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Uma breve história de T. reesei

As mais antigas práticas biotecnológicas envolvendo fungos para a produção de cerveja, vinho e queijo podem remontar a vários milénios, ou seja, ao início da própria civilização alfabetizada. Em contraste, a descoberta da ascomycete mesófila filamentosa Trichoderma reesei (então Trichoderma viride) pelo seu espantoso potencial para produzir celulases extracelulares ocorreu há pouco mais de 70 anos. Inicialmente o potencial destrutivo do Trichoderma sp. original isolado do equipamento podre do Exército dos EUA nas Ilhas Salomão durante a Segunda Guerra Mundial foi visto como bastante problemático. No entanto, não demorou muito até que os pesquisadores dos Laboratórios de Pesquisa do Exército de Natick liderados por Mary Mandels e Elwyn T. Reese, a pesquisadora que deu o nome, procurou transformar este potencial problemático em produtos propositadamente. Em uma seleção de 14.000 moldes da coleção Quartermaster Trichoderma sp. QM6a mostrou uma excelente capacidade de degradar a celulose cristalina nativa. A designação “QM6a” para o último Trichoderma isolado original remanescente, que o identificou como a sexta de seis culturas do fungo armazenado na Coleção Quartermaster em Natick, permaneceu. Esta cepa em particular não só é considerada como a cepa de referência de T. reesei, mas também é a única cepa da qual todos os mutantes utilizados na indústria hoje foram derivados.

Então, e agora, a pesquisa sobre T. reesei foi impulsionada pela idéia de que suas celulases segregadas poderiam ter um jogo de mudança de impacto na luta dos 200 anos de idade para produzir economicamente combustíveis a partir de biomassa lignocelulósica renovável. Desde então, a pesquisa sobre o T. reesei foi pioneira no conceito de sacarificação enzimática da celulose através de uma combinação sinérgica de diferentes atividades celulásicas e lançou as bases para o nosso entendimento atual da regulação das enzimas envolvidas. Sua principal celobiohidrolase CBH1 (CEL7a) foi também a primeira celulase eucariótica a ser clonada e a primeira celulase cuja estrutura foi resolvida. Um passo importante para a aplicação industrial de T. reesei cellulases foi o desenvolvimento de procedimentos eficientes de mutagênese de cepa e triagem na década de 1970. Nas duas décadas seguintes, o título da proteína extracelular produzida pela cepa original QM6a pôde ser aumentado em até 20 vezes através de programas de mutagênese na Universidade de Natick e Rutgers. Esta última culminou no isolamento da cepa RUT-C30 (onde “RUT” significa “Rutgers”). Embora o padrão ouro para a produção de celulase na indústria tenha sido relatado como sendo superior a 100 g/L, esta cepa ainda é o protótipo do hiperprodutor de celulase disponível para o domínio público com títulos de proteína extracelular que chegam a 30 g/L no substrato indutor de celulase lactose .

No início, entretanto, outras aplicações comerciais para celulases foram desenvolvidas, pois ficou claro que a sacarificação eficiente e completa da biomassa lignocelulósica para açúcares fermentáveis requer muito mais atividades enzimáticas do que inicialmente previsto. Mais uma vez, as pesquisas envolvendo T. reesei continuaram a abrir novos caminhos na enzimologia tanto da degradação da celulose como da hemicelulose e ainda hoje o fazem. A microscopia de força atômica de alta velocidade agora também visualizou a degradação da celulose demonstrando como a maior parte da celobiohidrolase CBH1/CEL7A desliza unidirecionalmente ao longo da superfície da celulose. No início dos anos 90, técnicas de transformação que facilitam a engenharia genética de T. reesei tinham se tornado disponíveis . Durante a próxima década, essas tecnologias foram fundamentais para obter novos conhecimentos sobre a regulação de suas enzimas e para alterar o perfil enzimático secretado pelo fungo . Na época, T. reesei também estava entre os primeiros hospedeiros para a expressão de proteínas de mamíferos, como exemplificado pela expressão da quimosina de bezerro sob sinais de expressão cbh1 (cel7a) .

Até o final dos anos 90, Kuhls et al. descobriram que Hypocrea jecorina é de fato a forma sexual de T. reesei, razão pela qual várias publicações posteriores usaram H. jecorina como nome de espécie ao invés de T. reesei. Um estudo mais detalhado sobre o desenvolvimento sexual levou à hipótese de que a cepa QM6a é na verdade uma fêmea estéril que poderia posteriormente ser ligada a uma mutação no andaime MAP-kinase que codifica o gene ham5 .

A virada do milênio, que para a genética pode ser vista como um afastamento do estudo de genes isolados e caminhos para o estudo de genomas inteiros, viu a chegada de T. reesei na chamada Era Genômica. A primeira abordagem global para estudar a expressão do gene T. reesei em 2003 foi um estudo transcriptômico de Foreman et al. , que construíram microarrays de DNA baseados em cDNAs que correspondiam a mais de 5000 transcrições diferentes do genoma T. reesei. Cinco anos depois, o sequenciamento e análise do genoma original do T. reesei isolado QM6a lançou as bases para a aplicação em larga escala de estudos em larga escala do genoma. Nos anos seguintes, a análise genômica comparativa de várias cepas de hiper e nulprodutores de celulase levou à descoberta de potenciais fatores novos envolvidos na hiperprodução da celulase, tais como o transporte nucleocitoplasmático, o tráfico de proteína vacuolar e o turnover do mRNA. Essas análises comparativas se beneficiaram do fato de que todas as cepas de T. reesei utilizadas na academia e na indústria são derivadas da cepa QM6a. Sessenta e cinco anos após os estudos iniciais de Elwyn Reese sobre a degradação da celulose por T. reesei, a capacidade de produção de biocombustíveis celulósicos instalada no mundo inteiro é agora de 480,5 milhões de litros por ano (MMLY) de etanol, dos quais 380,5 MMLY (ou aproximadamente 80%) são produzidos usando formulações de enzimas T. reesei como Accellerase e Cellic (Fig. 1a). Sem dúvida, este esforço exigiu a maturação da tecnologia subjacente a vários níveis, incluindo a engenharia de processos e o pré-tratamento do substrato. Ainda assim, a produção e otimização das formulações enzimáticas para a etapa de sacarificação da biomassa foi e continua sendo um dos fatores-chave que determinam o desempenho do custo dos processos de etanol celulósico. Além disso, a produção de enzimas utilizando T. reesei não está de forma alguma limitada à produção de enzimas de biorefinaria. De fato, aproximadamente 11% de todas as formulações técnicas de enzimas registradas pela Associação de Fabricantes e Formuladores de Produtos Enzimáticos são produzidas utilizando o T. reesei como hospedeiro da expressão (Fig. 1b, c). Por último mas não menos importante, o T. reesei ainda mantém sua importância na pesquisa, exemplificada por mais de 100 artigos de pesquisa que tratam do fungo ou de suas enzimas publicados a cada ano (Fig. 1d).

A mistura de enzimas da biomassa T. reesei: novos insights e limitações

Na natureza a desconstrução da lignocelulose raramente é realizada por um único organismo. Ela é conseguida através da ordem sequencial e do esforço coletivo de vários organismos que produzem múltiplas enzimas carboidratos-ativas (CAZymes) para degradar os diferentes polímeros. Portanto, não é surpreendente que a mistura de celulase secretada de T. reesei tenha tido que ser significativamente adaptada para fornecer formulação enzimática de custo competitivo para a sacarificação completa da lignocelulose. Desde cedo os pesquisadores perceberam que as formulações de T. reesei não tinham atividade suficiente no β-glucosidase porque a maior parte da atividade está ligada à parede celular fúngica. Consequentemente, o aumento da atividade da β-glucosidase melhorou a degradação da celulose porque contraria a inibição do produto através da celobiose, que, por sua vez, é liberada pela ação cooperativa de endoglucanases e celobiohidrolases . Este mecanismo de feedback, de outra forma, retarda seriamente a sacarificação da celulose. Da mesma forma, os xilo e mano-oligossacarídeos derivados de hemicelulose inibem as celobiohidrolases de T. reesei, o que indica fortemente que são necessárias atividades suficientes de β-xilosidase e β-mannosidase para degradar a lignocelulose de forma eficiente. Em 2003, Foreman et al. descreveram duas proteínas que são co-induzidas com as principais celulases e nomearam-nas proteínas induzidas pela celulose 1 e 2 (CIP1 e CIP2). Desde então, elas se mostraram importantes para degradar a lignocelulose de forma eficiente. Resultados recentes mostram que a CIP1 tem semelhanças estruturais com as lignoceluloses, embora não tenha sido possível demonstrar a atividade da lignase, e que a CIP2 é uma glucuronoylesterase da família CE15. Outra importante proteína secretada é a SWO1, que contém um módulo de ligação de carboidratos (CBM) ligado a um domínio tipo expansina . Apesar da atividade de desorganização da celulose, a SWO1 melhora sinergicamente a endoxilanase em vez da endoglucanase ou atividade da celobiohidrolase durante a hidrólise enzimática do fogão de milho pré-tratado . Um modo de ação proposto é que torna a porção xilana da lignocelulose mais acessível para degradação por xilanases e, assim, promove indiretamente a ação das celulases. Provavelmente a maior revolução dos últimos anos na degradação da celulose foi a descoberta do polissacarídeo lítico monooxigenases (LPMO). Estas enzimas introduziram um novo mecanismo oxidativo na degradação dos polissacarídeos. Na degradação da celulose assume-se que as LPMO actuam na superfície das fibrilas de celulose cristalina, tornando-as assim mais acessíveis às celulases. Intrigantemente, estas enzimas podem derivar os elétrons necessários para este processo a partir da lignina da parede celular da planta através da transferência de elétrons de longo alcance, tornando assim os mecanismos de defesa da planta contra ela. Alternativamente, as oxidoreductases de GMC ou desidrogenases de celobiose podem funcionar como doadores de elétrons . Esta descoberta poderia muito bem explicar como T. reesei alimenta suas LPMOs, pois foi previamente demonstrado que várias dessas oxidoreductases GMC são de fato induzidas pela palha de trigo . No entanto, este mecanismo oxidante não se limita, de forma alguma, à despolimerização da celulose. Originalmente demonstrado para a quitina , LPMOs também desempenham um papel na degradação da xiloglucan e amilose . No banco de dados CAZy, as enzimas pertencentes a este grupo foram reclassificadas para “atividades auxiliares” (AA), em oposição à sua classificação anterior como hidrolases glicosídicas (por exemplo, GH61) e são encontradas nas famílias AA 9-11 e 13 . Como descrito anteriormente, as atividades hemicelulolíticas são importantes para a sacarificação completa da lignocelulose (revisado por Harris et al. ). São necessárias diferentes quantidades de atividades individuais, dependendo dos tipos de hemiceluloses presentes no substrato . Portanto, é importante notar que o repertório enzimático de T. reesei tem algumas limitações claras para certos tipos de ligações específicas da hemicelulose. Uma dessas atividades em falta é a α-xilosidase. A adição de α-xilosidase a uma formulação comercial da enzima T. reesei melhorou a liberação de xilose e glicose do fogão de milho pré-tratado . Da mesma forma, a adição de uma família GH 5 celulase com atividade contra o glucomanano e xilano melhorou significativamente a preparação da enzima T. reesei sintética. Outras atividades ausentes ou muito limitantes na mistura de T. reesei celulase incluem a endo-arabinase e várias atividades de pectinase . A complementação de misturas comerciais de celulase com estas actividades enzimáticas melhorou consequentemente a sacarificação de diferentes substratos . Outra questão ainda a ser respondida é a função in vivo da secreção de oxidases multicobre como a lacase-como oxidases codificadas no genoma T. reesei .

Melhorando T. reesei como hospedeiro de produção de proteína

Dado o fato de que as celulases e a maioria das outras enzimas degradantes da lignocelulose são coordenadas e condicionalmente expressas , sua regulação transcripcional representa um alvo lógico de engenharia para melhorar a produção de celulase pelo fungo. Um dos reguladores mestres é o fator de transcrição CRE1 do tipo C2H2, que mede a repressão da catabolita de carbono. O CRE1 desliga a transcrição de seus genes alvo quando fontes mais favoráveis de carbono, como a glicose, estão presentes. Sua truncagem é uma das principais causas para a melhoria da produção de celulase alcançada por programas de mutagênese aleatória de T. reesei QM6a levando à cepa RUT-C30, que mostra tanto um nível basal mais alto quanto um nível induzido de produção de celulase. Da mesma forma, a substituição dos motivos de ligação CRE1 na região promotora da grande celobiohidrolase cel7a por aqueles de um ativador de celulase conhecido reduz a repressão da catabolita de carbono e eleva a transcrição cel7a sob condição de ativação e repressão . Além disso, a transcrição da celulase, da xilanase e de uma série de outros genes que codificam enzimas envolvidas na degradação da lignocelulose depende estritamente do ativador transcripcional tipo Zn(II)2Cys6 XYR1 . Isto contrasta com outros fungos, incluindo o Sordariomycetes Neurospora crassa e Fusarium fujikuroi, onde o ortologue XYR1 modula exclusivamente a expressão gênica da xilanase. Uma mutação que leva a uma forma truncada de XYR1 foi encontrada para causar o fenótipo negativo da cepa QM9136 que se origina do programa de mutagênese em Natick . Assim, os mutantes sobre e hiperprodutores de celulase têm níveis elevados de mRNA para os ativadores transcripcionais xyr1 . Também foi provado que a superexpressão do XYR1 leva a uma maior expressão de celulases e elimina a sua catabolita repressão na presença de glicose . Além disso, uma mutação pontual dentro de uma suposta região reguladora de XYR1 leva a um padrão de expressão similarmente desregulado . Além de XYR1 e CRE1, três fatores de transcrição ACE1, ACE2 e ACE3 regulam a expressão da celulase e da xilanase em T. reesei . Da mesma forma que CRE1, ACE1 é um repressor de dedos de zinco C2H2 e sua eliminação melhora a produção de celulases e xilanases . ACE2 e ACE3, assim como XYR1, são ativadores de transcrição do tipo Zn(II)2Cys6 . Quando o ace2 está ausente, a transcrição de celulases e xilanases é reduzida em conformidade, embora a indução de celulase por sophorose aparentemente não seja afetada. A eliminação do ace3 elimina completamente a transcrição da celulase, mas apenas reduz a das xilanases. Embora a superexpressão da ACE2 ainda não tenha sido tentada, a superexpressão da ACE3 leva ao aumento das atividades dos dois tipos de enzimas, assim como a superexpressão de outros seis reguladores até agora não caracterizados . Estes incluem mais dois fatores de transcrição do tipo Zn(II)2Cys6, assim como duas proteínas WD40, uma proteína bromodomaína e uma acetiltransferase relacionada ao gcn5. Todos os três ativadores transcripcionais Zn(II)2Cys6 (XYR1, ACE2 e ACE3) assemelham-se à bem caracterizada proteína Gal4 de S. cerevisiae. Está bem estabelecido que Gal4 recruta o complexo Gcn5 contendo SAGA e assim promove a transcrição de seus genes alvo através da acetilação da história e formação de eucromatina. De fato, o ortologue Gcn5 de T. reesei é indispensável para a expressão da celulase e envolvido na acetilação das histonas no promotor do cbh1. Nos últimos anos, surgiu uma imagem que mostra que a transcrição de celulases e CAZymes relacionadas em fungos é governada por uma combinação de muitos fatores de transcrição representando uma complexa rede transcrição-regulatória influenciada por ativadores e repressores contra-atuantes. Em Penicillium oxalicum, por exemplo, vinte fatores de transcrição modulam a ativação ou a repressão dos genes da celulase. Entre esses ClrB foi identificado como integrador chave de todos os outros reguladores com seus genes alvo . Homólogos destes reguladores são encontrados em T. reesei, mas dada a diversidade de adaptações na regulação da parede celular das plantas, espera-se que outros e diferentes reguladores também desempenhem papéis significativos. Um outro elemento-chave na regulação da celulase é o ortologue T. reesei do enigmático Aspergillus LaeA, que está envolvido na regulação de grupos de genes de metabolitos secundários em diferentes fungos. Enquanto a eliminação desta suposta proteína metiltransferase leva a uma forte desregulação de diferentes genes da celulase e outros genes CAZyme, a sua superexpressão pode promover fortemente a sua expressão . Efeitos similares foram encontrados para a proteína LAE1 interativa VEL1 do complexo VELVET .

Maioria dos estudos acima mencionados fornecem insights fundamentais sobre a regulação da formação da celulase. Como a maioria desses estudos foram realizados tanto no T. reesei isolado QM6a original ou na cepa moderadamente superprodutiva QM9414, ainda não está claro se e em que medida esses efeitos podem ser implementados em cepas hiperprodutivas. Nessas cepas, processos como tradução, secreção e rotatividade de enzimas secretadas, ao invés de transcrição, podem limitar um aumento adicional da produção de celulase. Será interessante ver se várias das formas relatadas para melhorar a expressão gênica da celulase podem ou não ser empilhadas e como tais cepas se comportariam quando comparadas aos hiperprodutores derivados da mutagênese aleatória.

Simplesmente aumentar a transcrição do gene de interesse nem sempre leva a uma melhor formação do produto, especialmente no caso de proteínas não-fúngicas. Uma estratégia bem sucedida para contornar a baixa formação de produto é a abordagem do gene de fusão que usa além da região promotora e terminadora de um gene altamente expresso, também a proteína codificada como potencializador de expressão. Para T. reesei esta é a celobiohidrolase que codifica a cel7A que é a proteína mais fortemente expressa sob condições indutoras de celulase. Acredita-se que estas fusões de genes geralmente aumentam a estabilidade do mRNA, a importação para o ER e a passagem através do caminho secreto. Para este fim, a estrutura modular do CEL7A que consiste em um módulo catalítico, um linker e uma CBM é frequentemente explorada, substituindo assim a CBM terminal C pelo gene de interesse. Variações desta abordagem de fusão de genes estão agora disponíveis que visam a proteína para as ER para uma correcta dobragem, formação de ponte de dissulfeto e glicosilação, mas posteriormente visam a acumulação de proteína intracelular para evitar a degradação do produto desejado por proteases extracelulares. Uma dessas estratégias utiliza hidrofobinas com um sinal de retenção de ER anexado como portador. Estas proteínas de fusão se montam em estruturas semelhantes a micelas e podem ser purificadas usando um sistema aquoso bifásico à base de surfactantes. Uma outra estratégia para direccionar as proteínas para as ER utiliza o peptídeo γ-zein (ZERA) derivado da proteína de armazenamento do milho. Analogamente, estas proteínas de fusão auto-montagem formam corpos proteicos rodeados por uma membrana de ER que as protege da proteólise. O desenvolvimento de fungos como hospedeiros eficientes de produção de proteínas de mamíferos também requer a inativação das proteases frequentemente encontradas no caldo de fermentação. Num estudo sistemático foram identificadas diferentes proteases secretadas relacionadas com a degradação de biofármacos, incluindo anticorpos, interferão α 2b, e factor de crescimento semelhante à insulina, tendo sido também identificadas várias proteases inactivadas . Isto levou não só a uma redução drástica da actividade da protease, mas também a um forte aumento da estabilidade das três proteínas recombinantes, com o anticorpo a mostrar o efeito mais pronunciado. Embora a engenharia do padrão de glicosilação N para a produção de proteínas terapêuticas de alto valor tenha sido tentada anteriormente, a criação de um autêntico padrão de glicosilação humana em um hospedeiro de expressão fúngica não parece viável no momento. Portanto, é questionável se tais biofármacos serão produzidos por fábricas de células fúngicas no futuro, especialmente dado o rápido desenvolvimento de células CHO .

As hidrofobinas acima mencionadas são outro grupo de proteínas que recebeu considerável atenção devido às suas propriedades tensioactivas . Estas pequenas proteínas extracelulares auto-montam-se em camadas proteicas nas interfaces hidrofóbicas devido às suas propriedades anfifílicas e tornam as superfícies hidrofóbicas molháveis ou hidrofílicas hidrofóbicas. Têm um amplo potencial em aplicações alimentares e médicas para dispersar materiais hidrofóbicos, estabilizar espumas ou alvejar diferentes moléculas para as superfícies. As cerato-plataninas são outro grupo de pequenas proteínas secretadas, com quatro cisteinas conservadas. Ligam-se à quitina e aos oligossacarídeos N-acetilglucosamina e possuem propriedades de auto-montagem em interfaces hidrofóbicas/hidrófilas. Em contraste com as hidrofobinas, as cerato-plataninas melhoram as propriedades de polaridade/apolaridade das superfícies. Uma função de mira é também atribuída às MFCs presentes em diferentes CAZymes. Elas podem melhorar a atividade hidrolítica do domínio catalítico ao qual estão ligadas e levar a um pH e temperatura mais favoráveis . Suas propriedades de ligação de carboidratos podem ainda ser exploradas para purificação de afinidade de proteínas de fusão usando, por exemplo, colunas de celulose . A ampla gama de outras aplicações de MFC recombinante foi recentemente revista em outros lugares .

Trichoderma reesei para bioprocessamento consolidado e catálise de células inteiras

Bioprocessamento consolidado (CBP) é classicamente entendido como a integração da produção de enzimas celulolíticas, hidrólise enzimática e etapas de fermentação de um processo de produção de etanol celulósico em uma única unidade de operação. Portanto, seria desejável um organismo único com boas propriedades celulolíticas e uma via de fermentação eficiente do etanol. No entanto, a utilização de consórcios microbianos também tem recebido alguma atenção. Infelizmente, nenhum organismo que preencha ambos os requisitos está atualmente disponível (Fig. 2). Conseqüentemente, esforços para engendrar etanólogos para se tornarem celulolíticos ou organismos celulolíticos para se tornarem etanólogos têm sido empreendidos. No contexto do primeiro cenário, T. reesei tem frequentemente servido como um doador de genes CAZyme, especialmente para cel5a e cel7b codificando duas de suas endoglucanases e para suas duas celobiohidrolases cel6a e cel7a (Tabela 1). Em todos os estudos publicados a relativamente baixa capacidade secretora de S. cerevisiae limitou a conversão do substrato pela CAZymes heteróloga segregada ou ancorada em membrana. Assim, altos rendimentos de etanol com substratos celulósicos realistas exigiram a suplementação com coquetéis comerciais da enzima T. reesei. Entretanto, enquanto os esforços para melhorar a secreção e a capacidade de exibição superficial das cepas de S. cerevisiae projetadas estão agora em andamento, as cepas de exibição de celulase atualmente disponíveis já têm o potencial de levar a reduções substanciais das cargas enzimáticas necessárias para a sacarificação da biomassa. No contexto do segundo cenário, o próprio T. reesei representa um organismo alvo promissor. Mas embora este fungo tenha naturalmente a capacidade de metabolizar todos os açúcares relacionados com a biomassa e convertê-los em etanol, os rendimentos são baixos e o ácido acético é formado como um subproduto indesejável. Por outro lado, os regimes de fermentação em larga escala para T. reesei estão bem estabelecidos devido à sua ampla aplicação na produção de enzimas comerciais, e as ferramentas moleculares para a sua engenharia genética também estão muito bem desenvolvidas. Um dos grandes desafios restantes para empregar o T. reesei como um organismo CBP é que várias de suas celulases e genes glicolíticos são reprimidos por hipoxia , o que é necessário para a produção de etanol. Além disso, a repressão transcripcional das celulases na presença do etanol representa mais um desafio a ser vencido. Entretanto, a cepa hiperprodutora de celulase RUT-C30 tem maior tolerância ao etanol em comparação à cepa QM9414 da linhagem Natick , e portanto representa uma cepa de plataforma perfeita para desenvolver o T. reesei como um organismo CBP, especialmente por ser também catabolita de carbono desprendida. Além disso, na presença de uma polpa lignocelulósica, o RUT-C30 exibe uma morfologia semelhante à do pellet durante os estágios iniciais da fermentação , o que pode ser alcançado de forma independente do crescimento através da adição do surfactante Triton X-100 e, em seguida, também leva a uma maior produção de enzimas . Isto é importante porque a fraca capacidade de mistura e a baixa densidade máxima de células como consequência do crescimento filamentoso até agora dificultou o uso de T. reesei como um organismo CBP. Em termos mais gerais, o bioprocessamento consolidado também poderia ser usado para descrever outros processos integrados nos quais o substrato não é necessariamente biomassa lignocelulósica, mas outro biopolímero como a quitina ou o amido e o produto não é etanol, mas qualquer outro metabólito . Para tal, vários estudos recentes visaram a produção excessiva de diferentes metabolitos através da engenharia de T. reesei (Tabela 2). Entretanto, os rendimentos que poderiam ser alcançados estavam, na maioria dos casos, longe de serem comercializados, exigindo, portanto, uma maior otimização.