Von Willebrand Factor, ADAMTS13, and Thrombocytopenic Purpura
VWF é sintetizado a partir de um grande gene no cromossoma 12p13.31 que abrange 178 kb e contém 52 exons.49 O RNA mensageiro (mRNA) produzido por este gene especifica um polipéptido de 2813 aminoácidos, que inclui um peptídeo de sinal de 22 aminoácidos, um peptídeo de sinal de 742 aminoácidos, e uma seqüência de 2050 aminoácidos que compõe o bloco de construção monomérica do VWF encontrado no plasma. Após a clivagem do peptídeo de sinal no retículo endoplasmático, os monômeros contendo propéptidos são ligados em dímeros através de ligações de dissulfeto entre cadeias envolvendo resíduos de Cys próximos ao términus C da molécula. Estes dímeros são então transportados para o aparelho Golgi, onde o propéptido catalisa ligações de dissulfureto inter-dímeros entre os resíduos no domínio D3, produzindo longos multímeros compostos por dímeros ligados cabeça a cabeça contendo N-termini em ambas as extremidades. O propéptido é então clivado por uma enzima tipo furina e a maior parte do ULVWF resultante é embalado em grânulos de armazenamento para posterior secreção regulada.
Apenas dois tipos celulares são conhecidos para sintetizar VWF: células endoteliais e megacariócitos. Nas células endoteliais, o VWF é armazenado em grânulos chamados corpos Weibel-Palade; nas plaquetas, é armazenado em grânulos α-grânulos. A maioria dos VWF no sangue é de origem endotelial. Muitos estímulos podem induzir a liberação de VWF endotelial, incluindo epinefrina, desamino-vasopressina (DDAVP), histamina, trombina, toxinas Shiga e citocinas pró-inflamatórias, incluindo fator de necrose tumoral (TNF)-α, interleucina (IL)-8 e IL-6 (em complexo com o receptor IL-6).50 Outros agentes também podem induzir a liberação endotelial de VWF, fornecendo pistas para alguns dos fatores incitantes no TTP. Esses agentes incluem vírus como adenovírus51 e oxidantes como superóxido.52 Os oxidantes não só têm a capacidade de induzir a secreção ULVWF; eles também podem oxidar o VWF de modo a torná-lo inquebrável pelo ADAMTS1353 e mais adesivo.54 Além disso, os oxidantes, especialmente aqueles produzidos por neutrófilos e monócitos durante a inflamação, podem oxidar um resíduo crucial de metionina no domínio catalítico do ADAMTS13 e inativar a enzima.55
As células endoteliais e as plaquetas liberam Multímeros VWF maiores do que os Multímeros em plasma normal.56 Estes multímeros ULVWF não são apenas muito maiores do que os normalmente encontrados no plasma; eles também são muito mais adesivos e capazes de ligar a glicoproteína Ib do receptor VWF plaquetário (GPIbα; maior polipeptídeo do complexo GPIb-IX-V) espontaneamente e com uma força de ligação maior do que a obtida com a ligação do VWF de plasma a GPIbα na presença dos moduladores ristocetina ou botrocetina.57 In vivo, isto se traduz em ULVWF ser capaz de ligar plaquetas sem ou com baixa tensão de cisalhamento, enquanto o VWF de plasma processado requer alta tensão de cisalhamento – desdobramento induzido para ligar plaquetas.58
Uma porção do ULVWF recém liberado entra diretamente no sangue circulante enquanto outra fração permanece presa ao endotélio, onde os multímeros ULVWF podem se auto-associar para formar cordas de várias centenas de micrômetros a vários milímetros de comprimento que permanecem ancoradas à superfície endotelial.59 As cordas ULVWF ligadas à superfície são hiperadesivas e ligam as plaquetas espontaneamente para formar cordas decoradas por plaquetas com aparência de “cordões sobre cordões” na superfície endotelial. Sob tensão de cisalhamento fisiológica, as cordas de ULVWF com decoração de plaquetas são clivadas por ADAMTS13 e removidas da superfície endotelial. O processamento posterior, que ainda não está totalmente caracterizado, torna o VWF incapaz de ligar as plaquetas espontaneamente. O acúmulo de cordas ULVWF decoradas com plaquetas na superfície endotelial como resultado de níveis reduzidos ou da ausência de ADAMTS13 na circulação inicia a trombose microvascular, que leva à formação e deposição de trombos hialinos ricos em plaquetas na microvasculatura – uma característica definidora do TTP.
cordas VWF consistem em feixes de Multímetros VWF, e cada cordão é amarrado à superfície endotelial em vários locais de ancoragem. Na ausência (ou baixas concentrações) de Ca2+ e Mg2+, as cordas ULVWF ligam-se à superfície endotelial através da ligação a P-selectin.60 Na presença de concentrações fisiológicas de cátions divalentes, as cordas ULVWF ancoram à superfície endotelial através de sua interação com a integrina αvβ3.61 Outras moléculas estão sem dúvida envolvidas nesta ancoragem das cordas VWF, mas ainda não estão identificadas.
A capacidade dos Multímeros VWF ou ULVWF de se auto-associarem em fibras e cabos mais grossos torna-se um mecanismo importante para regular as propriedades adesivas do VWF. Savage et al. mostraram que sob tensão de cisalhamento e na presença de plaquetas, os multímeros VWF na fase líquida associam-se homotipicamente e reversivelmente aos multímeros VWF que são imobilizados sobre uma superfície de colágeno; os multímeros VWF auto-associados suportam a adesão de plaquetas sob tensão de cisalhamento.62 Os multímeros VWF fase fluida também podem se associar com as cordas ULVWF ligadas à superfície endotelial,63 e a auto-associação é facilitada pelo desdobramento parcial das moléculas VWF induzidas pela tensão de cisalhamento64,65 ou pela ligação do ristocetina.66 Os multímeros VWF autoassociados formam uma rede de fibras reticuladas em superfícies de colágeno64 ou em solução.66 Sob tensão de cisalhamento, os multímeros VWF fase fluida também podem se associar aos multímeros VWF que são ligados a plaquetas através da interação com GPIbα em superfícies plaquetárias.67 A auto-associação do VWF em superfícies plaquetárias pode desencadear ativação plaquetária, promover agregação plaquetária e aumentar o crescimento do trombo.
A capacidade do VWF de auto-associar-se permite que ele produza fios que rivalizem ou superem o comprimento e a espessura daqueles produzidos pela polimerização da fibrina. Em microvasos sintéticos induzidos a secretar VWF por estimulação agonista, o VWF secretado da parede do vaso poderia se reunir em cordões capazes de abranger a luz do vaso, particularmente em bifurcações e curvas.68 A capacidade do VWF de formar cordões e cabos de dimensões tão enormes e de amarrar esses cabos ao longo da trajetória do fluxo não só aumenta as chances dos cordões capturarem plaquetas, mas também aumenta sua capacidade de triturar eritrócitos em esquistocitos.
A auto-associação do VWF em si é regulada não apenas pelo estresse de cisalhamento, mas por fatores plasmáticos, que provavelmente podem mudar o curso e a severidade dos episódios de TTP. A auto-associação VWF é atenuada pela lipoproteína de alta densidade (HDL) e pela apoliproteína (Apo) A-I, o principal componente proteico do HDL. Ambos reduzem significativamente o comprimento e a espessura das fibras VWF imobilizadas na superfície endotelial. A adesão plaquetária a estas estruturas hiperaderentes também é reduzida em proporção à redução do VWF auto-associado. Em um modelo de TMA em camundongos ADAMTS13 knockout, o HDL também atenuou significativamente a trombocitopenia induzida pela infusão de altas doses de VWF humano.69 Consistente com a capacidade do ApoA-I de modular a auto-associação do VWF, sua concentração plasmática se correlaciona inversamente com o nível de VWF hiperadesivo em pacientes com TTP e sepse. Esses achados sugerem que a interferência com a auto-associação do VWF poderia ser uma nova abordagem para tratar distúrbios trombóticos associados ao VWF hiperadhesivo, incluindo TTP.
A metaloprotease de limpeza do VWF é o 13º membro de uma família de 18 enzimas distintas do tipo ADAMTS identificadas até o momento que compartilham semelhanças estruturais.16,17 O ADAMTS13 é composto por um domínio de metaloprotease tipo N-terminal reprolisina (M), seguido por um domínio de desintegração (D), um domínio tipo trombospondina-1 (T), um domínio rico em cistina (C) que contém uma sequência de argininina-glicina-asparatona, um domínio espaçador (S), sete domínios adicionais do tipo trombospondina-1 (T2-8) e dois domínios do tipo CUB não idênticos (CUB1-2) na extremidade terminal C da molécula (Fig. 24.2). Os domínios CUB contêm sequências de peptídeos semelhantes aos subcomponentes complementares C1r/C1s, proteína de ouriço-do-mar embrionária egf e proteína morfogênica óssea-1,70 ADAMTS13 é uma glicoproteína Zn2+- e Ca2+, cujo gene reside no cromossomo 9q34 e é produzido predominantemente nas células estreladas do fígado.71,72 O ADAMTS13 é inibido por EDTA; portanto, ensaios funcionais da enzima são melhor realizados em plasma citrato.12,14-17,73-77 A anticoagulação do plasma com heparina, clorometilcetonas (por exemplo, fenilalanina-prolina-aspartato de clorometilcetona ), hirudina e outros inibidores diretos de trombina (DTIs) também seriam satisfatórios para os testes. O soro adequadamente tratado com inibidores de protease também é adequado para testes.78
A clivagem do VWF por ADAMTS13 depende de mudanças conformacionais no VWF provocadas por tensão de cisalhamento, uma força que muda a conformação dos multímeros VWF de globular para aberto.79 Esta transição conformacional é seguida pelo desdobramento de um ou mais domínios A2 dentro do multímero VWF, expondo a ligação do peptídeo Tyr1605-Met1606 à clivagem por ADAMTS1379 ou a oxidação do Met1606 por hipoclorito.54 Além da força de corte, a transição para a conformação acessível também é facilitada por alterações na estrutura do domínio A2 causadas pela fixação de carboidratos,80 substituições de aminoácidos no VWD tipo 2A que desestabilizam a dobra do domínio A2,81 e mutações no VWD tipo 2B82 e a ligação de ristocetina,83 ambas expondo simultaneamente o domínio A1 para ligação de plaquetas e o sítio de clivagem ADAMTS13.
O reconhecimento e clivagem do VWF pelo ADAMTS13 foi estudado extensivamente. Evidências recentes mostram que na molécula nativa ADAMTS13, os domínios C-terminal T8-CUB estão em contato com os domínios N-terminal MDTCS, uma interação intramolecular que inibe parcialmente a capacidade dos domínios MDTCS de ligar e clivar o substrato do peptídeo VWF-78. Nesta conformação nativa, o ADAMTS13 é parcialmente auto-inibido.84,85 A capacidade do ADAMTS13 de se dobrar nesta conformação é aparentemente facilitada pela flexibilidade conferida por quatro supostas seqüências de linker localizadas entre os domínios T1 e T2, T2 e T3, T4 e T5, e T8 e CUB1.86 A auto-inibição é aliviada quando os domínios terminais C são truncados ou ligados por anticorpos ou VWF multiméricos, permitindo o acoplamento dos domínios MDTCS com o substrato.
Baseado em análises de mutação, estudos de ligação, análises cinéticas e uso de substratos peptídeos sintéticos, múltiplos locais de interação entre o domínio ADAMTS13 conformativamente ativo e o domínio VWF A2 desdobrado foram identificados e resumidos em um modelo de zíper molecular,87 conforme esquematizado na Fig. 24.3. Com a exposição de VWF multiméricos a um nível crítico de tensão de corte, um exosite no domínio A2 é exposto primeiro. Este exosito abrange a região helicoidal Glu1660-Arg1668 que é 65 aminoácidos C-terminal ao sítio de clivagem e se liga ao domínio espaçador do ADAMTS13 com alta afinidade (KD ~ 10 nM).88-90 O cisalhamento também expõe um segundo exosito de baixa afinidade no domínio A2 no Asp1614 (P9′ site), que interage com Arg349 no domínio de desintegração do ADAMTS13.91 A interação destes dois exositos com regiões complementares no ADAMTS13 posiciona o sítio de clivagem Tyr1605-Met1606 em VWF com o centro ativo no domínio metaloprotease do ADAMTS13. Isto envolve interação de Leu1603 (site P3) no VWF com Leu198, Leu232, e L272 (site S3) no ADAMTS13, Tyr1605 (site P1) no VWF com Leu151, e Val195 (site S1) no ADAMTS13, e Met1606 (site P1′) no VWF com Asp252-Pro256 (site S1′) no ADAMTS13.92 A exibição do Phage e a análise de mutação aleatória confirmam e mostram que os aminoácidos na região P3-P2′ e P11′ (Ile1616) também são importantes para a clivagem.93 Assim, a interação seqüencial dessas regiões complementares nas duas proteínas multidomínio facilita a clivagem específica da ligação cindível.
A falha em degradar os multímeros ULVWF há muito tempo é suspeita de causar tipos familiares e idiopáticos adquiridos de TTP, ou de predispor um indivíduo a esses distúrbios (Fig. 24.4).11,94 Experimentos críticos realizados para verificar esse conceito foram relatados em 1997 e 1998. Quatro pacientes com TTP crônica recidivante mostraram deficiência na atividade plasmática ADAMTS13.12 Como não foi detectado nenhum inibidor da enzima, essa deficiência foi atribuída a uma anormalidade na produção, sobrevivência ou função da protease. Durante o ano seguinte, a patogênese do tipo de TTP idiopático adquirido mais comum foi elucidada.13-15 Os pacientes com TTP idiopático adquirido tiveram pouca ou nenhuma atividade plasmática ADAMTS13 durante episódios agudos, mas esta atividade aumentou em direção ao normal na recuperação. Embora os ensaios plasmáticos nestes estudos não fossem fisiológicos, foram, no entanto, inovadores e informativos. Autoanticorpos de imunoglobulina (Ig) G contra a enzima provavelmente foram responsáveis pela falta de atividade protease na maioria dos pacientes com TTP idiopático adquirido.13-15 As razões para esta desregulação imunológica transitória, bem como para o direcionamento antigênico seletivo da protease de retirada do VWF, ainda não são conhecidas.
Pacientes com TTP crônico familiar recidivante freqüentemente têm multímeros ULVWF em seu plasma.11,94 Os multímeros ULVWF são detectados usando um método sensível de eletroforese em gel de agarose em algumas amostras de plasma de pacientes durante episódios agudos de TTP idiopático adquirido, mas não após a recuperação.94 Esses achados foram explicados por investigadores que descobriram uma ausência crônica do plasma de ADAMTS13 em TTP crônico familiar recidivante, bem como inibição transitória da enzima durante episódios agudos de TTP idiopático adquirido.12-15
A maioria dos pacientes com TTP familiar tem menos de 5% da atividade normal de ADAMTS13 em seu plasma, independentemente de o plasma ser obtido durante ou após episódios agudos (desde que não tenham recebido infusões de plasma recentemente). A maioria dos pacientes com TTP idiopático adquirido tem menos de 5% da atividade normal do ADAMTS13 em seu plasma somente durante os episódios agudos de TTP.1215,24,95 A deficiência grave de atividade ADAMTS13 no plasma de pacientes com TTP correlaciona-se com a falha em fender os multímeros ULVWF ao surgirem das superfícies das células endoteliais (ver Fig. 24.4).59 Como conseqüência, os multímeros ULVWF secretados pelas células endoteliais permanecem ancorados a essas células e se auto-associam em longas cordas59 e são capazes de capturar plaquetas passantes através da ligação de plaquetas GPIbα (Fig. 24,5).68 (As plaquetas não se ligam espontaneamente às formas menores de VWF que circulam após a clivagem dos multímeros ULVWF.)56 Plaquetas adicionais unem-se posteriormente ao agregado plaquetário em crescimento (recrutado para o agregado através do activado αIIbβ3), que pode crescer até ao ponto de ocluir o vaso (ver Fig. 24.4).59,96 Embora a maioria dos casos de TTP idiopático apresente grave deficiência de ADAMTS13 , um subconjunto não é severamente deficiente na atividade enzimática medida pelos ensaios atualmente disponíveis.97 Ainda não está claro se isso se deve a interferência na atividade enzimática de anticorpos não detectados pelos ensaios disponíveis, resistência do VWF à clivagem (por exemplo, devido à modificação oxidativa),53 ou a outras causas. No entanto, é provável que muitos doentes nesta categoria ainda beneficiem da terapia de troca de plasma.98 Também deve ser enfatizado que a deficiência de ADAMTS13 não é nem sensível nem específica (a actividade de ADAMTS13 é diminuída em muitas outras doenças)99 para fazer o diagnóstico de TTP adquirido.
As cordas de ADAMTS13 são capazes de se destacar das células endoteliais na ausência de actividade de ADAMTS13, sendo mecanicamente cortadas com a tensão crescente gerada pela tensão de cisalhamento do fluido à medida que as plaquetas aderem e se agregam.59 As cordas destacadas das placas ULVWF podem ocluir microvasos a jusante, contribuindo para a isquemia dos órgãos.
Atividade do ADAMTS13 é quase sempre ausente ou severamente reduzida em pacientes com TTP familiar,12,100,101 como conseqüência de mutações homozigotos ou heterozigotos compostos do gene ADAMTS13.18,24,95,102,103 Mutações no TTP familiar foram detectadas ao longo do gene em regiões que codificam diferentes domínios (ver Fig. 24.2). Com grave deficiência congênita de atividade ADAMTS13 , episódios de TTP geralmente começam durante a infância ou infância. Em alguns pacientes, porém, os episódios evidentes de TTP não se desenvolvem durante anos (por exemplo, durante uma primeira gravidez)102 , se é que alguma vez se desenvolveram. Esta última observação sugere que, em alguns pacientes, a atividade residual do ADAMTS13 permanece, e episódios agudos de TTP são desencadeados quando a liberação do ULVWF das células endoteliais excede a capacidade limitada do seu ADAMTS13 para processá-los. Um exemplo em que isto pode acontecer com regularidade é durante a gravidez: Sabe-se que os níveis de VWF aumentam durante a gestação.104-106 Consistente com esta noção, as mulheres com TTP congênita são frequentemente diagnosticadas durante suas primeiras gravidezes.29 Em bebês com início neonatal de TTP congênita e menos de 5% de atividade ADAMTS13 , a insuficiência renal transitória ou progressiva é freqüentemente um componente proeminente do distúrbio.107 Estes pacientes assemelham-se clinicamente a dois pacientes descritos em 1960 por Schulman e colegas108 e em 1978 por Upshaw109; consequentemente, este subgrupo pediátrico é às vezes referido como tendo “síndrome de Upshaw-Schulman”
Em muitos pacientes com TTP adquirido, a atividade plasmática ADAMTS13 ou está ausente ou severamente reduzida durante episódios agudos, e aumenta à medida que eles se recuperam, seja de episódios únicos ou recorrentes.13-15 Autoanticorpos IgG que inibem a atividade plasmática do ADAMTS13 podem ser detectados em 44% a 94% desses pacientes.13-15.102.110.111 Esses resultados sugerem a presença de um defeito transitório ou intermitentemente recorrente na regulação imunológica em muitos pacientes que adquiriram TTP idiopático associado à deficiência de ADAMTS13. Também foram identificados anticorpos que inibem o ADAMTS13 plasmático em alguns pacientes com TTP associado a ticlopidina ou clopidogrel.34,112 Ainda não se sabe se um defeito grave transitório na produção ou sobrevivência do ADAMTS13 ocorre em pacientes com TTP adquirido que não possuem autoanticorpos detectáveis contra a enzima. Alternativamente, a falha na detecção de auto-anticorpos inibitórios em alguns pacientes pode refletir a sensibilidade limitada dos sistemas de teste atualmente em uso. Autoanticorpos não inibitórios que poderiam ligar e potencialmente mediar a depuração imunológica do ADAMTS13 não são detectados pelo sistema teste atual.
Um estudo avaliou epitopos ADAMTS13 reconhecidos por autoanticorpos policlonais em 25 pacientes com TTP adquirido,113 descobrindo que os alvos dos anticorpos incluíam invariavelmente a sequência rica em cisteína/domínio espaçador (CS); em 3 pacientes esta foi a única região visada pelos anticorpos. Os outros 22 auto-anticorpos reagiram com a sequência de domínio CS mais os domínios CUB (64%), a sequência de domínio tipo metaloprotease/desintegração/primeiro domínio tipo trombospondina-1 (MDT) (56%), ou a região contendo as repetições tipo segundo a oitavo trombospondina-1 (T2-8, 28%) (ver Fig. 24.2). A região do propéptido também foi identificada por 20% dos autoanticorpos,113 indicando que a remoção do propéptido não é necessária para a secreção da enzima ativa.114 Autoanticorpos inibem a atividade do ADAMTS13 ou diminuem sua sobrevivência. Em outro estudo de sete pacientes, Luken et al.115 identificaram auto-anticorpos ADAMTS13 em seis pacientes que se ligaram exclusivamente dentro do domínio S; no sétimo paciente, os anticorpos ligados tanto ao domínio S quanto ao T2-8 se repetem. Por mutagênese, estes investigadores determinaram que as regiões Thr572-Asn579 e Val657-Gly666 no domínio espaçador do ADAMTS13 foram os epítopos comuns para a ligação de autoanticorpos.116 Quando Arg660, Tyr661 ou Tyr665 foi substituído por alanina, a ligação dos autoanticorpos dos seis pacientes com TTP foi eliminada.117
Autoanticorpos para ADAMTS13 em pacientes com TTP adquirido pertencem predominantemente à classe IgG,118 embora IgM e anticorpos da classe IgA também tenham sido detectados.119 A clonagem e sequenciamento dos anticorpos monoclonais de pacientes com TTP adquirido mostram que há uma incorporação preferencial do segmento de genes de cadeia pesada VH1-69 na região variável das imunoglobulinas.120,121 Essa preferência sugere que a região CDR2 ou CDR3 do VH1-69 pode contribuir para a especificidade de um epitópo no domínio espaçador do ADAMTS13. Em uma análise da distribuição dos subtipos de anticorpos em 58 pacientes com TTP adquirido agudo, foram detectados anticorpos pertencentes a todos os subtipos IgG.118 IgG4 foi o subtipo mais prevalente, estando presente em 90% dos pacientes, seja sozinho ou em combinação com outros subtipos IgG.
Produção de auto-anticorpos ADAMTS13 é quase certamente influenciada geneticamente. Este fato é enfatizado pela descoberta em irmãs gêmeas de TTP adquirido causado por auto-anticorpos ADAMTS13.122 Relapsos ocorrem em 23% a 44% dos pacientes com TTP adquirido,102,110,123,124 frequentemente durante o primeiro ano após o episódio inicial.102 Relapso é mais comum entre os pacientes com os níveis mais baixos de atividade ADAMTS13 (<10%).
A gravidez e o período pós-parto apresentam um desafio especial com relação ao TTP. Primeiro, a pré-eclâmpsia e a síndrome HELLP (hemólise, enzimas hepáticas elevadas, plaquetas baixas) têm muitas características clínicas que se sobrepõem ao TTP e podem partilhar certas características fisiopatológicas, tais como disfunção endotelial sistémica e proteinúria (ver Capítulo 32).125 A síndrome HELLP pode ser especialmente difícil de distinguir da TTP na medida em que também manifesta anemia hemolítica microangiopática, níveis elevados de LDH, e trombocitopenia (embora normalmente não tão grave como na TTP).126 A TTP na gravidez pode estar associada a autoanticorpos contra ADAMTS13, e a doença geralmente manifesta-se a curto prazo ou pós-parto.127 As estimativas do risco de recorrência durante as gravidezes subsequentes variam amplamente, variando de 26% a 73% por gravidez.102
Atividade do ADAMTS13 em adultos saudáveis varia de aproximadamente 50% a 178% do plasma comum normal usando ensaios estáticos atualmente disponíveis. Redução da atividade do ADAMTS13 também foi encontrada em doenças hepáticas, doenças malignas disseminadas,128 síndromes inflamatórias sistêmicas como as causadas por endotoxina,129 pancreatite aguda,130 sepse grave e choque séptico,131 DIC induzido por sepse,132 e disfunção orgânica induzida por sepse.133-135 Além disso, níveis baixos de ADAMTS13 podem ser encontrados na gravidez e em recém-nascidos.136 Com excepção das mulheres periparto que desenvolvem TTP,102,110 a actividade ADAMTS13 observada em doentes com estas condições não é reduzida aos valores extremamente baixos (<5% do normal) encontrados na maioria dos doentes com TTP familiar ou adquirido.
ADAMTS13 Os ensaios
ADAMTS13 determinam a actividade proteolítica, o nível de antigénio e o nível de autoanticorpos anti-ADAMTS13. Os ensaios iniciais de actividade ADAMTS13 foram baseados na degradação de Multímeros VWF purificados na presença de agentes desnaturantes e quantificação dos produtos de clivagem por immunoblotting,74,75 ligação de colagénio residual,137 ou agregação plaquetária induzida por ristocetina reduzida.138 Embora estes ensaios sejam sensíveis, são trabalhosos e demorados e envolvem o uso de desnaturantes. Esses ensaios foram suplantados após estudos dos fragmentos recombinantes de VWF revelarem seqüências mínimas necessárias para as medidas de atividade. Kokame e colegas realizaram deleções parciais do domínio VWF A2 e identificaram um peptídeo mínimo de 73 aminoácidos (VWF73, Asp1596-Arg1668) que foi clivado eficientemente pelo ADAMTS13 na ausência de desnaturantes sob condições estáticas.88 Posteriormente, foram desenvolvidos vários ensaios baseados na clivagem de peptídeos abrangendo o VWF73, como a transferência de energia por ressonância fluorescente (FRET),97 um VWF78,139 ELISA,140 immunoblotting,141 e espectrometria de massa142.
Em 2008, um segundo estudo colaborativo internacional foi realizado para comparar o desempenho de oito ensaios funcionais e três de antígenos para ADAMTS13.143 A comparação desses métodos mostrou que ensaios de clivagem baseados em peptídeos VWF modificados como substratos ofereciam alta precisão e reprodutibilidade e baixa variância e variabilidade entre métodos. O ensaio FRET-VWF73 tem sido amplamente utilizado desde então para quantificar a atividade do ADAMTS13 em amostras de pacientes. Embora fácil de realizar, o ensaio baseado no FRET tem várias limitações. Primeiro, a clivagem do FRET-VWF73 usando plasma citrato como fonte de ADAMTS13 deve ser realizada abaixo de 33°C como inativação irreversível significativa do ADAMTS13 por quelação de cálcio mediada por citrato, que ocorre a 37°C. Em segundo lugar, a detecção óptima do sinal de fluorescência requer a realização da clivagem do substrato FRET-VWF73 a pH 6,1, o que reduz a taxa de clivagem. Terceiro, neste pH subótimo, alguns autoanticorpos inibidores não formam complexos estáveis com ADAMTS13, e estes anticorpos permanecem indetectados em estudos de inibição. Quarto, ocorre interferência significativa do sinal de fluorescência pela hemoglobina e bilirrubina, devido à sobreposição espectral. Foi desenvolvido um substrato melhorado de peptídeo baseado em FRETS-rVWF71. A atividade do ADAMTS13 em soro e plasma citrato ou heparinizado pode ser medida com este substrato melhorado em pH fisiológico, força iônica e concentração de cálcio, sem interferência dos multímeros VWF endógenos, ou bilirrubina ou hemoglobina no plasma.78 Outra limitação destes ensaios de atividade baseados em peptídeos é que a capacidade do ADAMTS13 de clivar VWF multímeros sob tensão de cisalhamento não é avaliada. Embora a tensão de cisalhamento produzida pelo vórtice constante tenha demonstrado promover a clivagem dos VWF multímeros,144 a quantificação dos produtos de clivagem por immunoblotting continua sendo demorada. Pelo menos quatro kits comerciais estão disponíveis para medições de atividade ADAMTS13 com base nos métodos relatados. Entretanto, esses kits não foram avaliados em estudos de comparação direta e padronização.
ADAMTS13 foram quantificados por anticorpos monoclonais e policlonais.145,146 A influência da truncagem, mutações e autoanticorpos na precisão e sensibilidade desses testes não é clara. Cinco kits de testes comerciais estão disponíveis para medir os níveis de antígenos ADAMTS13, mas nenhuma validação e comparação com outros ensaios foi realizada.
Em 2015, o primeiro padrão internacional para o ADAMTS13 foi estabelecido e testado em 32 laboratórios de 14 países para a atividade do ADAMTS13 e níveis de antígenos contra os padrões locais.147 Este padrão plasmático, designado WHO IS (12/252), foi derivado de plasma pool de 38 doadores normais saudáveis. Este estudo mostrou um valor médio consensual de 0,91 unidades/mL de atividade ADAMTS13 para este plasma com variabilidade interlaboratorial de 12,4%, e 0,92 unidades/mL de antígeno ADAMTS13 com variabilidade interlaboratorial de 16,3%. A grande variabilidade interlaboratorial não se deve principalmente ao uso de diferentes padrões locais, mas a diferenças metodológicas entre laboratórios.
Os ensaios de autoanticorpos anti-ADAMTS13 são tipicamente realizados misturando plasma de pacientes ativados por calor com uma quantidade conhecida de plasma normal agrupado e medindo a atividade residual do ADAMTS13. Os anticorpos não neutralizantes são detectados por immunoblotting.148
Embora não tenha sido identificado até agora nenhum inibidor específico do ADAMTS13, várias proteínas e peptídeos podem inibir a clivagem do ADAMTS13 sob condições especiais. Estas incluem hemoglobina, IL-6, trombospondina-1 e neutrofílica α-defensinas. Em todos os casos, os agentes inibidores aparentemente ligam o substrato, VWF, impedindo que o VWF seja clivado por ADAMTS13. Foi demonstrado que a hemoglobina age dessa forma, ligando as cordas do VWF na superfície endotelial sob fluxo e bloqueando a clivagem competitiva pelo ADAMTS13.149 Esse mecanismo pode contribuir para as complicações vaso-oclusivas em pacientes com doença falciforme com hemólise significativa e complicar ainda mais o TTP quando as taxas hemolíticas são altas. Altas concentrações de IL-6 (50 e 100 ng/mL) também inibem a clivagem mediada pelo ADAMTS13 das cordas endoteliais ULVWF sob fluxo in vitro,50 sugerindo que este mecanismo pode contribuir para trombose durante a tempestade de citocinas150 ou a síndrome de liberação de citocinas.151 Thrombospondin-1, uma proteína abundante no α-grânulos de plaquetas que é liberada na circulação por ativação plaquetária, liga as regiões A2-A3 do VWF, bloqueando competitivamente e inibindo a clivagem por ADAMTS13 in vitro.152 Esta propriedade protrombótica da trombospondina-1 é consistente com o recrutamento defeituoso de plaquetas para o endotélio ativado ou lesionado e a embolização aumentada de trombos plaquetários observada em ratos que eliminam trombospondina-1.153 Os peptídeos neutrófilos humanos conhecidos como α-defensins, liberados de neutrófilos ativados, podem ligar o domínio VWF A2 e bloquear competitivamente a clivagem mediada por ADAMTS13.154 As concentrações de α-defensins aumentam até sete vezes no plasma de pacientes com TTP adquirido.