Métodos espectroscópicos
Espectroscopia de adsorvência. Para alguns ensaios enzimáticos, é possível medir o reagente ou produto directamente com base nas suas propriedades de absorção Fersht (1999). Na reação catalisada pela glucose-6-fosfato desidrogenase (EC 1.1.1.49), um produto (NADH) absorve a luz a 340 nm, tornando possível monitorar a reação seguindo o aumento da absorvância neste comprimento de onda.
Glucose 6-fosfato + NAD+ → 6-fosfogluconato + NADH + H+
Em outros casos, um reagente ou produto é medido indiretamente. Com acetilcolinesterase (EC 3.1.1.7), por exemplo, a acetilcolinesterase é usada como um substrato que libera a tiocholina na exposição à enzima. A tiocholina reage com o reagente de Ellman para produzir um produto colorido, tornando possível monitorar a reação seguindo o aumento da absorvância.
Acetiltiocholina + H2O → acetato + H+ + tiocholina
Tiocholina + reagente de Ellman → derivado colorido
Avaliações acopladas são às vezes usadas para monitorar a atividade enzimática. Neste caso, a reação enzimática de interesse é emparelhada com uma segunda reação que é acoplada para uma medição conveniente. Um exemplo disso está no ensaio para hexoquinase (EC 2.7.1.1). Neste caso, um excesso de glucose-6-fosfato desidrogenase e NAD+ é incluído na mistura do ensaio e a absorvância a 340 nm é monitorizada.
Reacção I: Glucose + ATP → glucose 6-fosfato + ADP
Reacção II: Glicose 6-fosfato + NAD+ → 6-fosfogluconato + NADH + H+
Neste exemplo, a reação I deve ser limitadora da taxa e a concentração de glicose 6-fosfato deve alcançar um estado estável após um período de defasagem. Cleland Cleland (1979) formulou um procedimento para assegurar que o ensaio acoplado está fornecendo uma medição precisa da velocidade de reacção da enzima. Se possível, é preferível monitorizar uma reacção de forma contínua. Com os ensaios descritos acima, o espectrofotômetro pode ser programado para dar uma leitura contínua em função do tempo. Nas técnicas de separação, que podem incluir o uso de radioatividade, eletroforese ou cromatografia, são empregados ensaios descontínuos ou de ponto final. Uma vez estabelecido um período de tempo linear para um ensaio, um parâmetro é medido num único ponto de tempo dentro do período de tempo linear (de preferência, um ponto de tempo próximo do meio da fase linear). A velocidade é então determinada a partir da diferença de sinal naquele ponto de tempo e no início da reação. Deve-se ter cuidado com os ensaios do ponto final, e os cursos de tempo devem ser verificados para confirmar a linearidade. Alterações nas condições de incubação, tais como temperatura, pH ou concentração do substrato, podem alterar a linearidade de um ensaio. Para ensaios enzimáticos de rotina, o recipiente de reacção contém todos os componentes excepto um, e a reacção é iniciada pela adição do componente em falta (a enzima ou um dos substratos). Os outros componentes devem ser equilibrados em termos de pH, temperatura e força iónica. A reacção é normalmente iniciada pela adição de um pequeno volume de uma solução de reserva concentrada do componente em falta. Um pequeno volume assegura que esta adição não perturba as condições de equilíbrio já estabelecidas. Quando não é possível adicionar um pequeno componente, os componentes separados devem estar à mesma temperatura, força iónica e p H. Embora deva haver uma mistura completa dos dois componentes, devem ser evitadas agitações vigorosas, pois podem desnaturar a proteína enzimática. A mistura pode ser feita através da inversão de um tubo com uma rolha acoplada, ou uma cubeta usando um selo Parafilm. As proteínas diluídas são frequentemente menos estáveis que as mais concentradas, e os ensaios são frequentemente realizados na presença de uma proteína inerte, como a albumina de soro bovino (0,25 mg/ml), para estabilizar a enzima purificada. As experiências devem ser realizadas para garantir que a proteína é inerte. Como a albumina, por exemplo, pode ligar-se a substratos hidrofóbicos, pode nem sempre ser apropriada para este fim. Para ensaios descontínuos, o temporizador pode ser ajustado e as amostras aspiradas em intervalos de tempo específicos após a mistura. Para a maioria dos espectrofotômetros, a detecção é iniciada manualmente usando um painel de instrumentos ou um teclado de computador. Para adicionar um componente a uma cuvete, são necessários cerca de 20 segundos para colocar a cuvete em um espectrofotômetro e para iniciar a detecção pressionando uma tecla de computador. Este tempo geralmente não é de grande importância porque, para a maioria das reacções, o ensaio é executado de 10 a 30 minutos. As medidas de controlo incluem um branco não contendo enzimas e um branco não contendo substratos. Estes controlos asseguram que não ocorrem reacções adventícias. A taxa de controlo (branco não enzimático) é subtraída da data gerada pelo experimental para fornecer a velocidade real da reacção enzimática. Para muitos ensaios, é necessário apagar ou parar a reação em um momento específico para evitar a produção posterior do produto. Por exemplo, as amostras podem ser colhidas em intervalos de 5 minutos durante um período de tempo pré-determinado e o produto medido por HPLC.
Cada análise cromatográfica pode levar 30 minutos para ser concluída. Os métodos para terminar a reação geralmente envolvem a desnaturação da enzima pela adição de ácido, ou imersão em um banho de água fervente. A atividade de alguns metalloenzimas pode ser extinguida com EDTA ou outro quelante de íons metálicos. A maioria dos ensaios enzimáticos são baseados em técnicas espectroscópicas, sendo os dois mais comumente usados a absorção e a fluorescência Fersht (1999). O comprimento de onda usado para seguir a taxa de reacção deve ser aquele que produz a maior diferença na absorção entre o substrato e o produto. As medidas de absorção são realizadas com um espectrofotômetro padrão com as amostras contidas em células especializadas, ou cuvetes. As cuvetes plásticas descartáveis que contêm amostras de 1 ou 3 ml estão disponíveis comercialmente. O seu uso é restrito à faixa de comprimento de onda visível (350-800 nm). Devem ser utilizadas cuvetes de quartzo (vidro e plástico absorvem a luz na faixa de UV) para medições em comprimentos de onda inferiores a 350 nm. Os comprimentos de percurso para as cuvetes são fornecidos pelo fabricante. Os comprimentos de trajeto populares são 1,00 cm, 0,40 cm e 0,20 cm. Um número crescente de ensaios é realizado com 96 placas de microtiter com fundo de plástico ou quartzo. A concentração de uma substância que absorve luz em comprimentos de onda específicos pode ser determinada pela lei da cerveja:
A = εcl,
onde A é a absorvância da amostra em um comprimento de onda especificado, c é a concentração da amostra, l é o comprimento do caminho, e ε é o coeficiente de extinção, ou absorvância molar. ε tem as unidades de M-1 cm-1 ou mM-1 cm-1. Se o valor de ε for conhecido para uma determinada substância, é possível calcular a concentração dessa substância em uma solução medindo a sua absorção nessa solução. Usando a lei da cerveja, é possível calcular a taxa de alteração da concentração durante o curso de uma reacção. Um erro potencial usando medições de absorção resulta de um desvio da lei de Cerveja, porque ela se mantém apenas para uma faixa finita de valores de absorção. Assim, como pode não ser aplicável com absorvências superiores a 1, os ensaios devem ser concebidos para manter valores experimentais inferiores a este valor. Pode ser possível contornar alguns destes problemas utilizando cuvetes com comprimentos de caminho mais curtos. Uma amostra com uma absorvância de 1,00 em uma célula de 1,00 cm de percurso terá uma absorvância de 0,20 em uma célula de 0,20 cm de percurso. Em geral, trabalhar com uma absorvância de cerca de 0,5 representa um compromisso entre minimizar o ruído óptico inerente a um espectrofotómetro e ter um sinal razoável para medir. A turbidez de uma solução pode espalhar a luz e produzir uma absorvância aparente. A filtração ou centrifugação pode ser usada para remover estas partículas. Embora alterações no comprimento do trajeto contornem alguns desvios da linearidade (isto é, quando a absorvância é tão alta que o espectrofotômetro não pode fazer uma medição precisa), freqüentemente os desvios são devidos a interações intermoleculares entre as espécies absorventes. A dimerização (ou formação de eximers de ordem superior) ocorre em concentrações mais elevadas das espécies absorventes. Nesses casos, a lei da cerveja será obedecida se a concentração do produto for diminuída. Isto pode ser conseguido ou diminuindo a reacção (diminuindo a concentração enzimática) ou fazendo medições num período de tempo mais curto (antes de serem encontrados desvios da lei da cerveja).