. WV łagodzi zmiany patologiczne stawów u szczurów CIA

H&E barwienie (Rysunek 2(a)) pokazało, że błona maziowa stawów skokowych szczurów kontrolnych miała regularny układ komórkowy, bez hiperplazji synowiocytów, nacieków komórek zapalnych i gładką powierzchnię chrząstki. Natomiast u szczurów z grupy kontrolnej architektura histologiczna stawów była wyraźnie nieprawidłowa, z naciekiem komórek odpornościowych, przerostem synowiocytów, zwiększoną liczbą naczyń oraz erozją chrząstki i kości. Stawy w grupach TwHF i WV uległy znacznemu osłabieniu w stosunku do stawów grupy nośnika i zbliżyły się do stawów grupy kontrolnej. Wyniki histopatologiczne (rysunek 2(b)) wskazywały (grupa pojazdu) na nieprawidłowe komórki błony maziowej i infiltrację komórek zapalnych w stawach; leczenie TwHF i WV znacząco obniżyło średni wynik histopatologiczny i odbudowało chrząstkę w porównaniu do grupy pojazdu ().

(a)

(b)

(a)
(b)

Rycina 2

Wpływ WV na progresję zapalenia stawów i histologię stawów u szczurów CIA. (a) Histopatologia wycinków tkanki stawowej szczurów z CIA leczonych różnymi dawkami WV i TwHF oraz szczurów normalnych metodą barwienia H&E. Oryginalne powiększenie ×200. a, destrukcja kości; b, naciek komórek immunologicznych; c, przerost błony maziowej. (b) Wyniki histopatologiczne hiperplazji synowiocytów i nacieku komórek zapalnych we wszystkich grupach. , w porównaniu z grupą kontrolną; , w porównaniu z grupą pojazdu.

3.3. Effects of WV on Viscera Index and Immune Serum Globulin Levels in CIA Rats

W porównaniu z grupą kontrolną, indeks wątrobowy grupy pojazdu zmniejszył się znacząco (), a WV (0,25 i 0,5 mg/kg) zwiększył się znacząco (). W porównaniu z grupą kontrolną, indeks śledziony i indeks grasicy w grupie pojazdu znacznie wzrosły (); TwHF i WV odgrywały na nie hamujący wpływ, który szczególnie odzwierciedlał się we wpływie dawki 0,5 mg/kg WV na indeks grasicy (rysunek 3(a)).

(a)

(b)

(a)
(b)

Rycina 3

Wpływ WV na wskaźnik trzewi i poziom globuliny immunologicznej w surowicy krwi u szczurów CIA. (a) Zmiany w śledzionie, grasicy i indeksie wątrobowym we wszystkich grupach. (b) Poziomy ekspresji IgG, IgA, i IgM w surowicy wszystkich grup. , w porównaniu z grupą kontrolną; , w porównaniu z grupą pojazdu.

Poziomy ekspresji IgG, IgA, i IgM uległy radykalnej poprawie u szczurów CIA () w porównaniu z kontrolą, podczas gdy stały się niższe po przetworzeniu TwHF (). A poziomy surowicy IgG zostały obniżone w grupie WV (0,5 mg/kg) w porównaniu z grupą pojazdu (). Zahamowanie to dotyczyło również IgA i IgM w grupach WV (0,25 i 0,5 mg/kg) (Figura 3(b)).

3.4. Effects of WV on T Cell Subsets in the Spleen of CIA Rats

Liczba komórek T CD4+ istotnie wzrosła w grupach pojazdu w porównaniu z grupą kontrolną (), podczas gdy te w grupach TwHF i WV (0,5 mg/kg) były istotnie niższe niż w grupie pojazdu (Figura 4(a)). W porównaniu z grupą kontrolną, liczba komórek T CD4+CD25+ w grupie pojazdu była znacznie zmniejszona (), podczas gdy były one znacznie zwiększone w grupach TwHF i WV (0,5 mg/kg) (), ale nie były oczywiste w innych grupach (Figura 4(a)). W porównaniu z grupą kontrolną, redukcja w grupie pojazdu liczby komórek T CD8+ była znacząca, ale tylko WV (0,125 i 0,25 mg/kg) spowodował wzrost liczby (, ) na Figurze 4(b).

(a)

(b)

(a)
(b)

Rycina 4

Liczba podzbiorów komórek T w komórkach śledziony metodą cytometrii przepływowej. (a) Wyniki FCM dotyczące liczby komórek Th i komórek Tc (po lewej); wyniki FCM dotyczące liczby komórek Treg (po prawej). (b) Wykres słupkowy wskazuje na negatywny wpływ WV i TwHF na komórki Th oraz pozytywny na komórki Tc i Treg. , w porównaniu z grupą kontrolną; , w porównaniu z grupą pojazdu.

3.5. WV Regulated Serum Cytokines and Mediators in CIA Rats

ELISA kits (Figure 5) showed that, compared to the control group, the serum levels of IL-1β, TNF-α, IL-6, PGE2, COX-2, and IL-8 were significantly increased in vehicle group and were markedly restored by TwHF (9 mg/kg) and WV (0.5 mg/kg) (). Tymczasem ekspresja IL-6 i PGE2 została stłumiona przez WV w dawkach 0,125 i 0,25 mg/kg (). WV (0.125 i 0.25 mg/kg) podobnie zmniejszył ekspresję COX-2 i IL-8 w porównaniu do pojazdu (, ). To wskazało, że zapalenie wywołane CCII prawdopodobnie pośredniczyło w patologicznych zmianach obserwowanych u szczurów artretycznych, a WV może złagodzić odpowiedź zapalną.

Rycina 5

Wpływ WV na poziomy IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, PGE2 i COX-2 w surowicy szczurów CIA. , w porównaniu z grupą kontrolną; , w porównaniu z grupą nośnika.

4. Dyskusja

RA jest przewlekłą chorobą autoimmunologiczną charakteryzującą się bólem, obrzękiem i stopniowym niszczeniem stawów, co prowadzi do utraty funkcji. cAlthough methotrexate (MTX) tablets are offen considered as a treatment medicine for rheumatoid arthritis , they are usually associated with adverse drug reactions (ADRs) . Dlatego też staraliśmy się ocenić, czy jad osy (WV) może stanowić potencjalny alternatywny lek na RZS.

Niniejsze badanie było pierwszym, według naszej wiedzy, badającym rolę terapeutyczną WV (z Vespa magnifica) w kolagenowym zapaleniu stawów (CIA) indukowanym u szczurów SD i porównywanym z klinicznie udowodnionym działaniem TwHF. Tripterygium wilfordii Hook F (TwHF), znany również jako Lei Gong Teng w TCM, jest stosowany w leczeniu RZS od wielu lat w Chinach, a ekstrakty z TwHF wykazały aktywność przeciwzapalną i immunosupresyjną zarówno w badaniach in vivo, jak i in vitro. Ustanowiliśmy model szczurów CIA na 14 dni i usunęliśmy 12 pozornych niekompetencji, które mogły być spowodowane niepowodzeniem iniekcji z 52 szczurów, to znaczy, że szczury CIA miały 77% wskaźnik zapalenia stawów. Grupa kontrolna nie wykazywała objawów ani obrzęku, ani zapalenia (ryc. 1 i 5), a nasze ustalenia są zgodne z wcześniejszymi badaniami RZS i CIA, które donosiły, że emulgator CCII indukował nasilenie obrzęku i uszkodzenia zapalne w stawach . Następnie, poprawione objawy w grupie WV (0,5 mg/kg) były podobne do tych z pozytywnym lekiem TwHF, który został zgłoszony do hamowania odpowiedzi zapalnej RA , ale wpływ niskiej dawki nie był znaczący na zmniejszenie obrzęku i hamowanie IL-1β i TNF-α (ryc. 1 i 5). Ponadto zauważyliśmy, że szczury w grupie pojazdów miały bardziej szorstkie futro i gorszy stan psychiczny niż te w grupie kontrolnej; warunki te zmieniły się na lepsze w grupie leczonej.

Poprzednie badania wykazały, że zapalenie błony maziowej rekrutuje i aktywuje komórki odpornościowe przez wytwarzanie mediatorów, a komórki T odgrywają istotne role w regulacji RZS. W odniesieniu do roli cytokin prozapalnych w autoimmunizacji, istotne jest rozważenie równowagi pomiędzy różnymi podzbiorami komórek T, podzielonymi głównie na dwa hipotypy w zależności od ich funkcji i fenotypów: CD4+ helper T (Th) cell i CD8+ cytotoxic T (Tc) cell. Komórki Th i Tc, charakteryzujące się produkcją różnych specyficznych cytokin, ułatwiają adaptacyjną odpowiedź immunologiczną. Z kolei komórki CD4+CD25+ T (Treg) pełnią kluczową funkcję w utrzymaniu tolerancji immunologicznej poprzez kontrolowanie odpowiedzi zapalnej i tłumienie aktywności wyżej wymienionych komórek odpornościowych. W tym badaniu stwierdziliśmy dużą koncentrację komórek Th i Tc w komórkach śledziony, a także zauważyliśmy upośledzoną funkcję komórek Treg u szczurów z CIA. Na szczęście równowaga między subsetami komórek T została zachowana dzięki leczeniu TwHF i WV (Figura 4). Warto zauważyć, że nagromadzenie komórek odpornościowych jest promotorem lokalnego zapalenia stawów, a aktywowane komórki odpornościowe uwalniają dużą ilość cytokin prozapalnych, które następnie indukują aktywację i proliferację komórek synowialnych i dalej pogarszają progresję zapalenia stawów. Wcześniejsze badania wykazały, że IL-6 jest najbardziej dominującą cytokiną w patogenezie RZS, a w płynie maziowym pacjentów z RZS stwierdzono nadmierne ilości IL-1β, a także TNF-α i IL-8. Stwierdzono również zwiększoną produkcję COX-2 i PGE2 po stymulacji IL-1β, a ich blokowanie istotnie łagodziło objawy RZS. Podobne wyniki zaobserwowano w naszych badaniach eksperymentalnych i potwierdziliśmy, że TwHF i WV (0,5 mg/kg) mogą skutecznie zmniejszyć poziom IL-6, IL-8, PGE2 i COX-2; również zwiększone stężenia IL-1β i TNF-α indukowane przez RZS zostały stłumione z wyjątkiem grup WV (0,125 i 0.25 mg/kg) (rysunek 5).

Wyniki te sugerują, że WV ma funkcje łagodzenia obrzęku stawów, hamowania zapalenia błony maziowej, tłumienia nadmiernej odpowiedzi immunologicznej i ochrony homeostazy immunologicznej, co może poprawić objawy i stać się skutecznym środkiem leczniczym w RZS. Stwierdzono, że jad osy zawiera wiele bioaktywnych cząsteczek, w tym aminy, małe peptydy, a nawet enzymy, alergeny i toksyny o dużej masie cząsteczkowej. To, co odróżnia WV od BV, to fakt, że BV ma głównie działanie przeciwzapalne, antyoksydacyjne i przeciwbólowe na RZS, a także zawiera wiele różnych peptydów, w tym melitynę, fosfolipazę A2, apaminę i tak dalej . Mechanizmy leczenia RZS za pomocą tych dwóch jadów mogą być różne i są warte dalszych badań. Chociaż w zakresie od 0,125 do 0,5 mg/kg WV nie zaobserwowano żadnych skutków ubocznych, wymagana jest dalsza ocena składników aktywnych i bezpieczeństwa ekstraktu WV.

5. Wnioski

Jad osy łagodził hiperplazję błony maziowej i destrukcję chrząstki spowodowaną przez CIA, prawdopodobnie dzięki redukcji czynnika prozapalnego i efektowi immunoregulacyjnemu. Badanie to wykazało, że jad osy mógł być potencjalną alternatywą terapeutyczną dla RZS. Oprócz tego, że WV jest receptą ludową od wielu lat, zasługuje on na dalsze badania, aby zostać odkryty, zbadany i uznany.

Dostępność danych

Dane użyte do poparcia wyników tego badania są zawarte w artykule i mogą być swobodnie udostępnione.

Zatwierdzenie etyczne

Badanie zostało zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of Dali University.

Konflikt interesów

Autorzy deklarują, że nie ma konfliktu interesów w związku z publikacją tej pracy.

Wkład autorów

YG napisał manuskrypt i pomagał w konstrukcji i grupowaniu modeli zwierzęcych. WXY i HL wykonali barwienie H&E i cytometrię przepływową. XMD i LLN byli odpowiedzialni za zestawy ELISA. ZBY, HRZ i HX przyczynili się w znacznym stopniu do napisania manuskryptu. ZBY i CGZ zarządzali i nadzorowali projekt. Wszyscy autorzy przeczytali i zatwierdzili ostateczną wersję manuskryptu.

Podziękowania

Część tej pracy była wspierana przez Yunnan Provincial 2011 Collaborative Innovation Center for Entomoceutics. Obecne badania były finansowane przez National Natural Science Foundation of China (granty nr 81360679 i 81703742), Yunnan Applied Basic Research for Young Scholars (grant nr 2016FD074), Natural Science Foundation of Yunnan Province (grant nr. 2017FA050), oraz Dali University Innovation Team of Advanced Pharmaceutics of Entomological Bio-Pharmacy R&D (grant nr ZKLX2019101).

.