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Sumário

Fundo: Para avaliar a incidência, as consequências e a estratégia de prevenção de aloimunizações anti-D de portadores da variante D na população obstétrica do condado de Split-Dalmatia, Croácia. Métodos: Os eventos de imunização RhD foram avaliados retrospectivamente para o período entre 1993 e 2012. As mulheres foram testadas para antigénios RhD e anticorpos irregulares. Aqueles com anticorpos anti-D que não eram serologicamente D- foram genotipados para RhD. Elas foram avaliadas pelo seu histórico obstétrico e transfusional e pelo seu título de anti-D. Os neonatos foram avaliados pelo estado de RhD, teste direto de antiglobulina (DAT), níveis de hemoglobina e bilirrubina, terapia transfusional, assim como fototerapia e resultado. Resultados: Dos 104.884 nascidos vivos, 102.982 mulheres foram testadas para o antígeno RhD. A imunização anti-D ocorreu em 184 mulheres, o que corresponde a 0,9% dos indivíduos em risco de formação de anti-D. 181 casos ocorreram em mulheres sorologicamente tipadas como D-. Três mulheres foram portadoras de D parcial (DVa n = 2, DNB n = 1), inicialmente tipadas RhD+, e reconhecidas como portadoras da variante D após a imunização ter ocorrido. O título anti-D variou de 1:1 a 1:16. Seis crianças eram RhD+, quatro tinham DAT positivo, e duas foram submetidas a fototerapia. Conclusão: A imunização anti-D ocorreu em grávidas portadoras da variante D (DVa, DNB). As crianças RhD+ tinham marcadores serológicos de doença hemolítica do feto e recém-nascido (HDFN), sem casos de HDFN grave.

© 2016 S. Karger GmbH, Freiburg

Introdução

O antígeno RhD é um antígeno altamente imunogênico significativo para a medicina obstétrica devido à capacidade do anti-D de causar doença hemolítica do feto e recém-nascido (HDFN) . Além do D+ normal , o antígeno D pode ser apresentado em mais de 200 variantes atualmente conhecidas como variantes D . A expressão reduzida do antígeno D é tradicionalmente referida como “D fraco”, enquanto “D parcial” representa variantes em que as mutações e rearranjos genéticos resultam na alteração da sequência proteica sem certos polipéptidos na superfície externa das hemácias, embora tenha sido provado que a distinção entre D fraco e parcial é fluida e que os tipos D fraco possuem antígenos D ligeiramente a consideravelmente alterados. A maioria das variantes fracas de D em caucasianos incluem D fracos tipo 1, tipo 2 e tipo 3, que não são conhecidos por formarem alloanti-D . Em contrapartida, os portadores de D parcial são propensos à formação de anti-D. A categoria DVI é a D parcial mais clinicamente relevante entre os caucasianos, sendo a variante D a mais comumente relatada como estando envolvida na imunização anti-D, bem como HDFN . O HDFN em bebês de mães com D parcial com anti-D foi documentado, mas na maioria dos casos foi leve, com raras exceções .

O baixo risco de imunização com RhD em mulheres com D tipos 1, 2 e 3 fracos é a razão pela qual a maioria dos autores sustenta que mulheres com tipos D fracos prevalentes não requerem imunoprofilaxia com RhD , e pacientes com D fracos poderiam receber com segurança unidades D+ de hemácias. Por outro lado, mulheres com D parcial devem ser classificadas como D- considerando seu manejo pré-natal e imunoprofilaxia de RhD . Na Europa, os reagentes anti-D são selecionados para digitar deliberadamente as portadoras de DVI grávidas como D- para garantir que tais mães receberiam imunoprofilaxia RhD em seu segundo trimestre e/ou pós-parto. A distribuição das variantes D varia entre diferentes populações, e seu reconhecimento depende da escolha dos reagentes de tipagem D usados .

Avaliamos retrospectivamente os casos de aloimunização RhD e antígeno RhD em gestantes por um período de 20 anos. Para mulheres que não foram serologicamente D-, analisamos a causa da imunização (transfusão ou gravidez), sua reatividade sorológica e o genótipo RHD. Também determinamos se houve casos de HDFN entre as crianças de mães da variante D da RhD-alloimunizada. O objetivo do estudo foi avaliar a incidência e as conseqüências das aloimunizações anti-D de portadores da variante D na população obstétrica do condado de Split-Dalmatia.

Material e Métodos

O presente estudo foi realizado no Departamento de Medicina Transfusional do Centro Hospitalar Universitário de Split-Dalmatia, no condado de Split-Dalmatia, Croácia. O Município de Split-Dalmatia tem aproximadamente 5.000 nascimentos em um ano. O Hospital é uma instituição regional responsável pelos cuidados gerais de gravidez, monitoramento de mulheres com hemoglobina globalizada e o tratamento de partos. Todas as gestantes dessa região foram tipadas para antígenos ABO e RhD e testadas para anticorpos irregulares em sua visita inicial. Em cada visita subseqüente, foi realizado apenas o controle indireto do teste de antiglobulina (IAT). A imunoprofilaxia RhD é administrada rotineiramente às mulheres RhD após o parto da criança RhD+. Mulheres variantes D foram tratadas como RhD- se a terapia transfusional fosse necessária, mas não receberam imunoprofilaxia para RhD. Se a genotipagem de RhD revelou antígeno D parcial, a imunoprofilaxia foi administrada após o nascimento da criança RhD+.

Gravidez com Variante D e Anti-D

Avaliamos retrospectivamente os eventos de imunização de RhD na população obstétrica no período de 1 de janeiro de 1993 a 31 de dezembro de 2012. No município de Split-Dalmatia, 104.884 nascidos vivos foram registrados entre 1 de janeiro de 1993 e 31 de dezembro de 2012. Durante esse período, 102.982 gestações foram testadas para antígenos ABO e RhD e para anticorpos irregulares em nosso departamento (98% de cobertura de triagem, o que está em concordância com um estudo anterior sobre nossa população obstétrica). O número de testes de tipagem RhD e o número de variantes D sorologicamente reconhecidas foram coletados do protocolo escrito manualmente para testes de pacientes obstétricas para o período entre 1993 e 2001, e da base de dados computadorizada para o período entre 2002 e 2012.

Neste período, usamos formulários de rastreamento de imunização para o acompanhamento de gestações com aloanticorpos anti-D, que foram preenchidos após a detecção de aloanticorpos clinicamente relevantes. A partir destes formulários analisamos o número total de mulheres grávidas com imunização RhD, com análise detalhada de mulheres imunizadas com RhD que não eram serologicamente RhD-. Para essas mulheres analisamos eventos de imunização que poderiam causar imunização contra RhD, gravidezes anteriores, transfusões anteriores e administração de imunoprofilaxia RhD pós-parto; além disso, analisamos o genótipo RHD de mulheres variantes D. Durante a gravidez, o título de anticorpos anti-D foi medido em intervalos de 2-4 semanas, e os resultados de cada medida foram registrados em formulários de rastreamento de imunização. As fichas também continham dados sobre o estado de RhD dos bebés e o teste directo de antiglobulina (DAT).

Dados sobre crianças RhD+ de mulheres variante D com anticorpos anti-D foram coletados a partir da história dos pacientes no Departamento de Pediatria e Neonatologia. As informações coletadas incluíram dados sobre HDFN, hemoglobina neonatal e níveis de bilirrubina, terapia transfusional neonatal e fototerapia e outros resultados neonatais.

Tipagem serológica do antígeno RhD

No período de 1 de janeiro de 1993 a 10 de abril de 2008, a tipagem de rotina RhD foi realizada usando aglutinação direta em testes tubulares com dois dos seguintes reagentes monoclonais: Anti-D M MonoGnost® (MS-201; BioGnost, Zagreb, Croácia); NovaClone® Anti-D IgM+IgG Monoclonal Blend (CI 175-2, D415, 1E4, Immucor Gamma, Dartmouth, NS, Canadá); Anti-D MG MonoGnost® (RUM-1 IgM, MS-26 IgG, BioGnost).

Se o antígeno RhD foi digitado negativo em aglutinação direta, foi digitado em IAT. O antígeno RhD foi tipado negativo na aglutinação direta, mas positivo no IAT, foi classificado como ‘variante D’. O teste do antígeno RhD na IAT pelo método de coluna foi realizado usando a mistura monoclonal-policlonal humana Anti-D BioClone® (Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, NJ, EUA).

De 10 de Abril de 2008 a 31 de Dezembro de 2012, a tipagem RhD em aglutinação directa foi realizada por tecnologia de microcoluna automatizada utilizando a cassete de agrupamento ABO-DD (Ortho Clinical Diagnostics) que contém dois reagentes monoclonais IgM anti-D (clone D7B8, e clone RUM-1). O teste do antigénio RhD no IAT foi omitido após ter introduzido a tecnologia de microcoluna. Os casos com resultados sorológicos discrepantes foram enviados para análise molecular RHD, e a imunoprofilaxia foi implementada para mulheres que foram encontradas como portadoras de D parcial.

RHD Genotyping

Exploração do ADN de amostras de sangue EDTA foi feita manualmente pelo QIAamp DNA Blood Mini kit® (Qiaqen, Hilden, Alemanha) ou pelo Qiacube analyser® (Qiaqen). A tipagem molecular das variantes D foi realizada pelos kits PCR-SSP (Ready GeneWeak D® e Ready GeneCDE®; Inno-Train, Kronberg im Taunus, Alemanha), de acordo com as instruções do fabricante.

Resultados

No período observado de 102.982 gestações testadas para antigénios ABO e RhD e anticorpos irregulares, houve 184 mulheres grávidas afectadas pela aloimunização RhD em 20.050 mulheres que eram variantes RhD- ou D. Isso representa 0,9% das mulheres grávidas em risco de aloimunização por RhD. Dessas, 181 mulheres foram serologicamente tipadas RhD-, e 3 imunizações (1,63% das imunizações anti-D) ocorreram em mulheres portadoras de variantes RhD. A genotipagem RHD definiu que 2 de 3 mulheres eram portadoras de D tipo parcial Va, enquanto 1 mulher era portadora de DNB tipo D parcial (fig. 1). Todas as 3 mulheres foram rotuladas como RhD+ na sua tipagem sorológica inicial de antigénio RhD, devido à escolha dos reagentes que foram utilizados na altura (Anti-D M MonoGnost, NovaClone Anti-D IgM+IgG Monoclonal Blend. Portanto, 2 de cada 3 receberam hemácias RhD+, e nenhuma delas recebeu imunoprofilaxia antenatal ou pós-natal anti-D. As características da mulher D parcial com imunização anti-D são mostradas na tabela 1. Uma delas (DVa) foi imunizada exclusivamente devido à gravidez, enquanto para outras 2 mulheres (DVa e DNB) a imunização foi provavelmente a consequência de ter sido transfundida com hemácias RhD+ (tabela 1).

Durante o período de estudo, 484 mulheres foram tipadas como variante D (Du) usando apenas métodos de tipagem sorológica. Essas mulheres não receberam imunoprofilaxia, mas receberam unidades D- RBC em casos de transfusão (fig. 1). Não houve casos de formação de anti-D entre elas.

Tabela 2 mostra dados sobre o título de anti-D das mães imunizadas, bem como dados sobre seus filhos afetados, incluindo a TDT neonatal, hemoglobina, bilirrubina, fototerapia e terapia transfusional.

A mulher variante DNB foi imunizada durante a investigação do teste DAT positivo do recém-nascido. Como a mulher era a cidadã da Bósnia-Herzegovina e tinha chegado à Croácia pouco antes do parto, não havia dados disponíveis de seus testes de imuno-hematologia anteriores. Entretanto, usando informações sobre seu histórico de saúde, descobrimos que ela tinha recebido hemácias A+ após o parto do bebê anterior. O recém-nascido precisou apenas de fototerapia. A gravidez subsequente resultou no nascimento de uma criança cujo teste DAT foi fortemente positivo e o bebê precisou de uma transfusão de sangue no seu 8º dia de vida. Entretanto, a transfusão não foi atribuída à hemólise, mas à cirurgia devido à hérnia encarcerada.

A segunda mulher (parcial D tipo Va) foi aloimunizada em sua rotina repetida de triagem para anticorpos irregulares na 34ª semana de sua segunda gravidez. O histórico transfusional dela foi negativo. Embora ela estivesse carregando uma criança RhD+, seu título anti-D permaneceu muito baixo durante toda a gravidez. O DAT do recém-nascido após o parto foi negativo, e os níveis de bilirrubina e hemoglobina estavam dentro das faixas de referência. Entretanto, sua segunda criança RhD+ tinha níveis patologicamente altos de bilirrubina e requeria fototerapia.

A terceira mulher (parcial D tipo Va) foi encontrada aloimunizada no grupo sanguíneo de rotina e triagem na segunda gravidez, sua primeira gravidez foi sem intercorrências, mas seguida por transfusão de duas unidades de hemácias A+ RhD+. Apesar de duas das quatro gestações subsequentes terem resultado no nascimento de crianças RhD+ com 1+ positivo e que ela teve o maior título anti-D das três mulheres, não foram detectados níveis patologicamente altos de bilirrubina, icterícia visível ou anemia em nenhuma das crianças, os períodos pós-natais foram sem intercorrências e elas tiveram alta do hospital sem complicações. No total, as mulheres com variantes D parciais e imunização anti-D tiveram seis gestações envolvendo crianças RhD+. Dois bebês precisaram de fototerapia, mas não houve casos de HDFN grave.

Discussão

Este estudo analisa as imunizações contra RhD em gestantes portadoras de variantes D, no município de Split-Dalmatia. Encontramos 184 mulheres grávidas com anticorpos anti-D, o que representa 0,9% dos indivíduos em risco de formação de anti-D. Isto está em concordância com um trabalho recente sobre a nossa população obstétrica com anti-D . Uma percentagem tão elevada é atribuída ao facto de a profilaxia pré-natal não ser implementada no nosso país, e a necessidade de se tornar uma prática padrão já foi sublinhada. 181 mulheres alloimunizadas foram serologicamente tipadas como RhD-. Três pessoas aloimunizadas inicialmente datilografadas como RhD+ eram portadoras de D parcial. Não houve casos de formação anti-D entre mulheres grávidas que foram inicialmente reconhecidas como variante D e que receberam o estatuto de ‘Du’.

Nas diretrizes de alguns países para prevenção de aloimunização anti-D, afirma-se que mulheres fracas D ou Du não requerem profilaxia, enquanto novas recomendações enfatizam a importância de resolver resultados de tipagem de RhD pouco claros, e tratar todas as variantes D que não sejam D tipos D fracos 1, 2 e 3 como D- .

Até 2008, o teste de antígeno RhD em nosso centro foi baseado apenas na sorologia. Mulheres que utilizaram o método de RhD- usando tubo por aglutinação direta, mas RhD+ em aglutinação indireta receberam a variante D ou Du, e não receberam imunoprofilaxia RhD; entretanto, foram consideradas como RhD- considerando a terapia transfusional. Usando esta abordagem, as gestantes com antígeno D parcial foram classificadas como variante D ou Du. e não receberam imunoprofilaxia; consequentemente, os eventos de imunização devido à gravidez não foram impedidos. Em nosso centro desde 2008, casos com resultados pouco claros de tipagem sorológica RhD foram submetidos à análise molecular RHD, e a imunoprofilaxia foi implementada para mulheres que foram genotipadas como portadoras de D parcial. Outros estudos também apontam a importância da genotipagem de RhD em mulheres grávidas com antígeno da variante D para identificar corretamente portadores de D parcial que precisam ser imunoprofilaxados.

Todas as 3 mulheres aloimunizadas com D parcial em nossa pesquisa não receberam imunoprofilaxia, e 2 delas receberam unidades RhD+ de hemácias, pois não foram inicialmente reconhecidas como portadoras de variantes D, e foram tipadas como RhD+. Apenas 1 evento de imunização em uma mulher D parcial foi ligado inteiramente à gravidez. Para as 2 imunizações RhD restantes, não foi possível determinar se a transfusão ou a gravidez causaram imunização. Isto sugere que o reconhecimento das variantes D durante a tipagem sorológica é essencial para garantir que as portadoras de D parcial grávidas sejam tratadas como RhD – considerando a terapia transfusional e a imunoprofilaxia.

Após a tipagem de RhD na TIA ter sido descartada para gestantes em 2008, aquelas com variante DVI, se presentes em nossa população obstétrica, foram tipadas como RhD- enquanto anteriormente foram designadas como variante D ou Du, uma vez que DVI dá reações positivas na aglutinação indireta com reagente anti-D usado para a tipagem TIA. Ainda assim, não encontramos casos de anti-D em mães com DVI. Apesar de a variante DVI ser mantida para a variante D parcial mais clinicamente relevante entre as caucasianas, as mulheres afetadas em nosso estudo eram das categorias DVa e DNB. Além disso, a pesquisa realizada em doadores de sangue da mesma região geográfica não encontrou portadores de DVI parcial. O DNB é conhecido por ser a variante parcial D mais prevalente nas regiões vizinhas da Europa Central. No nosso caso, a única portadora DNB originou-se de uma região geográfica vizinha da Bósnia e Herzegovina, enquanto ambas as portadoras de DVa originaram-se da área investigada do condado de Split-Dalmatia. Isto implica a necessidade de levar em conta a variabilidade geográfica na prevalência das variantes D ao implementar a tipagem RhD e os padrões de imunoprofilaxia.

Nenhum caso de formação de anti-D em mulheres às quais foi inicialmente atribuído o status RhD+ ou Du foi atribuído aos tipos D fracos quando a genotipagem foi realizada nos casos aloimunizados registrados. Isto era esperado uma vez que as variantes D fraca mais prevalentes na Croácia são as variantes D fraca tipo 3, tipo 1 e tipo 2, enquanto na parte mediterrânica da Croácia, na qual o estudo foi realizado, a mais comum é a D fraca tipo 1, seguida pelas variantes tipo 3 e 2. Ao contrário das descobertas de autores em populações não caucasianas, sendo comuns os tipos D fracos propensos à formação de anti-D, é seguro assumir que os portadores de D fracos em nossa população obstétrica não requerem imunoprofilaxia. No entanto, como em um estudo publicado anteriormente sobre a população croata, o tipo D fraco 4.2, que é conhecido por fazer o anti-D, foi encontrado presente na parte mediterrânea da Croácia, é obrigatório ter cautela. Além disso, em um estudo sobre mulheres grávidas de RhD, realizado por Hyland et al. , foram encontrados portadores da variante D entre mulheres aloimunizadas. Algumas hemácias D parciais não conseguem reagir com anti-D mesmo com IAT . Em nosso estudo, a genotipagem não foi realizada em mulheres aloimunizadas com RhD; portanto, alguns indivíduos da variante D com anti-D podem não ter reagido com nossas técnicas serológicas utilizadas na época.

Similarmente aos achados da maioria dos outros autores, as imunizações anti-D de mulheres com D parcial resultaram principalmente em marcadores serológicos de HDFN, mas sem consequências clínicas graves . É interessante notar que em nosso estudo a mulher com o maior título anti-D das 3 mulheres deu à luz filhos cujo DAT foi de apenas 1+, enquanto os filhos da mulher com menor título foram mais proeminentemente afetados serologicamente, com DAT 4+. Os fatores que envolvem a severidade do HDFN ainda são um tema de pesquisa potencial. Apesar da maioria dos casos de HDFN em mães com D parcial ser leve, também tem sido relatado um resultado fatal .

Embora a formação de anti-D em mulheres sem DRH seja extremamente rara, os eventos de imunização demonstrados confirmam que é relevante identificar corretamente portadores de D parcial, que requerem ser considerados como DRH – considerando a terapia transfusional e a imunoprofilaxia. Pesquisas recentes dos EUA descobriram que a realização de genotipagem de D-R entre mulheres grávidas com fenótipos D serologicamente fracos é uma estratégia neutra em termos de custos, sendo provável que a economia de custos aumente ligeiramente ao longo do tempo. Juntamente com a importância indiscutível da genotipagem de RHD na resolução de resultados discrepantes de tipagem de RhD e no discernimento de variantes D, é necessário salientar a relevância da tipagem sorológica, uma vez que a necessidade de genotipagem não será reconhecida se as variantes D não forem reconhecidas durante a tipagem sorológica inicial e se forem atribuídos RhD+ aos portadores de variantes D. Em nosso estudo, todas as 3 gestantes com anti-D não foram inicialmente reconhecidas como variantes D devido à forte reatividade de suas hemácias com reagentes monoclonais utilizados na época. Podemos concluir que a escolha dos reagentes para a tipagem serológica RhD é crucial para o reconhecimento das variantes D e, consequentemente, para o reconhecimento da necessidade de tipagem molecular RhD.

Finalmente, neste estudo descobrimos que não houve casos de imunização por RhD em mulheres grávidas inicialmente tipadas como variante D, mas as imunizações ocorreram em mulheres que foram tipadas como RhD+. Isto implica a necessidade de mais investigação para fazer a escolha apropriada de reagentes para a tipagem serológica RhD que detectarão as variantes D em risco de aloimunização anti-D em nossa população.

As limitações deste estudo retrospectivo são longo período de rastreamento, mudanças nos métodos e reagentes que foram utilizados durante o período do estudo, assim como o algoritmo de teste. As alterações incluem a omissão da tipagem RhD na TIA após 2008 e a introdução da imunoprofilaxia para mulheres grávidas com antígeno D parcial após 2008, enquanto antes de 2008 a profilaxia não era administrada a mulheres com qualquer variante D. Outra limitação do nosso estudo é o fato de que a genotipagem não foi realizada em mulheres aloimunizadas RhD.

Apesar dessas limitações, acreditamos que é muito importante acompanhar a população obstétrica por um longo período de tempo. Isso nos permitiria avaliar a adequação da estratégia de tipagem sorológica do antígeno RhD e a administração de imunoprofilaxia em mulheres grávidas com variantes D.

Prerrequisitos éticos

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Centro Hospitalar Universitário Split.

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