Alai

Ustalenie zakresu temperatur

Powszechnie stosowane warunki laboratoryjne dla hodowli Macrostomum lignano są następujące: temperatura 20°C, wilgotność 60% i cykl światło/ciemność 14 h/10 h. Warunki te zostały wybrane głównie dlatego, że są one optymalne dla wzrostu okrzemek Nitzschia curvilineata, które są głównym źródłem pożywienia dla robaków. Aby ocenić warunki temperaturowe, które mogą być wykorzystane w eksperymencie, najpierw określiliśmy zakres temperatur, w których robaki przeżywają. Podczas gdy zamrożenie robaków okazało się śmiertelne, mogły one przeżyć, gdy były trzymane w temperaturze 4 °C przez co najmniej dwa tygodnie. Ponieważ jednak okrzemki nie rosną w tych warunkach, postanowiliśmy wykluczyć temperaturę 4 °C z dalszych eksperymentów. Inne temperatury poniżej 20 °C również zostały wykluczone z eksperymentu, ponieważ głównym celem badania było znalezienie warunków, które przyspieszają wzrost i rozwój. Z drugiej strony spektrum temperatur, robaki rozpuszczały się, gdy były trzymane w temperaturze 42 °C przez dwie godziny, a umierały po tygodniu hodowli w temperaturze 37 °C. Dlatego zdecydowaliśmy się użyć 20 °C, 25 °C, 30 °C i 35 °C jako naszych warunków eksperymentalnych do badania długoterminowego wpływu temperatury na M. lignano (Rys. 1).

Odpowiedź na szok cieplny

Aby zbadać, które temperatury indukują odpowiedź na stres u robaków, monitorowaliśmy aktywność promotora szoku cieplnego 20 (Mlig-hsp20). Najpierw przeprowadziliśmy ilościowe RT-PCR, aby zmierzyć poziom ekspresji Mlig-hsp20 w 20 °C, 25 °C, 30 °C, 33 °C, 34 °C i 35 °C. Nie było znaczącej różnicy w poziomie ekspresji Hsp20 pomiędzy 20 °C i 25 °C (Rys. 2a). Jednakże zaobserwowano niewielki (2-krotny), ale istotny (P = 0,027, t-test) wzrost ekspresji w 30 °C w porównaniu do 20 °C (Rys. 2a). Ponad dziesięciokrotny wzrost poziomu ekspresji zaobserwowano w temperaturze 33 °C, który wzrósł do ponad 100-krotnego w najwyższej badanej temperaturze 35 °C (Rys. 2a). W drugim te¶cie utworzono linię transgeniczn± wyrażaj±c± białko mScarlet-I pod kontrol± promotora Mlig-hsp20 (Rys. 2b) i mierzono poziom fluorescencji 24 h po 2-godzinnej inkubacji w różnych temperaturach od 20 °C do 37 °C (Rys. 2c, d). Ponad dwu- i dziesięciokrotny wzrost fluorescencji obserwowano odpowiednio w 34 °C i 37 °C (Rys. 2c).

Szybkość rozwoju embrionalnego

Według Morrisa i wsp. , pełny rozwój jaj Macrostomum trwa około 120 h (pięć dni), gdy jaja są trzymane w temperaturze 20 °C. Aby zbadać, jak temperatura wpływa na szybkość rozwoju embrionalnego i wylęgania, wybraliśmy świeżo złożone embriony i monitorowaliśmy ich rozwój aż do wylęgu w różnych temperaturach. Aby zbadać potencjalne różnice wynikające z pochodzenia genetycznego, użyliśmy dwóch linii M. lignano, które są obecnie używane w większości badań nad M. lignano, linii DV1 i NL10. Linie te pochodzą niezależnie od siebie z populacji typu dzikiego z tej samej lokalizacji geograficznej i różnią się duplikacją całego chromosomu, ale poza tym zachowują się bardzo podobnie w warunkach laboratoryjnych. W pierwszej kolejności badaliśmy wpływ niskiej temperatury. W temperaturze 4°C rozwój jaj zostaje zatrzymany i mogą być one przechowywane przez co najmniej miesiąc, a po powrocie do wyższej temperatury wznawiają swój rozwój. Następnie zbadaliśmy, jak szybko jaja rozwijają się w temperaturze pomiędzy 20 a 35°C. Jak pokazano na Rys. 3, w standardowych warunkach (20°C) jaja zaczęły się wykluwać po sześciu dniach. Wzrost temperatury powodował proporcjonalnie szybszy rozwój embrionalny i wcześniejszy wylęg, który był dwa razy szybszy w 35 °C w porównaniu do 20 °C i trwał tylko trzy dni. Warto zauważyć, że około 10% jaj pozostaje niewyklutych po ośmiu dniach inkubacji w temperaturze 20 °C, w porównaniu do mniej niż 5% w wyższych temperaturach, co sugeruje, że nawet najwyższa testowana temperatura 35 °C nie ma szkodliwego wpływu na przeżywalność embrionów.

Reprodukcja

Współczynnik reprodukcji jest bardzo ważnym czynnikiem dla organizmu modelowego, ponieważ zwierzęta o krótszym czasie generacji umożliwiają szybsze generowanie danych w eksperymentach genetycznych. Ponadto, jeśli zwierzęta produkują dużą liczbę potomstwa, wygenerowane dane będą w większości przypadków miały większą moc statystyczną.

Aby ocenić wpływ temperatury na tempo reprodukcji M. lignano porównaliśmy liczbę potomstwa generowanego w ciągu pięciu tygodni przez robaki trzymane w różnych warunkach temperaturowych. Eksperyment rozpoczęto od wylęgu, aby uwzględnić w badaniu rozwój postembrionalny, użyto zarówno linii DV1, jak i NL10. W temperaturze 20 °C wylęgarnie obu linii potrzebowały trzech tygodni, aby urosnąć i wydać pierwsze potomstwo, natomiast w temperaturze 25 °C wylęgarnie obserwowano po dwóch tygodniach dla linii NL10, ale nie dla DV1. W temperaturze 30 °C i 35 °C obie linie wytwarzały potomstwo już po dwóch tygodniach (rys. 4). Począwszy od trzech tygodni liczba wylęgów produkowanych tygodniowo wzrastała od poniżej 200 w temperaturze 20 °C do ponad 300 w temperaturze powyżej 20 °C; liczba wylęgu była najwyższa w przypadku ślimaków trzymanych w temperaturze 30 °C. Dotyczyło to obu środowisk genetycznych i nie zaobserwowaliśmy istotnych różnic pomiędzy liniami DV1 i NL10 (Rys. 4).

Chociaż temperatura 30°C i wyższa skutkowała większą liczbą wylęgu, aktywowała również reakcję szoku cieplnego (Rys. 2). Aby zbadać długoterminowy efekt podwyższonej temperatury i potencjalny stres, jaki może ona wywierać na robaki, trzymaliśmy je w wybranych temperaturach i monitorowaliśmy pod kątem aberracji morfologicznych po trzech i sześciu miesiącach hodowli. Robaki trzymane w temperaturze 25°C nie wykazywały żadnych zmian morfologicznych w obu punktach kontrolnych w porównaniu z robakami trzymanymi w temperaturze 20°C (Rys. 5). Jednakże, zarówno w temperaturze 30 °C, jak i 35 °C zaobserwowano różne zmiany w morfologii ogólnej. Po trzech miesiącach zarówno w linii DV1 jak i NL10 powszechnie występowała zwiększona liczba cyst, uszkodzona tkanka i powiększone jądra (Rys. 5). Żaden z osobników trzymanych w temperaturze 35°C nie przeżył do szóstego miesiąca, a wszystkie osobniki, które przeżyły w temperaturze 30°C wykazywały aberracje morfologiczne (Rys. 5). Dlatego też, przedłużona ekspozycja na temperatury powyżej 30 °C jest szkodliwa dla M. lignano.

Czas regeneracji

Ponieważ główną atrakcją M. lignano jako organizmu modelowego jest jego zdolność do regeneracji, zbadaliśmy jak temperatura wpływa na regenerację. Powszechnie przyjmuje się, że wyższa temperatura prowadzi do wzrostu ogólnej aktywności metabolicznej. Aby ocenić wpływ temperatury na czas potrzebny robakowi do pełnej regeneracji ciała po amputacji powyżej obszaru jąder, śledziliśmy regenerację jąder i pojawienie się plemników w pęcherzykach nasiennych przy użyciu wcześniej stworzonej linii transgenicznej NL22, która wyraża GFP pod kontrolą specyficznego dla jąder i plemników promotora ELAV. Użycie takiego transgenicznego markera zapewnia lepszą precyzję, spójność i wydajność w ocenie stopnia regeneracji. Rzeczywiście, nie zaobserwowaliśmy znaczących różnic podczas oceny czasu pojawienia się sygnału GFP po amputacji we wszystkich testowanych temperaturach (Tabela 1).

Jak oczekiwano, szybkość regeneracji wzrastała wraz z temperaturą (Tabela 1). Jeśli przyjmiemy czas regeneracji w temperaturze 20 °C jako szybkość standardową, to dla regeneracji jąder obliczone współczynniki temperaturowe wynoszą Q10 = 4 przy 25 °C i Q10 = 3 dla 30 °C i 35 °C. Pokazuje to, że największy efekt uzyskuje się przy zwiększeniu temperatury do 25 °C, a najszybsza regeneracja ma miejsce w temperaturze 30 °C, bez dalszych korzyści ze zwiększenia temperatury na czas regeneracji. Stąd, temperatury 25 °C i 30 °C powinny być brane pod uwagę w eksperymentach regeneracyjnych na M. lignano, ponieważ skracają czas trwania eksperymentu dwu- lub trzykrotnie (Tabela 1).

Interferencja RNA

Zmniejszenie ekspresji genów przez interferencję RNA (RNAi) jest obecnie podstawowym podejściem do badań nad utratą funkcji u M. lignano. W tym podejściu zwierzęta są nasączane dwuniciowym RNA skierowanym przeciwko docelowemu genowi, a często do zaobserwowania fenotypu konieczne jest długotrwałe, kilkutygodniowe leczenie. Sprawdziliśmy, jak temperatura wpływa na szybkość rozwoju fenotypu po potraktowaniu RNAi. Aby to zrobić, znokautowaliśmy Mlig-ddx39, gen znany z funkcji proliferacji komórek u M. lignano i silnego śmiertelnego fenotypu znokautowania. Podobnie jak w przypadku testu reprodukcji, do tego eksperymentu użyliśmy linii DV1 i NL10 (Tabela 2). W temperaturze 20°C wszystkie zwierzęta umierały po znokautowaniu Mlig-ddx39 po około 20 dniach. Gdy robaki trzymano w wyższej temperaturze, śmierć następowała szybciej: po 11 i 8 dniach dla robaków trzymanych odpowiednio w 25 i 30 °C. Nie było widocznej różnicy pomiędzy dwoma szczepami użytymi do eksperymentu (Tabela 2). Następnie sprawdziliśmy, czy obserwowany wzrost szybkości manifestacji fenotypu ddx39 RNAi w wyższych temperaturach jest związany z wyższą efektywnością knockdownu genów przez RNAi, czy też z innymi czynnikami. W tym celu zmierzyliśmy metodą qRT-PCR obfitość transkryptów Mlig-ddx39 w różnych punktach czasowych po rozpoczęciu eksperymentu RNAi w różnych temperaturach (Rys. 6). Zwierzęta traktowane dsRNA przeciwko gfp zostały użyte jako kontrole referencyjne. We wszystkich badanych temperaturach nie zaobserwowano istotnych różnic w poziomie ekspresji Mlig-ddx39 pomiędzy próbkami kontrolnymi w trakcie trwania eksperymentu (Rys. 6). Jednocześnie, w przypadku zwierząt traktowanych dsRNA Mlig-ddx39 już po jednym dniu traktowania w 20 °C lub 25 °C obserwowano spadek poziomu transkryptów ddx39 o ~ 80%, a w 30 °C nawet większy spadek o ~ 90%. Jednak w kolejnych dniach poziom knockdown ustabilizował się na poziomie około 95% we wszystkich temperaturach. Stąd wniosek, że temperatura nie wpływa znacząco na kinetykę samego RNAi. Zamiast tego, obserwowane skrócenie czasu manifestacji fenotypu Mlig-ddx39 RNAi w wyższych temperaturach można wyjaśnić zwiększonym tempem obrotu komórek.

Aby sprawdzić, czy przyspieszenie rozwoju fenotypów RNAi w podwyższonej temperaturze może być uogólnione na inne geny, zbadaliśmy gen Mlig-sperm1, którego knockdown prowadzi do nieprawidłowej morfologii plemników i powiększonych jąder . Jest to powolny fenotyp RNAi, który rozwija się przez 2-3 tygodnie w temperaturze 20 °C. Aby określić zakres fenotypu w różnych temperaturach, w 4. dniu leczenia RNAi policzyliśmy frakcję zwierząt z jądrami powiększonymi do tego stopnia, że dotykały się wzajemnie. (Ryc. 7). Podobnie jak w przypadku Mlig-ddx39 RNAi, wyższe temperatury powodowały szybszy rozwój fenotypu i o ile po czterech dniach traktowania dsRNA w 20°C nie obserwowano wystarczająco powiększonych jąder, to w 25°C i 30°C odpowiednio 25 i 85% zwierząt miało powiększone jądra (tab. 2). Stąd, podobnie jak w przypadku regeneracji, fenotypy RNAi mogą być przyspieszane wraz z temperaturą u M. lignano, a wyższe temperatury mogą być stosowane w celu skrócenia czasu trwania eksperymentów.

.