8.3 Testes químicos
Visualização dos componentes de PHGs em placas de TLC é possível através do uso de reagentes gerais para fenóis; cloreto férrico, vanilina e ácido clorídrico (dão uma gama de cores rosa com resorcinol ou derivados de cloroglucinol), ou usando testes mais específicos com 2,4-dinitrofenilidrazina (detecta aldeídos). O reagente Folin-Ciocalteu também é útil para a detecção de fenóis com núcleos de catecol ou de hiroquinona (aparecem manchas azuis imediatamente após a pulverização da placa TLC) ou para outros fenóis, que mostram manchas azuis a cinzentas quando a placa é fumigada com vapor de amoníaco. O reagente Gibbs (2% cloroquinona 2,6-dicloroquinona em clorofórmio) seguido pela fumigação da placa com 2M NH4OH dá variedade de cores (por exemplo, é capaz de distinguir ácido vanílico – cor rosa – e ácido isovanílico – azul). Os derivados de ácido cinâmico dão fluorescência azul-claro característica quando examinados sob UV (366 nm). Os isómeros Cis e trans dos ácidos cinâmicos são apresentados em placas de TLC quando o extracto é cromatografado em solventes aquosos em duas direcções (2D-TLC). Métodos espectrofotométricos para a estimativa do conteúdo fenólico são usados frequentemente, por exemplo, método com o reagente Arnow ou com o já mencionado reagente Folin-Ciocalteu .
alguns testes qualitativos indicam cumarinas em extractos de plantas, por exemplo Teste do anel de Lactone (cumarinas hidrolisadas por solução alcalina diluída de sais de ácido O-cumárico, que podem ser revertidos após acidificação ou saturação por CO2); ou teste do azo-acoplamento (a cor vermelha desenvolve-se devido à reacção com ácido sulfanílico de diazotização numa solução alcalina). As cumarinas são facilmente detectadas sob luz UV (365 nm), uma vez que dão uma fluorescência de cor característica (excepto a simples cumarina não-substituída que não tem fluorescência). São detectadas pelas suas cores azul, violeta, castanha, verde ou amarela. Uma solução de 10% de KOH em metanol ou 20% de cloreto de antimónio em clorofórmio pode intensificar a cor. As hidroxicumarinas não apresentam variações espectrais bathochromicas em solução alcalina. Na análise por HPLC com detecção de matriz de diodos vários espectros UV de cumarinas permitem a rápida identificação de compostos .
Cromonas reagem em soluções alcalinas para dar O-hydroxy-β-diketones sem regeneração de γ- anel de pirona e também compostos coloridos com ácido concentrado e álcali concentrado. Os cromones também são visíveis à luz UV (azul, amarelo, amarelo esverdeado, fluorescência castanha a 365 nm).
A presença do anel fenil activo (cromóforo) nos flavonóides torna-os fáceis de detectar à luz UV. Os seus espectros UV são particularmente informativos, fornecendo informações estruturais que podem distinguir o tipo de fenol e o padrão de oxidação. São possíveis diferentes reacções químicas através da pulverização de cromatogramas TLC; por exemplo, visualização na presença de vapor de amoníaco (calconas e auronas tornam-se laranja e vermelho, respectivamente) ou pulverização com Naturstoff Reagenz A (solução a 1% do éster de 2-aminoetanol e ácido difenilbórico) e pulverização em excesso com 5% de solução metanólica de polietilenoglicol 4000 (PEG 4000), o que aumenta a sensibilidade desta reacção. Após a derivatização, podem ser observados compostos à luz UV (fluorescência do amarelo claro para o verde). Outros testes incluem a pulverização com cloreto férrico, ácido sulfanílico diazotizado (ambos são reações para fenóis), e a reação específica; cianidina com pó de magnésio na presença de ácido clorídrico (indica presença de flavanonas e diidroflavanóis). Para a estimativa quantitativa colorimétrica dos flavonóides, utiliza-se a reacção com cloreto de alumínio (AlCl3) (absorvância medida a 425 nm). Os flavonóides dissolvidos em soluções alcalinas dão uma cor amarela intensa, que diminui após a adição de ácido. Os espectros UV dos compostos flavonóides mostram duas bandas principais (máximos de absorção): banda I em maior comprimento de onda (atribuída à parte cinamoyl da estrutura flavonóide) e banda II em menor comprimento de onda (devido à parte benzoyl). A banda I está normalmente a 304-350 nm para os flavonóides (H em C-3 no anel C), a 352-385 nm para os flavonóis (grupo OH em C-3), e a 328-357 nm para os flavonóides 3-substituídos (O-substituição em C-3). A banda II para a maioria das estruturas está em c. 250-280 nm. Um grupo adicional de fenol (-OH) no anel A causa o deslocamento bathochromic (deslocamento para comprimentos de onda mais longos) na banda II, e um grupo adicional -OH no anel B gera um efeito similar na banda I .
A maioria das antraquinonas ou seus glicosídeos formam cristais amarelos ou vermelho alaranjados e podem mostrar fluorescência dependente do pH . A principal reação de cor é o teste de Bornträger, que é realizado dissolvendo o quinona em meio aquoso alcalino. A reação de cor varia de vermelho alaranjado a violeta arroxeado (dependendo da estrutura e dos substitutos do quinone). As antraquinonas dão uma cor vermelha com esta reacção. Para as 1,8-dihidroquinonas, a reacção com acetato de magnésio também é utilizada. As antraquinonas podem ser detectadas em placas de TLC após pulverização com solução metanólica KOH a 10%. As cores originais amarelo ou amarelo marrom-amarelado mudam para vermelho, violeta, verde ou roxo. O ruibarbo em pó pode ser examinado à luz UV para detectar a presença de raponthicina (glicósido estilbenoide, que é tóxico). No ruibarbo original (Rheum palmatum) aparece uma fluorescência marrom-avermelhada, mas não são vistas manchas azuis-violetas brilhantes (como na causa do ruibarbo-rhaponticum rhaponticum).
Como foi mencionado anteriormente as saponinas são compostos ativos superficiais (modificando a tensão superficial) e têm propriedades emulsificantes. Para uma rápida verificação qualitativa se uma planta tem SPGs, um teste de espumação por agitação do material vegetal com água é comumente usado. As saponinas têm propriedades permeabilizantes das membranas. As baixas concentrações de saponinas são capazes de destruir as membranas eritrócitas (que podem precipitar o colesterol que existe nas membranas dos glóbulos vermelhos), causando hemólise do sangue in vitro. Esta capacidade tem levado à utilização generalizada da hemólise (índice hemolítico-IH) como método para determinar a actividade biológica. IH é definida como a quantidade de 2% de suspensão isotónica de sangue bovino (em mL), que sofre hemólise quando tratada com 1 g de material vegetal testado (ou extracto testado). Como referência foi utilizada uma mistura de Gypsophila paniculata saponin (IH=30.000) ou Saponin Album (Merck) (IH=15.000). Como descrito por Hostettmann e Marston, a atividade hemolítica dos saponósidos varia consideravelmente com a estrutura da parte glicosídica. As saponinas monodemosídicas (exceto acylglycosides e glicirrizina) são fortemente hemolíticas. Nenhuma reação de cor é particularmente específica para os SPGs. Entretanto, a reação de Lieberman (com anidrido acético na presença de ácido sulfúrico) está disponível, onde as cores diferem dependendo do tipo de aglycone (triterpeno-rosa a vermelho -ou esteróide-azul-verde) .
Reações químicas para identificar CRGs em material vegetal podem ser devidas aos aglycones ou aos açúcares. O teste de Liebermann e Salkoviski indica a meação esteróide, portanto não é específico para os CRGs. Os testes de Keller Kiliani e Xanthidrole, ambos indicam deoxy-sugars (digitoxose ou cymarose). A reação Kedde ou Baljet é mais específica, pois está ligada à presença do α,β- anel de lactona insaturada. A reação fluorescente dos CRGs também é possível, por exemplo, o grupo digoxina hidroxila em C-14 e C-16 elimina a água com H2SO4 com formação de duas ligações duplas adicionais. Isto resulta num sistema conjugado (com uma dupla ligação no anel de lactona) que torna a digoxina fluorescente à luz UV. A reação de Jensen (após pulverização com ácido tricloroacético em etanol) é usada para visualizar CRGs em cromatogramas TLC .
Medição direta do HCN total por hidrólise ácida de glicosídeos cianogênicos presentes nos alimentos, bem como a decomposição das cianohidrinas intermediárias ao HCN tem a vantagem de ser aplicável a todos os tipos de amostras, embora nem todo HCN potencial de glicosídeos cianogênicos esteja provavelmente disponível in vivo. A visualização da presença destes compostos nas plantas é possível em papel filtro impregnado com reagentes, tais como ácido pícrico/carbonato de sódio ou benzidina/acetato cítrico. Estes reagentes são capazes de dar reações de cor com HCN liberado a partir de tecido vegetal triturado. Um papel impregnado é colocado num tubo sobre o material vegetal triturado e deixado a incubar a 40°C durante 2 h. Uma mudança de cor de amarelo para castanho-avermelhado indica a libertação enzimática de HCN. O papel Picrate não é totalmente específico para o cianogénio (os isotiocianatos voláteis da espécie Brassica também respondem a esta reacção). Portanto, outro teste também é usado usando uma mistura (1:1) de soluções recém preparadas de 1% de 4,4-tetrametildiamina difenilamina em clorofórmio (p/v) e 1% de acetoacetato de cobre etil em clorofórmio (p/v). A reacção da cor passa de azul-esverdeado fraco para um verde brilhante. Outro método possível requer a destilação do tecido vegetal em água ácida e a titulação do HCN libertado com nitrato de prata. Métodos cromatográficos como HPLC/MS ou GC/MS de derivados trimetilsilílicos são eficazes para análise de glicosídeos cianogênicos individuais ou cianohidrinas, e fornecem caracterização química, bem como a quantificação dos compostos .
Por causa da diversidade de produtos formados em plantas a partir de glucosinolatos (dependendo da sua estrutura de aglycone) a estimativa de isotiocianatos pelo método espectrofotométrico (onde os produtos de cor 1,3-benzoditiol-2-tiones são formados por condensação de isotiocianato com 1,2-benzeno-ditiol) pode ser insuficiente para determinar o conteúdo de glucosinolatos em plantas .