A medicina laboratorial tem feito avanços significativos nas últimas duas décadas. Os ensaios de carga viral evoluíram de ensaios de PCR aninhados para amplificação mediada por transcrição para PCR em tempo real e continuam a evoluir com métodos como a PCR digital. Este avanço resultou em ensaios de carga viral mais sensíveis com uma gama dinâmica mais ampla, o que permite aos médicos uma melhor compreensão da resposta de um paciente à terapia e à progressão da doença.
Um exemplo de melhoria no tratamento de pacientes com o avanço do diagnóstico molecular tem sido o tratamento de pacientes com HIV-1. De acordo com as diretrizes de tratamento atuais, o sucesso do tratamento é definido como concentração de RNA do HIV-1 abaixo de 75 cópias/mL.1 A definição de fracasso do tratamento varia de acordo com a orientação global, nacional e específica do país, mas geralmente é definida como concentração de RNA do HIV-1 entre 50-1000 cópias/mL.1-3
Estes cortes de tratamento estão na extremidade baixa da faixa dinâmica dos ensaios de PCR em tempo real, onde a precisão e reprodutibilidade podem ser desafiadas. Os factores que podem influenciar o desempenho do ensaio de carga viral são a plataforma automatizada, a química de extracção do ácido nucleico, a selecção e desenho do primer/probe de PCR, as condições de amplificação de PCR e a estratégia de calibração do ensaio. Aqui iremos rever diferentes abordagens de desenho e o seu potencial impacto no desempenho e resultado clínico do ensaio. (Figura 1)
Processo de extração
Um deve considerar cuidadosamente o tipo de amostra e analise ao selecionar a química de extração. Por exemplo, em casos de HIV-1, o Departamento de Saúde e Serviços Humanos (DHHS) aconselha que o RNA do HIV-1 deve ser usado como marcador de viremia do HIV-1.1
A distinção entre o RNA do HIV-1 e o DNA proviral é importante, pois este último não é um marcador de replicação viral ativa, mas sim de liberação de reservatório latente do vírus, que já foi integrado às células. Uma química de extração que purifica tanto o RNA do HIV-1 quanto o DNA proviral não forneceria ao médico uma representação precisa da verdadeira replicação viral; portanto, no caso deste vírus, apenas a química de extração que purifica especificamente o RNA do HIV-1 deve ser usada para excluir o DNA proviral da quantificação a jusante.
Alternativamente, o uso da química de extração do ácido nucleico total (TNA) para quantificação do HIV-1 poderia potencialmente levar a resultados falso-positivos ou quantificação imprecisa, o que teria efeitos adversos no manejo do paciente. A química de extração do TNA pode ser utilizada para tipos de amostras mais difíceis como urina ou fezes ou para ensaios que precisam detectar ambos os alvos de RNA/DNA.
Seleção de alvos
A extrema diversidade viral encontrada entre as cepas de HIV, HBV e HCV é de extrema preocupação para garantir que os testes de diagnóstico molecular (MDx) dêem o resultado correto independentemente da(s) cepa(s) presente(s) em uma amostra.
Para abordar esta preocupação, o desenho do ensaio ideal deve começar com a seleção do primer/alvo da sonda em uma região geneticamente conservadora onde a diversidade viral terá o menor impacto potencial. As regiões geneticamente conservadoras só podem ser determinadas através da comparação de sequências de diversas estirpes virais.
Para atender a esta necessidade, um programa de vigilância global é crítico para avaliar de forma abrangente a diversidade viral existente em circulação para cepas de HIV, HBV e HCV.4 Em um programa de vigilância, seqüências geradas a partir de cepas coletadas em regiões geograficamente diversas são usadas para determinar quais regiões do genoma viral são mais bem conservadas e passíveis de detecção através de um teste de diagnóstico molecular. Ao utilizar sequências virais circulantes para informar o desenho do ensaio, o risco de estirpes não serem detectadas por um teste é significativamente reduzido.
Concepção da sonda e condições de ciclo de PCR
Além da selecção da região alvo, a concepção da sonda e as condições de ciclo de PCR são fundamentais para assegurar uma quantificação precisa da carga viral. O desenho da sonda deve ser tolerante aos polimorfismos naturais e, por sua vez, aos potenciais desajustes que podem ocorrer dentro da região alvo em questão. Ao longo do tempo, a tecnologia da sonda evoluiu, assim como a metodologia PCR. A gama mais ampla de aplicações MDx baseadas na tecnologia PCR para além da quantificação viral requer a utilização de diferentes desenhos de sondas. Sondas de ligação de ranhuras menores são tipicamente utilizadas para genotipagem e detecção de polimorfismo de nucleotídeos simples.
Sondas TaqMan são frequentemente utilizadas em ensaios onde as regiões alvo têm um alto grau de conservação. As sondas parcialmente de fio duplo, que são melhores na tolerância de altos níveis de heterogeneidade genética, principalmente devido ao comprimento da sonda e condições de ligação, são utilizadas em áreas onde há um alto grau de heterogeneidade.5
Além do desenho da sonda, as condições de ciclo são muitas vezes objecto de optimização do desenho, de modo a atingir os requisitos de desempenho (por exemplo, tolerância de potenciais desajustes.) O ciclo de ciclo por fases é uma abordagem que incorpora ciclos a uma temperatura mais baixa para reduzir o rigor inicial, que é seguido por ciclos a altas temperaturas para preservar a especificidade. Esta abordagem mitiga o efeito adverso na quantificação da amostra por potenciais desajustes primários. No caso de ser difícil evitar o impacto significativo de polimorfismos raros, a detecção de um segundo alvo pode ser incorporada no desenho do ensaio. Quando a diversidade de sequências afecta a detecção de uma região do genoma viral, a detecção de uma segunda região assegura que será alcançado um resultado preciso. Dada a complexidade dos ensaios moleculares e o alto nível de diversidade viral, deve ser considerada uma abordagem abrangente de utilização da vigilância global e do desenho da sonda específica do alvo ao projetar os ensaios moleculares. A simples adaptação de uma estratégia, tal como o alvo duplo, pode fornecer uma falsa sensação de segurança.
Estratégia de calibração
Estratégia de calibração é um componente integral do desenho do ensaio molecular e é fundamental para assegurar a reprodutibilidade em uma ampla faixa dinâmica. A maioria das metodologias quantitativas para o gerenciamento da terapia atualmente usa uma curva de calibração externa para determinar a concentração de um analito.
Nestes ensaios, o sinal do analito numa amostra de paciente é comparado com um conjunto de amostras com uma concentração conhecida e uma regressão linear simples (y=mx+b) é usada para calcular a carga viral. Esta abordagem normalmente utiliza calibradores que são processados como amostras de pacientes durante todo o processo, permitindo a calibração tanto dos reagentes e instrumentos de extração e amplificação.
Alternativamente, calibradores que não são processados através da extração poderiam ser utilizados, no entanto, esta abordagem acarreta o risco de que a diferença na recuperação ou uma mudança na composição do reagente não seja contabilizada, levando potencialmente a diferenças na quantificação.
Uma outra estratégia menos frequentemente utilizada é um padrão quantitativo interno. Esta aplicação utiliza uma linha de regressão polinomial de 3ª ordem (y = ax3 + bx2 + cx + d) em toda a gama linear com uma diferença máxima admissível em relação à linearidade. Estudos anteriores sugeriram que a diferença permitida aceitável da linearidade para alguns dos ensaios era de ± 0,2 Log10,6 Esta diferença permitida da linearidade e a abordagem de calibração também explica o viés frequentemente observado entre metodologias, assim como uma maior imprecisão na extremidade baixa da faixa dinâmica onde decisões clínicas estão sendo tomadas com frequência.
Conclusão
Desempenho preciso e preciso do ensaio molecular é crítico para o gerenciamento adequado da terapia. Resultados imprecisos da carga viral podem levar a uma gestão inadequada e o paciente pode ser deixado em caso de falha terapêutica. Este diagnóstico errado tem implicações muito mais amplas do que o manejo de um único paciente, já que também poderia levar a um aumento na transmissão da tensão viral resistente. Do ponto de vista do gerenciamento da terapia, um vírus com mutações associadas à resistência é mais desafiador para tratar com opções terapêuticas mais restritas. Além disso, as taxas de falsos positivos podem acrescentar custos desnecessários para testes repetidos ou testes de resistência mais caros, bem como ansiedade para o paciente e para o médico.
- Guia para o Uso de Agentes Anti-retrovirais em Adultos e Adolescentes com HIV, desenvolvida pelo Departamento de Saúde e Serviços Humanos. https://aidsinfo.nih.gov/guidelines). Acesso Setembro de 2019.
- Sociedade Clínica Europeia de SIDA (EACS). EACS Guidelines Version 9.1 October 2018.
- National Department of Health, South Africa, April 2015, acessado em 2 de agosto de 2017: https://aidsfree.usaid.gov/sites/default/files/tx_south-africa_pmtct_2015.pdf.
- Brennan CA, Bodelle P, Coffey R, et al. HIV global surveillance: foundation for retroviral discovery and assay development. Journal of medical virology. 2006;78 Suppl 1:S24-29.
- Luk KC, Devare SG, Hackett JR, Jr. Sondas de DNA linear parcialmente de fio duplo: novo desenho para detecção sensível de alvos genéticos polimórficos. Journal of Virological Methods. 2007;144(1-2):1-11.
- Vermehren J, Colucci G, Gohl P, et al. Desenvolvimento de uma segunda versão do teste quantitativo do vírus Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan da hepatite C com melhor inclusividade genotípica. Journal of Clinical Microbiology. 2011;49(9):3309-3315.
Conhecimento: A autora gostaria de agradecer a Mary Rodgers e Shihai Huang por sua revisão deste artigo.