Para os propósitos deste blog (mais sobre os diferentes tipos de fixadores…), vamos focar principalmente no uso de paraformaldeído/formaldeído, comumente chamado de PFA, que é o fixador mais comumente usado na citometria de fluxo. O PFA refere-se especificamente à forma sólida e polímera do formaldeído (e dissolve-se em formaldeído monomérico em solução aquosa), por isso o que normalmente é referido canonicamente como “fixação de PFA” é na verdade o uso da solução monomérica de formaldeído. Neste caso, PFA e formaldeído são sinônimos e intercambiáveis.
Uma solução que varia de 1-4% de PFA é tipicamente usada para fixação de amostras para citometria de fluxo. No caso da higienização de amostras infecciosas, concentrações tão baixas quanto 0,37% podem efetivamente desinfetar amostras de pacientes infectados pelo HIV1. A incubação por até 45-60 minutos com PFA a 1%, e 15-20 minutos com PFA a 4% (por exemplo, tampão BioLegend) é suficiente para fixar completamente as células, e as células podem ser usadas para processamento a jusante (permeabilização para alvos intracelulares) ou armazenadas para análise futura nesta fase.
Durante um procedimento de rotina de coloração de citometria de fluxo que envolve a coloração do marcador de superfície, há várias etapas onde você pode decidir fixar suas amostras – fixar após a coloração do marcador de superfície, ou fixar antes.
Em alguns casos, a decisão de quando você pode fixar é… fixa. Por exemplo, se você estiver analisando alvos de fosfo, a ligação de certos antígenos de superfície por anticorpos pode alterar as vias de sinalização intracelular logo após o contato, levando assim a um artefato em seus resultados de fosforilação. Nesse caso, você deve fixar as células antes da adição dos anticorpos de superfície (razão pela qual nosso protocolo recomendado para usar em nossa True-Phos™ Perm Buffer para analisar alvos de fosforilação intracelular é projetado para que a etapa de fixação preceda outros procedimentos). Cada um tem seus próprios benefícios e inconvenientes, mas aqui estão algumas coisas a serem observadas em cada instância.